杏鮑菇多糖的超濾分離及其理化特性和生物活性分析

薛令坤， 張勁松， 唐慶九， 劉艷芳*，周 帥，楊 焱， 張 忠， 吳 迪

杏鮑菇多糖的超濾分離及其理化特性和生物活性分析

薛令坤1，2， 張勁松1， 唐慶九1， 劉艷芳*1，周 帥1，楊 焱1， 張 忠1， 吳 迪1

（1.國家食用菌工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室/上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學食品學院，上海201306）

采用超濾法將杏鮑菇下腳料水提物分為不同相對分子質(zhì)量范圍3個部分，并對各部分樣品的得率、總糖和β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)、相對分子質(zhì)量分布、單糖組成及其對巨噬細胞釋放NO的影響進行了考察。結(jié)果表明，PU1得率遠高于PU10和PU100，為14.6%，其總糖質(zhì)量分數(shù)最高，達到62.75%。PU10和PU100中的β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)較高，分別為18.38%和19.91%，在總糖中所占比例超過50%。相對分子質(zhì)量分析結(jié)果表明，粗多糖可以按照超濾膜的截留范圍實現(xiàn)較好的分離，且PU100和PU10均含有多個組分，其中PU100中重均相對分子質(zhì)量>100 000組分約占73%，PU10中兩個組分的相對分子質(zhì)量均超過10 000；而PU1主要含有一個組分，其重均相對分子質(zhì)量為1 110×103。超濾各部分樣品中的多糖分別由4~7種單糖組成，但種類及摩爾分數(shù)具有較大差異?；钚詼y試結(jié)果顯示，超濾所得各樣品均具有體外刺激巨噬細胞釋放NO的活性，在低質(zhì)量濃度（50 μg/mL）時PU100活性最高。

杏鮑菇下腳料；超濾；相對分子質(zhì)量分布；單糖組成；巨噬細胞

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），俗稱刺芹側(cè)耳等，具有菌肉肥厚、質(zhì)地脆嫩、口感極佳的特點，同時，杏鮑菇還具有多種藥用功效，是一種集食用和食療于一體的大型食用真菌[1]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明杏鮑菇多糖是其主要活性成分之一，在抗血栓、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤和抗輻射方面都具有顯著的效果[2-4]。杏鮑菇下腳料是菇腳、菇片、菌柄基部等加工副產(chǎn)物，主要做為飼料或肥料使用，利用率不高。經(jīng)研究表明，杏鮑菇下腳料營養(yǎng)成分與其子實體類似[5]，含有豐富的多糖，因此利用下腳料來提取多糖，不僅可以降低成本，提高產(chǎn)品附加值，還可以節(jié)約資源，促進杏鮑菇產(chǎn)業(yè)多元化良性發(fā)展。

據(jù)報道，多糖的生物活性與多種因素有關(guān)，包括多糖的結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量、溶解度等，因此，提取純化技術(shù)的不同，會對多糖組分的生物活性產(chǎn)生影響[6]。目前，對杏鮑菇多糖的提取多采用傳統(tǒng)水提醇沉工藝，該工序繁雜、能耗高且多糖得率低，不太利于工業(yè)化應(yīng)用。而超濾是一種新型膜分離技術(shù)，利用不同的孔徑截留不同分子量物質(zhì)，具有常溫操作、無相態(tài)變化，可以防止雜菌污染和熱敏性物質(zhì)失活等特點[7]，近年來越來越多地被用于真菌多糖的提取、分離和純化[8-9]。作者采用3種不同截留相對分子質(zhì)量的超濾膜對杏鮑菇下腳料粗多糖提取液進行分離，并對各部分樣品進行分析，比較其生物活性，為杏鮑菇多糖的進一步研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇下腳料：上海國森生物科技有限公司提供，經(jīng)低溫烘干后置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、 胰酶：Gibco公司產(chǎn)品； 細菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）：Sigma公司產(chǎn)品；三氟乙酸 （TFA）：Merck公司產(chǎn)品；RAW 264.7細胞株：購自中科院細胞所。

