應(yīng)用多重PCR技術(shù)快速篩查食品中的轉(zhuǎn)基因成分

董立明， 邢珍娟， 李蔥蔥， 夏 蔚， 閆 偉， 李飛武

應(yīng)用多重PCR技術(shù)快速篩查食品中的轉(zhuǎn)基因成分

董立明， 邢珍娟， 李蔥蔥， 夏 蔚， 閆 偉， 李飛武*

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130033）

以轉(zhuǎn)基因植物中常見的3種篩選調(diào)控元件、2種標(biāo)記基因和1種目的基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，建立了能在一次PCR擴(kuò)增中同時(shí)檢測(cè)6種轉(zhuǎn)基因成分的多重PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，當(dāng)多重PCR體系中CaMV35S啟動(dòng)子、FaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的檢測(cè)引物濃度分別為0.2、0.2、0.3、0.3、0.2、0.2 μmol/L，退火溫度為60℃時(shí)擴(kuò)增效果最佳，利用優(yōu)化后的六重PCR方法可從轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜等各類樣品中精準(zhǔn)檢測(cè)出相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因成分，方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.1%。該方法為食品中常見轉(zhuǎn)基因成分的篩查提供了一種高效的手段，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)工作中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

轉(zhuǎn)基因生物；調(diào)控元件；標(biāo)記基因；目的基因；多重PCR；篩查

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的推廣應(yīng)用速度不斷加快，轉(zhuǎn)基因植物的品種日益豐富，1994~2014年間，全球65個(gè)國(guó)家和地區(qū)共批準(zhǔn)了27種轉(zhuǎn)基因作物的357個(gè)轉(zhuǎn)化體的商業(yè)化應(yīng)用，僅2014年全球就種植了1.81億公頃轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜等作物，越來越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)入人們的生活

[1]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一項(xiàng)新興技術(shù)，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、能源、環(huán)保、材料等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮了非常重要的作用，但其打破物種基因隔離的優(yōu)勢(shì)也令公眾對(duì)其產(chǎn)品的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑[2]，為此世界許多國(guó)家和地區(qū)相繼建立了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度，農(nóng)產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分已納入國(guó)內(nèi)外檢疫檢驗(yàn)部門的檢驗(yàn)項(xiàng)目[3]。

日益增加的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類給轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求，精準(zhǔn)、快速、高通量成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)[4-5]。在經(jīng)典的檢測(cè)技術(shù)中，PCR因其高特異性和高靈敏度一直是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法研究的首選，以PCR技術(shù)為核心研制更快速、更高效的檢測(cè)方法是本領(lǐng)域近年來的研究熱點(diǎn)，將多對(duì)引物加入一個(gè)PCR反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)在單個(gè)反應(yīng)管中一次性檢測(cè)多種轉(zhuǎn)基因成分的多重PCR方法已有諸多報(bào)道，Guo Jin-chao等利用簡(jiǎn)并引物結(jié)合多重PCR建立了8種抗蟲和耐除草劑基因的四重PCR方法[6]，李飛武等建立了能同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物中的8種常見Bt基因的多重PCR方法[7]，魏霜等建立了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中Cry1Ab基因、Gus基因、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子等轉(zhuǎn)基因成分的七重PCR方法[8]。

在未知產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中，一般是先選擇最具代表性的少數(shù)幾個(gè)轉(zhuǎn)基因篩選元件進(jìn)行篩查，若確認(rèn)含有某種轉(zhuǎn)基因成分后，再進(jìn)行進(jìn)一步的身份鑒定[9]。因此，作者選擇轉(zhuǎn)基因植物中常見的6種轉(zhuǎn)基因成分 （CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、CP4-EPSPS基因、NPTII基因）為檢測(cè)靶標(biāo)，通過多重PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化、反應(yīng)程序優(yōu)化、特異性檢測(cè)、靈敏度測(cè)試等試驗(yàn)，建立了能同時(shí)檢測(cè)上述6種轉(zhuǎn)基因成分的六重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因玉米Bt11（ERM-BF412f）、Bt176（ERMBF411f）、MON810（ERM-BF413gk）、MON863（ERMBF416d）、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2（ERM-BF410gk）等5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：購(gòu)自歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所；轉(zhuǎn)基因玉米MON89034（AOCS 0906-E）、轉(zhuǎn)基因大豆MON89788（AOCS 0906-B）、A2704-12（AOCS 0707-B6）、轉(zhuǎn)基因棉花LLCOTTON25（AOCS 0306-E2）、MON531 （AOCS 0804-C）、MON1445（AOCS 0804-B）、MON15985（AOCS 0804-D）、轉(zhuǎn)基因油菜GT73（AOCS 0304-B）等8種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：購(gòu)自美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)；非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜樣品：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存樣品。每種樣品中含有的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)靶標(biāo)信息詳見表1。

