基于納米二氧化鈦的光致電化學(xué)適體傳感器

莫方靜，李孟潔，柴雅琴，袁 若

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

0 前言

光致電化學(xué)(PEC)分析方法是基于光電化學(xué)現(xiàn)象而發(fā)展起來的[1]。它的原理可以簡單表述為光電材料在接受不同波長的光照射時(shí)，電子獲得能量，受到激發(fā)，通過電子調(diào)節(jié)機(jī)理將激發(fā)態(tài)電子轉(zhuǎn)移至半導(dǎo)體電極的導(dǎo)帶或是其它具有較低能量水平的能帶上，由此產(chǎn)生光電流[2]。PEC分析方法恰恰是電化學(xué)發(fā)光(ECL)的逆過程，光被用于激發(fā)電極上的活性物質(zhì)，而各種波長的單色光很好獲得[3]。光生電流作為檢測信號(hào)，這樣比直接檢測光的強(qiáng)度更具穩(wěn)定性。PEC分析方法具有設(shè)備簡單、成本低廉、易于微型化和集成化等優(yōu)點(diǎn)。除此以外，PEC分析方法還具有令人滿意的靈敏度。很多研究者已經(jīng)開始了對(duì)PEC分析方法的研究。PEC分析方法在各個(gè)領(lǐng)域都顯示出了廣闊的應(yīng)用前景，如生物分析、醫(yī)藥行業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等[4]。

PEC分析方法運(yùn)用范圍廣泛。就生物分析來說，PEC分析方法不愧為一種新興的，有前途的方法[5]。在生物分析中，一般都運(yùn)用PEC分析方法來構(gòu)建一些高選擇性的傳感器，以此達(dá)到對(duì)目標(biāo)物檢測的目的。古麗加瑪麗.艾爾肯等[6]研究了基于分子信標(biāo)的光致電化學(xué)生物傳感方法。濟(jì)南大學(xué)的王衍虎等[5]利用PEC分析原理構(gòu)建了小型化、低成本的自供能生物傳感器，并用于分析測定。張曉茹等[7]研究得到了免標(biāo)記的光致電化學(xué)凝血酶(TB)傳感器。雖然科學(xué)家們對(duì)PEC分析方法進(jìn)行了很多研究，但PEC分析方法的機(jī)理尚不十分明確。因此，對(duì)PEC分析方法做進(jìn)一步的探究是很有必要的。

適體是一種寡核苷酸片段，它類似于抗體并同抗體一樣能結(jié)合特定的目標(biāo)分子。適體作為分子識(shí)別物質(zhì)，具有很多優(yōu)點(diǎn)，如：高特異性、高親和力、分子量小、穩(wěn)定性好、目標(biāo)分子范圍廣、可體外篩選、可化學(xué)合成等[8]。將適體與生物傳感器檢測技術(shù)結(jié)合起來，便可研制出一系列適體傳感器[9]。目前，研究者們對(duì)適體傳感器表現(xiàn)出了濃厚的興趣，研究最為普遍的有熒光適體傳感器、電化學(xué)適體傳感器等幾種。相對(duì)于傳統(tǒng)的傳感器，適體傳感器具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，比如具有高的靶向性和特異性等。適體傳感器在醫(yī)藥病理、食品藥品、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。賈飛等[10]研究了基于氧化石墨烯材料的食源性致病菌適體傳感器；郭業(yè)民等[11]研究了測定牛奶中抗生素殘留的適體傳感器；李發(fā)蘭等[12]進(jìn)行了用于檢測抗生素殘留的適體傳感器的研究。

納米材料一般是指尺寸在1～100 nm間的粒子，納米材料具有以下效應(yīng)：(a)表面效應(yīng)：納米材料直徑小，比表面積大，表面原子的活性高；(b)量子尺寸效應(yīng)：當(dāng)半導(dǎo)體納米材料的載流子在每個(gè)方向均受限時(shí)，其費(fèi)米能級(jí)附近的電子能級(jí)會(huì)由體相材料的連續(xù)能帶過渡到分立結(jié)構(gòu)的不連續(xù)的能級(jí)，在光學(xué)吸收譜上表現(xiàn)為從無結(jié)構(gòu)的寬吸收過渡到具有結(jié)構(gòu)的特征吸收；(c)小尺寸效應(yīng)：當(dāng)納米材料的尺寸大小比傳導(dǎo)電子的德布羅意波長更小或是相等時(shí)，周期性邊界將被破壞，材料的各種物化特性將被改變；(d)宏觀量子隧道效應(yīng)：量子相干器件中的電荷以及磁通量、微粒的磁化強(qiáng)度可以穿越宏觀系統(tǒng)中的能壘并產(chǎn)生變化[13]。納米材料具有以上四種特殊的效應(yīng)，因此在磁性材料、催化、電子材料、光學(xué)材料、醫(yī)藥及功能材料等方面具有廣泛應(yīng)用。

