藥食用真菌提取物抗氧化活性研究

秦銘銘， 耿 燕， 欒 雪， 曾美珍， 邵瑞華，陳和地， 齊 鵬， 史勁松， 許正宏

藥食用真菌提取物抗氧化活性研究

秦銘銘， 耿 燕*， 欒 雪， 曾美珍， 邵瑞華，陳和地， 齊 鵬， 史勁松， 許正宏

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

為了探究猴頭菌、蜜環(huán)、靈芝、蟲草頭孢和蟲草被孢等5種藥食用真菌菌粉中小分子的抗氧化能力，利用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和甲醇等4種有機(jī)溶劑按極性提取各菌粉，建立了5種利用96微孔板快速檢測物質(zhì)的抗氧化指標(biāo)的方法，并比較了不同菌粉提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，5種菌粉提取物對·O2-均有著良好的清除能力，蟲草被孢和猴頭菌提取物對DPPH·清除率比較高，在質(zhì)量濃度達(dá)到8 mg/mL時(shí)的清除率分別達(dá)到94.91%和92.26%。靈芝氯仿提取物在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，·OH清除率達(dá)到90%，接近VC的清除能力。

抗氧化活性；DPPH自由基；超氧自由基；靈芝；蟲草被孢

衰老及許多疾病，如腦缺血、心肌缺血、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、炎癥等均與氧自由基有著密切關(guān)系[1-2]，可被自由基清除劑等抗氧化物質(zhì)所改善，因此抗氧化物質(zhì)一直備受關(guān)注，其中包括藥食用真菌來源的天然抗氧化化合物[3-4]。

我國具有豐富的藥食用真菌資源，并且分布廣泛，種類繁多，其中大多數(shù)對人體健康有一定的改善調(diào)節(jié)作用。靈芝，作為一種營養(yǎng)和保健價(jià)值較高的大型擔(dān)子菌，可顯著減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量，增強(qiáng)抗氧化酶如超氧化歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）以及其它抗氧化酶的活性。靈芝在多種不同動(dòng)物和細(xì)胞模型中表現(xiàn)出抗氧化清除自由基功能，表明其可能對于免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、保肝、抗衰老等方面均有一定的功效[5]。靈芝菌粉在因攝入乙醇而造成的小鼠抗氧化系統(tǒng)紊亂的動(dòng)物模型中，有效抵抗了脂質(zhì)過氧化，減少了MDA的生成，從而對乙醇性肝損傷有一定的保護(hù)作用[6]。研究表明，猴頭菌提取物是一種良好的生物活性物質(zhì)，可有效提高小白鼠大腦和肝臟中的SOD[7]；猴頭菌子實(shí)體也具有清除自由基的功能，其醇提物顯示出良好的總還原能力與DPPH·清除能力，且水提物具有很好的清除DPPH·、·OH和·O2-活性[8]。蜜環(huán)是我國一種珍貴的藥食用真菌，經(jīng)常食用可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗衰老、增強(qiáng)耐缺氧能力等作用[9]。實(shí)驗(yàn)證明，蜜環(huán)菌的醇提物對DPPH·、·OH和·O2-這3種自由基都表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，且清除效率與濃度成正相關(guān)[10]。動(dòng)脈粥樣硬化兔喂食蟲草頭孢之后，其機(jī)體SOD和GSH-Px活力增強(qiáng)，說明蟲草頭孢具有增加機(jī)體抗氧化功能的作用[11]。此外，蟲草被孢的熱水和乙醇提取物也均具有一定的抗氧化活性[12]。綜上可知，蟲草被孢、猴頭菌、蜜環(huán)、靈芝、蟲草頭孢這5種藥食用真菌均有一定程度的抗氧化能力，但對其有效抗氧化組分還不是很清晰，有待于進(jìn)一步的研究。