除了表1所列的試驗(yàn)材料，作者還制備了一份含有全部6種檢測(cè)靶標(biāo)的陽(yáng)性對(duì)照樣品，包含轉(zhuǎn)基因玉米MON863、轉(zhuǎn)基因大豆MON89788和轉(zhuǎn)基因棉花LLCOTTON25等3個(gè)轉(zhuǎn)化體，每個(gè)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，以非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜的等量混合物作為填充物。

表1 試驗(yàn)材料及含有的靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因成分信息Table 1 Description of the genetically modified components in the test materials

1.2 主要試劑和儀器

植物基因組DNA提取試劑盒：購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；多重PCR試劑盒（2×Multiplex PCR Assay Kit）、HS-Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；GeneFinder核酸染料、瓊脂糖等購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；檢測(cè)引物委托上海生工生物公司進(jìn)行合成和純化。

紫外/可見光分光光度計(jì) （ND1000）：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；梯度PCR儀（C1000）、凝膠成像系統(tǒng) （GelDOC XR+）：美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)（5424）：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品基因組DNA提取 按照DNA提取試劑盒的說明書提取全部試驗(yàn)材料的基因組DNA，用紫外/可見光分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量和濃度，用滅菌超純水將樣品DNA稀釋至25 ng/uL，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與篩選 通過查閱國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)、論文、標(biāo)準(zhǔn)等文獻(xiàn)，并結(jié)合多重PCR檢測(cè)引物設(shè)計(jì)與篩選的一般原則，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)和分析確定6個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)的特異性PCR引物，引物信息詳見表2。所有引物用滅菌超純水稀釋至10 μmol/L備用。

表2 檢測(cè)引物信息Table 2 Information of the primers in this study

1.3.3 PCR擴(kuò)增體系及程序 單一PCR檢測(cè)，總反應(yīng)體系為25μL，包括：2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL dNTPs混合物 （10 mmol/L），0.5 μL正向引物（10 μmol/L），0.5 μL反向引物 （10 μmol/L），0.125 μL HS-Taq DNA聚合酶（5 U/μL），2 μL DNA樣品（25 ng/uL），17.375 μL滅菌超純水。

六重PCR檢測(cè)，總反應(yīng)體系為50 μL，包括：25 μL 2×Multiplex PCR Assay Kit（含緩沖液、dNTPs、Mg2+等），14 μL引物預(yù)混液 （CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的正反向引物各1 μL，NOS終止子、bar基因的正反引物各1.5 μL），4 μL DNA樣品，7 μL滅菌超純水。

單一和六重PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

PCR結(jié)束后，取7.5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)引物適用性測(cè)試

作者選擇的6種檢測(cè)靶標(biāo)的單一PCR方法均已建立了相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但由于擴(kuò)增產(chǎn)物大小集中于180~333 bp，將這些方法的引物直接應(yīng)用到多重PCR體系中難以區(qū)分每一種靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因成分。為此，在系統(tǒng)分析各個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)的序列信息及現(xiàn)有方法基礎(chǔ)上，針對(duì)FMV35S啟動(dòng)子和NPTII基因重新設(shè)計(jì)了PCR檢測(cè)引物，并對(duì)新設(shè)計(jì)的這2對(duì)PCR引物的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。驗(yàn)證樣品包括陽(yáng)性對(duì)照樣品和轉(zhuǎn)基因玉米 Bt176、MON810、MON863、MON89034、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、 轉(zhuǎn) 基 因 棉 花 MON531、MON1445、MON15985、LLCOTTON25、轉(zhuǎn)基因油菜GT73、非轉(zhuǎn)基因植物混合物等13種植物樣品。結(jié)果顯示，利用設(shè)計(jì)的FMV35S啟動(dòng)子引物能夠從陽(yáng)性對(duì)照樣品、MON89034玉米、MON89788大豆、MON1445棉花和GT73油菜樣品中擴(kuò)增出401 bp的特異性片段，利用 NPTII基因引物則能從陽(yáng)性對(duì)照樣品、MON863玉米、MON531棉花、MON1445棉花和MON15985棉花樣品中獲得499 bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，均與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1和表1）。由此確定了6個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)的擴(kuò)增引物，不同擴(kuò)增產(chǎn)物之間至少相差60 bp，從理論上確保多重PCR產(chǎn)物可通過3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行區(qū)分。