二氧化鈦，分子式TiO2，是一種常溫下不溶于水和無機(jī)酸、堿的白色粉末。二氧化鈦是一種偏酸性的兩性氧化物，其化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定，常溫下與硫化氫、二氧化硫等均不發(fā)生反應(yīng)，但二氧化鈦卻具有非常令人滿意的光電活性和光催化性能[14]。納米二氧化鈦(TiO2NPs)是指三維結(jié)構(gòu)中至少一維的尺寸在1～100 nm之間的二氧化鈦。TiO2NPs具有表面活性高、分散性好、磁性強(qiáng)、光催化活性高、光電活性優(yōu)良等特性[15]。由于具有以上優(yōu)良的性質(zhì)，TiO2NPs運(yùn)用廣泛。其中，在PEC分析方法中，TiO2NPs作為光電活性物質(zhì)，對(duì)目標(biāo)物的測定起到了重要作用。除此之外，TiO2NPs還在光催化、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、醫(yī)藥衛(wèi)生和能源領(lǐng)域都有重要應(yīng)用[16]。

凝血酶(TB)是一種絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，能促進(jìn)血液凝固，在凝血功能的調(diào)節(jié)上具有重要作用。凝血酶在癌癥的病理探究、早期預(yù)防及后期治療都有著十分重要的作用[17]。因此，設(shè)計(jì)一種準(zhǔn)確、靈敏測定凝血酶濃度的傳感器具有重大意義[18]。該論文根據(jù)PEC分析方法的原理，以準(zhǔn)確、靈敏檢測凝血酶濃度為目標(biāo)，構(gòu)建適體傳感器。將納米二氧化鈦?zhàn)鳛楣怆娀钚晕镔|(zhì)，利用其優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和光電轉(zhuǎn)換特性，得到相對(duì)較大并且穩(wěn)定的光電流信號(hào)。加之將H2O2作為電子供體，使獲得的光生電流信號(hào)具有持續(xù)性。從而保證了所構(gòu)建適體傳感器的準(zhǔn)確度和靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該適體傳感器的PEC信號(hào)響應(yīng)值與凝血酶濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，線性范圍為0.01 pmol/L～10 nmol/L，檢測限為 3.33 fmol/L。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：光致電化學(xué)分析儀(荷蘭IVIUMSTAT公司)，CHI660E型電化學(xué)工作站 (上海辰華儀器公司)，S-4800掃描電子顯微鏡 (SEM)(日本東京Hitachi公司)，F(xiàn)A-2004AFA/JA系列電子天平(Metter Toledo公司)，SB-80超聲清洗機(jī) (寧波新芝生物科技股份有限公司)，TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) (長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，移液槍(成都方舟科技開發(fā)公司)，三電極系統(tǒng)：玻碳電極(GCE，Φ＝4 mm)為工作電極、Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極為參比電極、鉑絲為對(duì)電極。

試劑：鈦酸四丁酯 (C16H36O4Ti)、無水乙醇(CH3CH2OH)、冰醋酸(CH3COOH)、鹽酸(HCl)、氯金酸(HAuCl4)、過氧化氫(H2O2)、巰基己烷(HT)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、凝血酶(TB)、100 pmol/L 的 L-半胱氨酸(L-Cys)、100 pmol/L 癌胚抗原(CEA)、100 pmol/L 甲胎蛋白(AFP)，超純水(18．2 MΩ·cm)由Millipore 水純化系統(tǒng)制備，用 0．1 mol/L Na2HPO4、0．1 mol/L KH2PO4和 0．1 mol/L KCl混合制備 0．1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7．0)，用 20 mmol/L Tris-HCl、140 mmol/L NaCl、 1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L KCl、1 mmol/L CaCl2混合配制的 Tris-HCl緩沖溶液(pH7．4)，凝血酶適體鏈(TBA)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，具體序列號(hào)如下：

