朱砂腎臟毒性的分解研究

史 立，孫 友，李 佳，李丹陽，趙躍剛

（長春中醫(yī)藥大學藥學院， 長春 130117）

朱砂腎臟毒性的分解研究

史 立，孫 友，李 佳，李丹陽，趙躍剛*

（長春中醫(yī)藥大學藥學院， 長春 130117）

目的 研究朱砂中與血液中汞離子濃度以及腎臟毒性相關的成分，為朱砂的減毒炮制以及在臨床上的科學用藥提供重要的理論依據(jù)。方法 應用偏微分原理，運用化學、毒理學、藥動學以及細胞學的研究方法，對朱砂中與其毒性相關的成分進行均一背景下的分解研究，從中找出與朱砂腎臟毒性相關的主要成分。結(jié)果 整體實驗研究表明，朱砂中共存成分改變了汞在血液以及體液中的化學位，從而改變離子通道的通透性，有利于汞離子通過離子通道而被吸收以及在腎臟中分布；朱砂中的腎臟毒性成分并非僅來源于硫化汞或汞本身，其他共存成分對朱砂毒性的影響也是不可忽視。結(jié)論 改進朱砂的炮制方法，在朱砂的炮制過程中，盡量除去硝酸根、氯離子、鎂離子等不必要的共存離子，減小水飛朱砂的毒性，可提高臨床用藥的安全性和制劑的安全性。

朱砂；腎臟毒性；汞離子；炮制方法

Abstract:?Objective To study some components relative to the concentration of mercury in plasma and the toxicity associated with cinnabar, and provide important evidence for the safety and reasonable application of cinnabar in clinical medicine and scientific preparation.Methods On the basis of partial differential principle, doing research on the components concerned to cinnabar toxicity respectively and equally by the methods of chemistry,toxicology, pharmacokinetics and cytology for finding components corresponding to cinnabar toxicity.Results The overall experimental results show that some coexisting ingredients of cinnabar may cause the changes of the chemical potential of mercury in plasma, as well as body fluid, and the permeability of the ion channel, which is conducive to gastrointestinal absorption and transportation to kidney of mercury ions.Experiments on cells indicate that almost all its components of cinnabar contribute to its toxicity.Conclusion In order to reduce the toxicity of water-handled cinnabar and make it safer, both in clinical treatment and industrial products, cinnabar processing methods should be improved by removing nitrate, chloride, magnesium ions unnecessary coexisting ions .

Keywords:?cinnabar; nephrotoxicity; mercury ion; processing method

朱砂以其確切的療效而使其藥用價值位居礦物藥之首，然而其被人們逐漸認知的毒性備受科學界乃至全社會的關注[1]。朱砂中含有幾十種元素，而且基本都以無機形式存在，每種元素在體內(nèi)的吸收、分布與排泄過程都涉及微孔途徑的被動轉(zhuǎn)運[2]，每種成分都和朱砂的毒性有一定的關系[3-9]。為了探究朱砂腎臟毒性的機理，筆者首先對朱砂的毒性進行了分解研究，并將血液和腎臟同時作為研究對象，采用藥物動力學以及病理學方法，對朱砂的腎臟中毒機理進行了初步的分解研究。

1 材料與方法

1.1 材料 AFS-930 原子熒光分光光度計（北京吉天儀器有限公司），SANYO二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），SANYO 超低溫冰柜（日本SANYO公司），Themo生物安全柜，BIO-RAD酶標儀(美國伯樂公司），Mettler Toledo AL204電子分析天平（萬分之一），TD 40臺式低速離心機（4 000 r/min）（湖南凱達科學儀器有限公司），YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌器，可調(diào)微量移液器 （上海亞榮生化儀器廠），水飛朱砂（河北凱達藥業(yè)有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物有限公司），DMEM干粉培養(yǎng)基（GIBCO）、胰蛋白酶（北京鼎國昌盛有限責任公司）等。

1.2 方法

1.2.1 給藥供試品的制備 將1.0 g水飛朱砂置于冰水浴中，使之在40 kHz頻率超聲波作用下溶出，于不同時間點取樣，用原子熒光分光光度法分析游離金屬汞的總含量。依據(jù)研究結(jié)果和汞在胃腸道的吸收機理以及在體內(nèi)的表觀分布容積，確定朱砂及其他藥物動力學研究灌胃給藥供試品的制備方法。朱砂、HgS平行定量實驗組、HgCl2平行定量實驗組供試品的游離汞含量均為8.561 μg/mL；HgCl2高劑量實驗組供試品的游離汞含量均為171.22 μg/mL。

1.2.2 標準曲線的測繪 選擇優(yōu)級純的HgCl2為標準品，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液為溶劑，配制HgCl2儲備液（1.0 mg/mL）,備用。分別定量移取儲備液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL至10 mL的容量瓶中，各定量加入家兔血漿500 μL，并用作為溶劑的0.1%的K2Cr2O7的 10%的 HNO3溶液定容至刻度，得25、50、100、150、200、250 ng/mL的標準溶液，與原子熒光光度計上測定其吸光度，線性回歸，得標準曲線方程Y=3.502 X-0.921(r2=0.998 8)。