1.2 儀器

超濾設(shè)備為納濾超濾反滲透一體機 （BH-UFNF-RO-3-2012）：上海貝鴻生物科技有限公司產(chǎn)品，截留相對分子質(zhì)量100 000、10 000和1 000的卷式超濾膜（型號PSI1）：安得膜分離技術(shù)工程有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機：Thermo Savant公司產(chǎn)品；Synergy HT多功能酶標儀：Bio-Tek公司產(chǎn)品；CyberScan CON500臺式電導儀：Eutech公司產(chǎn)品；ICS-2500型高效離子色譜儀：Dionex公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱：Thermo Forma公司產(chǎn)品；細胞計數(shù)儀：Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光散色儀-示差折光檢測儀聯(lián)用分析法 （HPSEC-MALLS-RI System）：由Waters2695型高效液相色譜儀，氦－氖激光光源的八角度激光光散射檢測器（MALLS，Wyatt公司）和Waters 2414示差檢測器（RI）組成。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取 取杏鮑菇下腳料碎塊1 000 g于蒸餾水 （料液質(zhì)量體積比為1 g∶12 mL）中浸泡40 min，沸水提取2 h，提取液過濾，濾液10 000 r/min離心15 min，殘渣重復(fù)上述操作再提取一次，合并兩次上清液，得杏鮑菇下腳料水溶性粗多糖提取液。

1.3.2 超濾工藝流程

串聯(lián)使用截留相對分子質(zhì)量分別為100 000、10 000和1 000的3個超濾膜組件，將杏鮑菇粗多糖提取液在室溫、壓力0.2~0.3 MPa條件下依次同時進行連續(xù)超濾處理，超濾時間3.5 h，期間加約3倍體積蒸餾水稀釋>100 000截留液 （截留液1），直到透過液3電導值小于80 μs，超濾結(jié)束，得到相對分子質(zhì)量段分別為>100 000（命名為PU100，下同）、10 000~100 000（PU10）、1 000~10 000（PU1）3部分截留液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得粗多糖干品。

1.3.3 超濾各部分粗多糖得率及粗多糖中總糖和β-葡聚糖含量測定 稱取粗多糖干品，加蒸餾水充分溶解，離心，采用苯酚-硫酸法測定總糖質(zhì)量分數(shù)[10]。

粗多糖得率（%）=粗多糖質(zhì)量（g）/稱取樣品質(zhì)量（g）×100%

多糖中β-葡聚糖含量測定，參照Megazyme公司的酵母和蘑菇β-葡聚糖檢測試劑盒中的方法對粗多糖中β-葡聚糖含量進行測定。

1.3.4 粗多糖分子量分布比較分析 采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光檢測儀聯(lián)用分析技術(shù)（HPSEC-MALLS-RI）對杏鮑菇粗多糖的相對分子質(zhì)量分布進行分析。稱取5 mg粗多糖樣品，加入1 mL流動相充分溶解，離心，上清液用0.25 μm的水相微孔膜過濾后取100 μL進樣分析。具體色譜條件為：以TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm，TOSOH公司產(chǎn)品）為分析柱，以0.15 mol/L NaNO3和 0.05 mol/L NaH2PO4（pH=7，質(zhì)量分數(shù)0.02%疊氮鈉）為流動相，在35℃條件下，以0.5 mL/min流量進行洗脫分析。其中8角度激光光散射儀的光源波長選用623.8 nm，多糖在溶液中的折光指數(shù)增量按照0.146 mL/g計算。使用 Astra（version 6.1.1）數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進行采集和分析，計算相對分子質(zhì)量。

1.3.5 粗多糖的單糖組成分析 分別稱取2 mg粗多糖加入帶蓋玻璃瓶，加入3 mL 2 mol/L的三氟乙酸（TFA），110℃油浴2 h，冷卻至室溫，50℃氮吹儀吹干，再加3 mL甲醇并吹干，重復(fù)加甲醇2~3次至TFA完全除去，用超純水沖洗玻璃瓶并將酸解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容。

色譜條件：參考文獻[11]測定超濾各部分多糖PU100、PU10、PU1的單糖組成。

1.3.6 粗多糖對RAW264.7細胞釋放NO量的影響稱取粗多糖5 mg加入滅菌的離心管中，用無菌的PBS配制成5 mg/mL的溶液，充分溶解，15 000 r/min離心30 min，無菌條件下將上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌eppendorf管中，然后取一定量稀釋成2 mg/mL，0.5 mg/mL的質(zhì)量濃度，并以10 μg/mL LPS為陽性對照，以PBS為陰性對照，按文獻[12]的方法測定巨噬細胞釋放NO的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾各部分得率及其總糖和β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)比較