作者利用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和甲醇根據(jù)極性從小到大分步對猴頭菌、蜜環(huán)、靈芝、蟲草頭孢和蟲草被孢等5種藥食用真菌菌粉進(jìn)行提取，得到了20個(gè)提取組分，建立了5種利用96微孔板檢測物質(zhì)的抗氧化指標(biāo)的方法，并分別評價(jià)并比較了這20種提取物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 猴頭菌菌粉、蜜環(huán)菌粉、蟲草頭孢菌粉、蟲草被孢菌粉、靈芝菌粉:購自江蘇省神華藥業(yè)公司，4℃保存。DPPH標(biāo)準(zhǔn)品、氯化硝基四氮唑、還原性煙酰胺腺嘌呤二核、吩嗪硫酸二甲酯:購自Sigma公司；其余藥品均購自國藥。

1.1.2 儀器 EL204電子天平：博特勒托利多公司產(chǎn)品；MD酶標(biāo)儀：美國MD公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)：美國Labconco公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋：上海精鴻實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 物質(zhì)提取 稱取一定量的猴頭菌菌粉，按照固液質(zhì)量體積比1 g∶5 mL加入正己烷，室溫下攪拌提取12 h后過濾，濾液濃縮凍干即為猴頭菌菌粉正己烷提取物，向?yàn)V渣中繼續(xù)以同樣固液質(zhì)量體積比加入氯仿，提取，過濾，重復(fù)上述方法，依次得到猴頭菌菌粉氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和甲醇提取物。采用同樣的方法對靈芝、蜜環(huán)、蟲草頭孢和蟲草被孢進(jìn)行各個(gè)有效組分的提取，最終得到的產(chǎn)物經(jīng)過濃縮凍干后保存于-20℃[13]。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定 將50 μL不同待測樣品與150 μL DPPH溶液分別加入孔板中，搖勻，室溫靜置20 min后于517 nm處測定吸光度（分別以不同體積分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)液與95%甲醇溶液調(diào)零）[12]。

清除率=（1-（A1-A2）/A0）×100%

A0為50 μL蒸餾水+150 μL DPPH溶液的吸光值；A1為50 μL樣品溶液+150 μL DPPH溶液的吸光值；A2為50 μL樣品溶液+150 μL蒸餾水的吸光值。以樣品含量和清除率分別為橫縱坐標(biāo)，作圖。

1.2.3 總還原能力測定 在1.5 mL ep管中分別加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液250 μL和不同濃度的待測樣品溶液100 μL，加入250 μL 1 g/dL鐵氰化鉀，混合均勻后于50℃反應(yīng)20 min。取出后加入250 μL 10 g/dL三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000 r/ min離心10 min。取上清液100 μL，加入100 μL蒸餾水和20 μL 0.1 g/dL FeCl3溶液，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測吸光值。VC作為陽性對照[14]。

1.2.4 羥基自由基清除能力測定 向50 μL不同待測樣品中加入50 μL 9 mmol/L FeSO4和50 μL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液于孔板中。然后加50 μL 8.8 mmol/L H2O2溶液，在510 nm下測定各濃度的吸光度。以50 μL蒸餾水代替H2O2溶液測定所得吸光值作為樣品的本底吸收值[15]。按下式計(jì)算·OH清除率：

·OH清除率=（1-（A1-A2）/A0）×100%

式中，A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品溶液后的吸光度；A2為顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度。

1.2.5 超氧自由基清除能力測定 （PMS-NADHNBT法） 向90 μL不同待測樣品溶液中加入30 μL 468 μmol/L還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷（NADH）和30 μL 300 μmol/L氯化硝基四氮唑（NBT），然后加入30 μL 60 μmol/L吩嗪硫酸二甲酯（PMS），25℃水浴5 min，于560 nm處讀取吸光值（以上試劑均溶解于pH為8.0的16 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中），結(jié)果按以下公式進(jìn)行計(jì)算[16]。

清除率=（1-A1/A0）×100%

式中，A0為空白值 （緩沖液代替樣品）；A1為樣品吸光值。

1.2.6 超氧自由基清除能力測定 （鄰苯三酚法）

采用鄰苯三酚自氧化法測定，具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均是3次測定的平均值，用Mean±SD（標(biāo)準(zhǔn)偏差）來表示Graph Pad。Prism 5.0分析軟件用于作圖和方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 清除DPPH·活性