1.2.3 血漿供試品制備 按照預先設定的時間點從實驗家兔耳緣靜脈采血1.0 mL，置入肝素化試管中，精密加入50 μL35%的HClO4,渦旋振蕩1 min，于4 000 r/min離心10 min。精密量取上清液300 μL，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液定容至10 mL，測定其吸光度。

1.3.4 組織供試品制備 對稱取實驗家兔耳腎臟區(qū)2.0 g，制成組織勻漿，于4 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL，精密加入50 μL 35%的HClO4,渦旋振蕩1 min，于4 000 r/min離心10 min。精密量取上清液300 μL，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液定容至10 mL，測定其吸光度。

2 結(jié)果

2.1 單劑量給藥動力學研究 分組：將30只家兔隨機分為5組，第1組為陰性對照組，第2組為朱砂實驗組，第3組為HgS實驗組，第4組和第5組為平行量的HgCl2實驗組和高劑量的HgCl2實驗組。給藥：第2組灌胃給2 mL供試品；第3組灌胃給HgS平行定量供試品溶液2 mL；第4組灌胃給HgCl2平行定量供試品溶液2 mL，第5組灌胃給20倍標示量的HgCl2供試品2 mL。于給藥后的0.5、1.0、1.5、2.0 h取全血進行分析。結(jié)果在灌胃給藥后的0.5～2.0 h，除平行量HgCl2實驗組外，朱砂實驗組、HgS實驗組、高劑量HgCl2實驗組的Hg2+在血液中的濃度均高于陰性對照組，且隨著時間的增加而增大，差異具有統(tǒng)計學意義( P＜0.05)。而平行量HgCl2實驗組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 多劑量給藥動力學研究 分組：將30只家兔隨機分為5組，第1組為陰性對照組，第2組為朱砂實驗組，第3組為HgS實驗組，第4組和第5組為平行量的HgCl2實驗組和高劑量的HgCl2實驗組。給藥：第2組灌胃給2 mL供試品；第3組灌胃給HgS平行定量供試品溶液2 mL；第4組灌胃給HgCl2平行定量供試品溶液2 mL，第5組灌胃給20倍標示量的HgCl2供試品2 mL。均灌胃給藥1次/d，并于給藥后1.0 h取全血進行分析。結(jié)果在灌胃給藥后的10、20、40 d，朱砂實驗組、HgS實驗組、平行量HgCl2實驗組、高劑量HgCl2實驗組的Hg2+在血液中的濃度均高于陰性對照組，且隨著時間的增加而增大，其差異具有統(tǒng)計學意義( P＜0.05)。

2.3 MTT細胞增值實驗研究 本次實驗共設置5組，第1組為空白對照組：以正常增值細胞為空白對照組；第2組為朱砂實驗組：以朱砂靜止飽和溶液為供試品(Hg2+濃度為3.2 μg/mL )；第3組為靜止飽和溶液實驗組：HgS靜止飽和溶液為供試品（Hg2+濃度為5.3 μg/mL ）；第4組為高劑量氯化汞實驗組（Hg2+濃度為10.0 μg/mL ），第5組為中劑量氯化汞實驗組（Hg2+濃度為5.0 μg/mL ），第6組為中劑量氯化汞實驗組（Hg2+濃度為2.0 μg/mL ）。取同批次對數(shù)生長期HEK 293細胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。置于5% CO2，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物,每種藥物設有4個復孔，用以保證藥物反應的真實情況，置于5% CO2，37 ℃孵育24 h。取出，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，并于每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值。

結(jié)果表明，朱砂實驗組、HgS實驗組、氯化汞實驗組（高、中、低3個劑量實驗組）吸光度值均低于陰性對照組，且隨著Hg離子濃度的增大其吸光度減小，其差異具有統(tǒng)計學意義( P＜0.05)。

3 小結(jié)

本實驗結(jié)果得出，朱砂中可以讓細胞凋亡的并非是目前公認的硫化汞或汞離子，朱砂在體內(nèi)的蓄積，并以此導致的腎臟中毒問題，亦并非是硫化汞或汞離子，其中共存成分的影響是不可忽視的。本研究結(jié)果為朱砂在臨床上的安全用藥提供了重要的依據(jù)。建議改進朱砂的炮制方法，在朱砂的炮制過程中，盡量除去硝酸根、氯離子、鎂離子等不必要的共存離子，以提高臨床用藥的安全性和制劑的安全性。

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Study on the renal toxicity of some components in cinnabar by respective researches

SHI Li, SUN You, LI Jia, LI Danyang, ZHAO Yuegang*
(School of Pharmaceutical Sciences, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

R285.6

A

2095-6258(2017)05-0712-02

2017-03-01）

OI：10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.008

吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項目“朱砂中與其腎臟蓄積相關成分的量效關系研究”（2014-Q27）。

史 立（1959 -），男，實驗師，主要從事藥物分析及藥物化學研究。

*通信作者：趙躍剛，電話-13604414377，電子信箱-1006110724@qq.com