由表1可知，杏鮑菇下腳料水提物經(jīng)超濾分離后，粗多糖的總得率（PU100、PU10、PU1得率之和）為20.29%，其中PU1得率最高，為14.6%，占總得率的71.96%，PU10得率次之，PU100最低，僅為2.7%，說明杏鮑菇下腳料中相對分子質(zhì)量小于10 000部分占較大比重，而相對分子質(zhì)量大于100 000部分所占比重最小。糖質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果表明，PU1總糖質(zhì)量分數(shù)最高，為62.75%，而PU100和PU10中β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)較高，分別為19.91%和18.38%，在總糖中所占的比例均超過50%，說明杏鮑菇下腳料中的β-葡聚糖主要富集在相對分子質(zhì)量較大的粗多糖部分。

表1 超濾所得粗多糖得率及總糖和β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)分析Table 1 Yield，total sugar and β-glucan content of crude polysaccharides obtained by ultrafiltration

2.2 粗多糖的相對分子質(zhì)量分布特征分析

超濾所得杏鮑菇各部分粗多糖的相對分子質(zhì)量分布如圖1和表2所示。PU100主要包含3個組分，其中組分1（Peak1）和組分2（Peak2）重均相對分子質(zhì)量分別為7.188×106和1.565×105，均超過1× 105，兩者質(zhì)量分數(shù)占總組分的73%，但兩組分的多分散系數(shù)較大，表明組分1和組分2的相對分子質(zhì)量分布較寬；PU10含有兩個組分，其中組分 2（Peak2）重均相對分子質(zhì)量為1.807×104，在10 000~ 100 000范圍內(nèi)，約占總組分的81.6%；而PU1只有一個組分，其重均相對分子質(zhì)量為1.414×103，屬于1 000~10 000的范圍。此結(jié)果表明，超濾法可以按照超濾膜的截留相對分子質(zhì)量范圍對粗多糖進行有效分離。

圖1 超濾各部分粗多糖的高效液相圖譜Fig.1 HPSEC chromatograms of crude polysaccharides obtained by ultrafiltration

表2 超濾各部分粗多糖的相對分子質(zhì)量分布范圍Table 2 Molecular weight distributions of crude polysaccharides obtained by ultrafiltration

2.3 超濾各部分粗多糖的單糖組成

超濾不同部分杏鮑菇下腳料粗多糖經(jīng)高效陰離子色譜（HPAEC）檢測后所得單糖組成及摩爾百分比結(jié)果如圖2和表3所示。不同相對分子質(zhì)量段多糖的單糖組成種類及組成摩爾百分比差異性較大。PU100主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖4種單糖組成，且葡萄糖所占摩爾分數(shù)最高，為71.12%。PU10包含的單糖種類最多，其中半乳糖和甘露糖摩爾分數(shù)較高。而PU1所含單糖種類最少，基本由葡萄糖組成，僅含少量巖藻糖、阿拉伯糖和半乳糖。

2.4 超濾各部分對體外刺激巨噬細胞釋放NO產(chǎn)量的影響

圖2 超濾各部分粗多糖的單糖組成Fig.2 Monosaccharide compositions of crude polysaccharides obtained by ultrafiltration

真菌多糖的活性依賴于一定的相對分子質(zhì)量，一般認為多糖相對分子質(zhì)量大于一定的范圍才表現(xiàn)出較好的生物學活性[13]。由圖3可以看出超濾所得3部分粗多糖均具有體外刺激巨噬細胞釋放NO的活性。低質(zhì)量濃度時（50 μg/mL）3者活性具有較大差異，PU100活性最高，PU10和PU1活性較弱；而在中等質(zhì)量濃度（200 μg/mL）和高質(zhì)量濃度（500 μg/mL）時，3種粗多糖活性均較好。

表3 超濾各部分粗多糖的單糖組成摩爾分數(shù)Table 3 Molar ratio of monosaccharide in crude polysaccharides obtained by ultrafiltration %

圖3 超濾各部分多糖對體外刺激巨噬細胞釋放NO產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of crude polysaccharides obtained by ultrafiltration on NO release from RAW264.7 cells