各提取物對DPPH·均有良好的清除效果，且基本表現(xiàn)量效正相關(guān)，結(jié)果見圖1。總體看來，對于清除DPPH·，各個(gè)物質(zhì)的甲醇提取組分和氯仿提取物組分有比較好的清除活性，其中蟲草被孢的甲醇提取物和猴頭菌的氯仿提取物在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，其清除率分別達(dá)到94.91%和92.26%，表現(xiàn)出較高的抗氧化能力；頭孢氯仿提取物在質(zhì)量濃度達(dá)到8 mg/mL時(shí)，其清除率也達(dá)到了81.32%，而蜜環(huán)和靈芝氯仿提取物的清除率則也在最高質(zhì)量濃度時(shí)達(dá)到60%~70%，具有比較強(qiáng)的抗氧化活性。但各個(gè)物質(zhì)的正己烷提取物的清除DPPH·能力相對較差，且清除效果隨著濃度增大變化不大。

2.2 總還原能力

如圖2所示，相比較之下，5種菌粉中蟲草被孢氯仿提取物總還原能力較強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為8 mg/ mL時(shí)，與VC標(biāo)準(zhǔn)品相比，相當(dāng)于其在相同濃度下活性的50%。其各個(gè)有機(jī)試劑提取物的總還原能力依次為氯仿>乙酸乙酯>甲醇>正己烷。

圖1 各提取物對DPPH·的清除效果Fig.1 Scavenging activity to DPPH·of extracts

圖2 各提取物的總還原能力Fig.2 Total reducing power of extracts

圖3 各提取物對·OH的清除效果Fig.3 Scavenging activity to hydroxyl radical of extracts

2.3 對·OH的清除效果

如圖3所示，猴頭菌對·OH活性的清除作用并不顯著，而蟲草被孢、靈芝、蜜環(huán)和蟲草頭孢均表現(xiàn)出一定的清除能力。其中靈芝提取物對·OH的清除能力最強(qiáng)，靈芝氯仿提取物在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到90%，接近于VC的清除能力。

2.4 超氧自由基清除能力（PMS-NADH-NBT法）

如圖4所示，各個(gè)物質(zhì)的提取物在清除超氧自由基水平上均有著良好的能力，均表現(xiàn)出比較好的清除效果，且清除能力呈劑量正相關(guān)。其中蟲草頭孢的乙酸乙酯提取物，其超氧自由基清除能力在質(zhì)量濃度達(dá)到8 mg/mL時(shí)，與VC的清除能力不相上下。而蟲草被孢乙酸乙酯提取物、猴頭菌氯仿提取物、蜜環(huán)乙酸乙酯和氯仿提取物、靈芝乙酸乙酯提取物均在8 mg/mL時(shí)達(dá)到了80%~90%的超氧自由基清除能力。

圖4 各提取物對超氧自由基的清除效果Fig.4 Scavenging activity to superoxide radical of extracts

圖5 各提取物對·O2-的清除效果Fig.5 Scavenging activity to·O2-of extracts

2.5 超氧自由基清除能力（鄰苯三酚法）

如圖5所示，蟲草被孢的各提取物在清除·O2-方面具有比較好的活性，且不同有機(jī)試劑提取物的抗氧化活性大小依次為甲醇>氯仿>乙酸乙酯>正己烷。蜜環(huán)和蟲草頭孢的氯仿提取物的清除·O2-能力其次。

3 結(jié)語

研究指出，自由基和活性氧是細(xì)胞癌變的原始引發(fā)機(jī)制，自由基是機(jī)體的正常代謝產(chǎn)物，在平衡狀態(tài)下發(fā)揮重要作用，如抑制腫瘤、消炎和抗菌等；一旦平衡被打破，如機(jī)體受到疾病或某些外源性藥物和毒物的侵害，自由基便會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的傷害作用，造成生物膜損傷，引起蛋白質(zhì)、酶等的氧化破壞，從而影響免疫系統(tǒng)和內(nèi)臟器官的形態(tài)功能，引發(fā)機(jī)體疾病，甚至死亡[18]。很多疾病的發(fā)生都與自由基有關(guān)，如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化癥、老年癡呆癥、帕金森綜合癥等，因此抗自由基藥物，特別是對機(jī)體副作用小的藥物的開發(fā)刻不容緩。