圖1 FMV35S啟動(dòng)子和NPTII基因檢測(cè)引物的特異性測(cè)試Fig.1 Specificity of the primers for FMV35S promoter and NPTII gene

為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的6對(duì)檢測(cè)引物（表2）在單一PCR和多重PCR中的適用性，以非轉(zhuǎn)基因植物混合物的DNA樣品為稀釋劑，將陽(yáng)性對(duì)照樣品DNA溶液稀釋至每個(gè)轉(zhuǎn)化體組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，進(jìn)行單一PCR和多重PCR測(cè)試。結(jié)果如圖2所示，以6對(duì)引物分別進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增時(shí)，均能從陽(yáng)性對(duì)照樣品中特異性地?cái)U(kuò)增出對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因成分，而將6對(duì)引物放在同一PCR管中進(jìn)行六重PCR擴(kuò)增時(shí)，可從陽(yáng)性對(duì)照樣品中擴(kuò)增到6種預(yù)期的轉(zhuǎn)基因成分，且在電泳圖譜中能夠清晰識(shí)別出每一種檢測(cè)靶標(biāo)的特異性條帶，表明這6對(duì)引物適用于構(gòu)建多重PCR檢測(cè)體系。

圖2 引物適用性測(cè)試Fig.2 Applicability of the primers forsingletand multiplex PCR assays

2.2 六重PCR的擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序優(yōu)化

由于每種轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率和退火溫度不盡相同，為保證每對(duì)引物在多重PCR體系中均能正常工作，盡可能降低引物間的交互抑制，并確保建立的多重PCR方法滿足一定的檢測(cè)靈敏度，需對(duì)每種檢測(cè)靶標(biāo)的引物用量和退火溫度進(jìn)行梯度測(cè)試[12]。為此，將陽(yáng)性對(duì)照樣品DNA用非轉(zhuǎn)基因植物混合物的DNA稀釋成每個(gè)轉(zhuǎn)化體組分分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%和 0.1%的測(cè)試樣品，設(shè)置CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的引物終濃度比為0.2∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2、0.2∶0.2∶0.25∶0.25∶0.2∶0.2、0.2∶0.2∶0.3∶0.3∶0.2∶0.2等3種組合，退火溫度為58、60、62℃等3個(gè)梯度。結(jié)果顯示，當(dāng)引物濃度比為0.2∶0.2∶0.3∶0.3∶0.2∶0.2，退火溫度為60℃時(shí)，6個(gè)基因都能得到很好的擴(kuò)增，且電泳條帶清晰可辨，優(yōu)于其他組合（圖3），由此確定了如1.3.3所述的六重PCR的最適反應(yīng)體系和程序，用于進(jìn)一步的測(cè)試。

2.3 六重PCR方法的特異性測(cè)試

用非轉(zhuǎn)基因植物混合物的DNA樣品作為稀釋劑，分別將13種轉(zhuǎn)基因植物的DNA樣品稀釋至轉(zhuǎn)化體質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%。以稀釋后的DNA樣品作為模板，用優(yōu)化后的六重PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，應(yīng)用六重PCR方法能夠從13種測(cè)試樣品中獲得1~5條特異性擴(kuò)增產(chǎn)物片段（見圖4），且與表1所列的預(yù)期結(jié)果完全一致，未出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性情況，表明建立的六重PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜等不同類型的樣品均具有很好的特異性，具有廣泛的適用性。

圖3 多重PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction system and program for the multiplex PCR assay

圖4 多重PCR方法的特異性測(cè)試Fig.4 Specificity of the multiplex PCR assay

2.4 六重PCR方法的靈敏度測(cè)試

用緩沖液對(duì)陽(yáng)性對(duì)照樣品的DNA進(jìn)行梯度稀釋，獲得每個(gè)轉(zhuǎn)化體組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%的6個(gè)梯度的DNA樣品，用優(yōu)化后的六重PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序?qū)ι鲜鯠NA測(cè)試樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。測(cè)試結(jié)果如圖5所示，應(yīng)用本研究建立的六重PCR方法能夠從質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.1%的陽(yáng)性對(duì)照樣品中清晰檢測(cè)到全部6種轉(zhuǎn)基因成分，表明本方法的檢出限為0.1%，能夠滿足現(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測(cè)的需求。