3 結(jié)語

真菌多糖的生物活性與其一結(jié)結(jié)構(gòu)和高級構(gòu)象密切相關(guān)，多糖分子在溶液中的鏈構(gòu)象又受其分子質(zhì)量的影響，一般具有100 000~200 000的高分子組分呈現(xiàn)較強的活性[14-15]，如楊陽等[6]測得灰樹花子實體多糖的活性部位主要位于100 000~1 000 000范圍之間。因此將多糖按相對分子質(zhì)量分段并研究各個相對分子質(zhì)量段多糖的特性及藥理活性是非常有意義的。杏鮑菇下腳料多糖提取液經(jīng)過超濾后，可以將粗多糖按照超濾膜的截留相對分子質(zhì)量范圍實現(xiàn)較好的分離，表現(xiàn)為相對分子質(zhì)量大于100 000組分主要位于PU100部分，相對分子質(zhì)量為10 000~100 000組分主要位于PU10部分，PU1部分粗多糖相對分子質(zhì)量均小于10 000。同時HPSEC測定結(jié)果也顯示3部分粗多糖不能完全按照截留相對分子質(zhì)量范圍分離，存在部分重合，尤其是PU100和PU10部分，可能原因是多糖分子鏈間的相互作用或者超濾不徹底，因而其超濾工藝需要進一步研究。

超濾所得3部分粗多糖在得率、糖含量、多糖相對分子質(zhì)量、單糖組成及其刺激巨噬細胞活性方面存在差異。其中PU100（>100 000）部分得率最低，但粗多糖的β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)最高，為19.91%，且PU100在低質(zhì)量濃度（50 μg/mL）時刺激巨噬細胞活性明顯高于PU10和PU1，這也說明杏鮑菇多糖中大相對分子質(zhì)量的部分活性較好。PU1部分得率最高，是PU100和PU10得率之和的2.56倍，說明杏鮑菇下腳料中小相對分子質(zhì)量組分占較大比重。PU1單糖組成主要由葡萄糖組成，其摩爾分數(shù)為95.75%，進一步對PU1進行了分析，發(fā)現(xiàn)其中富含海藻糖，可能是導致其單糖組成葡萄糖摩爾分數(shù)高的原因，因而可以考慮將超濾技術(shù)作為海藻糖提取工藝的手段。

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會議消息

Physicochemical Analysis and Bioactivity Investigation of Polysaccharides Separated from Pleurotus eryngii by Ultrafiltration

XUE Lingkun1，2， ZHANG Jingsong1， TANG Qingjiu1， LIU Yanfang*1，ZHOU Shuai1， YANG Yan1， ZHANG Zhong1， WU Di1
（1.National Engineering Research Center of Edible Fungi/Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization （South），Ministry of Agriculture/Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；2.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Three different molecular weight fractions，i.e.，100 kD（PU100），10 kD-100 kD（PU10）and 1～10 kD（PU1），were separated from the extracts of Pleurotus eryngii leftover in hot water（100℃）by membrane ultrafiltration.The physicochemical characteristics of fractions in the extracts were characterized including the product yield，the content of total sugar and β-glucan，the distribution ofmolecular weight，the composition of monosaccharide and its effects on the NO release from macrophages.PU1 showed the highest yield of 14.6%，which was much higher than that of either PU10 or PU100.The β-glucan （over 50%of β-glucan）contents of PU10 and PU100 were 18.38% and 19.91%，respectively.The crude polysaccharide could be efficiently separated by ultrafiltration membrane within the range of molecular weight as HPSEC analysis suggested.There were several fractions in both PU100 and PU10.Around 73%of PU100 was the polysaccharides with molecular weight＞100 kD，while the molecular weights of two components in PU10 were larger than 10 kD and the main component in PU1 was 1.11 kD.Monosaccharide composition analysis indicated 4 and 7 monosaccharides composed the polysaccharides in different fractions with significant differences in types and molar ratios of monosaccharide.The activity of stimulating RAW264.7 macrophages to release nitric oxide （NO）was observed for all of the ultrafiltration fractions，among which PU100 represented the highest activity at low concentration（50 μg/mL）.

Pleurotus eryngii leftover，ultrafiltration，the molecular weight distribution，monosaccharide composition analysis，macrophages-activation activity

Q 539

A

1673—1689（2017）01—0074—06

2015-03-27

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303080）。

*通信作者：劉艷芳（1980—），女，山東曲阜人，副研究員，主要從事食藥用菌深加工研究。E-mail：aliu-1980@163.com

薛令坤，張勁松，唐慶九，等.杏鮑菇多糖的超濾分離及其理化特性和生物活性分析[J].食品與生物技術(shù)學報，2017，36（01）：74-79.