作者建立了5種用96微孔板檢測各個(gè)物質(zhì)的抗氧化指標(biāo)效的方法，分別評價(jià)了猴頭菌、蜜環(huán)、靈芝、蟲草頭孢和蟲草被孢的正己烷、氯仿、乙酸乙酯和甲醇提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，相同組分對于不同的自由基所表現(xiàn)出的抗氧化能力不盡一致，如蟲草被孢甲醇提取物對DPPH及·O2-有較好的清除效果，但對于·OH的清除效果則不足20%。此外，對于同一個(gè)自由基，同種物質(zhì)的不同組分之間也存在著比較大的抗氧化能力差異?？傮w看來，每種有機(jī)試劑萃取組分都有一定的抗氧化活性，但相較之下發(fā)現(xiàn)，甲醇和氯仿萃取的組分表現(xiàn)出相對較高的抗自由基能力，尤其是蟲草被孢甲醇提取物和猴頭菌氯仿提取物，在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，對DPPH·清除率超過了92%，靈芝的氯仿提取物在該作用濃度時(shí)對·OH的清除效果也達(dá)到了90%的清除效果。而各藥食用真菌的正己烷組分對各個(gè)自由基的清除能力則處于較弱水平?？偟膩碚f，極性較小的有機(jī)試劑萃取組分抗氧活性較低，而其余極性較大的有機(jī)試劑萃取組分對某種自由基或幾種自由基表現(xiàn)出較好的清除能力，可能是不同極性有機(jī)溶劑萃取組分差異所致。

藥食用真菌的抗氧化活性研究一直是人們探究機(jī)體氧化抗氧化平衡的研究熱點(diǎn)，不少研究都表明其含有比較好的抗氧化功能[7]，作者利用極性不同的有機(jī)試劑對其進(jìn)行提取，所得提取物也表現(xiàn)出比較良好的抗氧化活性，可能是有機(jī)試劑本身具有極性，所以根據(jù)相似相溶所得到的不同提取物中也含有相應(yīng)的極性小分子物質(zhì)，由于小分子物質(zhì)在機(jī)體中易于被吸收，生物利用度比較高，所以這些含有抗氧化因子的活性組分值得被進(jìn)一步的研究與利用。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以對這些有效活性組分的提取物進(jìn)行深一步的開發(fā)，從而為抗氧化藥物的研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Antioxidant Activity of Mycelial Extracts From Medicinal Mushrooms

QIN Mingming， GENG Yan*， LUAN Xue， ZENG Meizhen， SHAO Ruihua，CHEN Hedi， QI Peng， SHI Jinsong， XU Zhenghong
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The antioxidant activity of mycelial extracts from medicinal mushrooms was investigated. They were from Cephalosporium sinensis，Cordyceps mortierella，Hericium erinaceum，Ganoderma lucidum and Armillaria mellea using N-hexane，chloroform，ethyl acetate and methanol，respectively. The detection of antioxidant activity was established by five methods by microtiter plates with 96 wells.Their antioxidant activities were then compared and assessed.The results showed that all the extracts could effectively scavenge·O2-.Extracts from C.mortierella and H.erinaceum had strong scavenging activity to DPPH·，showing up to 94.91%and 92.26%at 8 mg/mL，respectively.The scavenging activity to·OH of extract from G.lucidum by chloroform was up to 90%at 8 mg/mL，which was comparable to that of Vc.It was demonstrated that the antioxidant activity of these extracts from mushrooms was different from each other.More study will carry out to discuss the small active compounds with antioxidant activity in extracts.

antioxidant activity，DPPH·，·O2-，Ganoderma lucidum，Cordyceps mortierella

TS 255

A

1673—1689（2017）01—0080—07

2015-03-26

江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金-前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目（BY2012052）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練立項(xiàng)項(xiàng)目 （201310295020）。

*通信作者：耿 燕（1984—），女，江蘇無錫人，理學(xué)博士，副教授，主要從事天然藥物篩選及分子機(jī)制研究。E-mail：gengyanjnu@163.com

秦銘銘，耿 燕，欒 雪，等.藥食用真菌提取物抗氧化活性研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（01）：80-86.