圖5 多重PCR方法的靈敏度測(cè)試Fig.5 Sensitivity of the multiplex PCR assay

3 結(jié)語

應(yīng)用多重PCR技術(shù)，以目前商品化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因作物中最具代表性的CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、CP4-EPSPS基因和NPTII基因等6種轉(zhuǎn)基因成分為研究對(duì)象，通過特異性引物設(shè)計(jì)與篩選、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序優(yōu)化等步驟，建立了能同時(shí)檢測(cè)上述6種轉(zhuǎn)基因成分的六重PCR方法。特異性和靈敏度測(cè)試結(jié)果表明，本研究建立的六重PCR方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜等不同類型樣品中的預(yù)期轉(zhuǎn)基因成分，方法檢出限為0.1%，非常適用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中對(duì)未知樣品的初步篩選。

[1]CLIVE JAMES.Global status of commercialized biotech/GM crops：2014[R].Ithaca，NY：ISAAA，2014.

[2]MATIN Qaim，SHAHZAD Kouser.Genetically modified crops and food security[J].PLoS One，20138（6）：e64879.

[3]LING Xingyuan，ZHANG Guiming，PAN Guang，et al.Event-specific detection of imported GM corn[J].Plant Quarantine，2011，25（5）：40-44.

[4]SHAO Ning，JIANG Shimeng，ZHANG Miao，et al.MACRO：A combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms[J].Analytical Chemistry，2014，86（2）：1269-1276.

[5]CHEN Zhaobo.Molecular detection of the quality and safety of agricultural produces：advances and trends[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（4）：444-450.

[6]GUO Jinchao，CHEN Lili，LIU Xin，et al.A multiplex degenerate PCR analytical approach targeting to eight genes for screening GMOs[J].Food Chemistry，2012，132（3）：1566-1573.

[7]LI Feiwu，YAN Wei，LONG Likun，et al.Screening detection of Bt genes in genetically modified crops using a multiplex PCR assay[J].Modern Food Science&Technology，2014，30（5）：262-266.

[8]WEI Shuang，CHEN Zhen，LU Chunbin，et al.Multiplex PCR detection of transgenic components of genetically modified rice[J]. Food Science，2012，33（12）：159-162.

[9]ZHANG Dabing，GUO Jinchao.The development and standardization of testing approaches for genetically modified organisms and their derived products[J].Chinese Bulletin of Life Sciences，2011，23（2）：195-204.

[10]GUO Longhua，YANG Huanghao，QIU Bin，et al.Capillary eletrophoresis with electrochemiluminescent detection for highly sensitive assay of genetically modified organisms[J].Analytical Chemistry，2009，81（23）：9578-9584.

[11]XU Wentao，ZHAI Zhifang，HUANG Kunlun，et al.A novel universal primer-multiplex-PCR method with sequencing gel electrophoresis analysis[J].PLoS One，2012，7（1）：e22900.q

科技信息

A Multiplex PCR Assay for the Rapid Screening of Genetically Modified Components in Food

DONG Liming， XING Zhenjuan， LI Congcong， XIA Wei， YAN Wei， LI Feiwu*
（Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China）

Based on the DNA sequences of CaMV35S promoter，F(xiàn)aMV35S promoter，NOS terminator，bar gene，NPTII gene and CP4-EPSPS gene，a multiplex PCR assay for simultaneously screening the above six exogenous elements widely introduced into genetically modified organisms was established.The result showed that the highly efficient multiplex PCR system was obtained when the final primer concentrations were 0.2，0.2，0.3，0.3，0.2 and 0.2 μmol/L separately for them. The method could allow an accurate detection of six target elements from genetically modified maize，soybean，cotton and rapeseed，with the limit of detection of 0.1%.In conclusion，this multiplex PCR assay provides a highly effective approach to the screening of common transgenic components in foods and has high application value in the GMO detection.

genetically modified organisms，regulatory element，marker gene，target gene，multiplex PCR，screening

TS 207.3

A

1673—1689（2017）01—0056—06

2015-03-17

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)課題（2014ZX08012-001）；吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2013-2016）。

董立明（1980—），男，吉林九臺(tái)人，農(nóng)學(xué)碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全研究。E-mail：dlm_510@sina.com

*通信作者：李飛武（1982—），男，湖北江陵人，農(nóng)學(xué)碩士，副研究員，主要從事農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全研究。E-mail：lifeiwu3394@sina.com

董立明，邢珍娟，李蔥蔥，等.應(yīng)用多重PCR技術(shù)快速篩查食品中的轉(zhuǎn)基因成分[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（01）：56-61.