TBA:5′-NH2-(CH2)6-GGT TGG TGT GGT TGG-3′

1.2 納米TiO2的制備

取25 mL鈦酸四丁酯緩慢加入到8．75 mL乙醇中，攪拌10 min后形成黃色溶液A。將1 mL冰醋酸和2．5 mL超純水加入到8．75 mL乙醇中，攪拌形成溶液B，再滴加HCl(調(diào)節(jié)至pH＜3)。將A以3 mL/min的速度滴入B中，隨即攪拌30 min，再在40℃水浴中加熱2 h，形成膠體溶液。將該膠體溶液置于60℃下干燥，即可獲得納米TiO2。再取0．2 g納米二氧化鈦(TiO2NPs)分散于10 mL水中，離心洗滌，超聲成均一的溶液。

1.3 PEC適體傳感器的構(gòu)建

文章中所設(shè)計(jì)PEC適體傳感器的構(gòu)建過程如圖 1。 首先，將玻碳電極(GCE)分別用 0．3 μm 和0．05 μm三氧化二鋁(Al2O3)粉在麂皮上反復(fù)地打磨拋光，用超純水沖洗界面，并依次用乙醇和超純水連續(xù)超聲清洗干凈。隨后，將10 μL TiO2NPs滴涂到上述玻碳電極(GCE)上，于37℃的烘箱中烘干成膜。然后將經(jīng)TiO2修飾的電極置于1%的氯金酸溶液中，于-0．2 V恒電位下電化學(xué)沉積10 s，并用超純水淌洗，隨即在該電極上滴涂15 μL TBA孵育12～16 h。用超純水淌洗，再在該電極上滴加10 μL HT，在室溫下孵育40 min以封閉其非特異性結(jié)合位點(diǎn)，并將電極用超純水淌洗。最后在電極上滴涂20 μL不同濃度的TB，常溫放置40 min。

圖1 PEC適體傳感器制備過程示意圖Fig．1 The schematic diagram of the preparation process of this PEC aptasensor

PEC 測量：在 5 mL PBS 緩沖溶液（0．1 mol/L，pH7．0）和 50 μL H2O2的混合溶液中，選擇波長為460 nm的單色光進(jìn)行PEC測量。激發(fā)光源由LED燈提供，在0．0 V電位下關(guān)-開-關(guān)10-20-10秒。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米二氧化鈦的SEM表征

制備好納米二氧化鈦后，經(jīng)透射電子顯微鏡SEM照樣(圖2)。照樣結(jié)果顯示，制得的納米二氧化鈦成圓球狀，粒徑約為300 nm，結(jié)果表明圓球狀納米二氧化鈦已被成功制備。

圖2 納米二氧化鈦的SEM表征Fig．2 SEM characterization of TiO2NPs

2.2 PEC適體傳感器制備過程的電化學(xué)表征

通過測定被修飾電極在濃度為5 mmol/L的鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安(CV)強(qiáng)度變化來表征電極的制備過程，如圖3所示。a曲線是裸電極(GCE)的CV表征曲線，它表現(xiàn)為一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰。由于二氧化鈦納米粒子的導(dǎo)電性不好，相對(duì)于裸電極來說，CV表征的信號(hào)會(huì)減弱 (b曲線)。由于金納米粒子可以促進(jìn)電子傳遞，所以當(dāng)在電極上沉積納米金后，CV表征的信號(hào)增強(qiáng)(c曲線)。但當(dāng)凝血酶適體鏈TBA修飾到電極表面上時(shí)，TBA帶負(fù)電，而氧化還原探針CN-也帶負(fù)電，同種電荷相互排斥，所以CV表征的信號(hào)與c曲線相比減弱了(d曲線)。接著用HT封閉，HT不導(dǎo)電，且HT與電極表面非特異性吸附位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)一步阻礙電子的傳遞，CV信號(hào)再次降低 (e曲線)。最后，將凝血酶孵育在電極表面時(shí)，凝血酶會(huì)與凝血酶適體鏈特異性結(jié)合，再次阻礙電子的傳遞，因此CV信號(hào)進(jìn)一步減弱(f曲線)。結(jié)果表明，該適體傳感器的每一步修飾過程都是成功的。

圖3 PEC適體傳感器制備過程的CV表征:(a)裸電極，(b)納米二氧化鈦/裸電極，(c)沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(d)凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(e)巰基己烷/凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(f)凝血酶/巰基己烷/凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極Fig.3 CV responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)TiO2NPs/bare GCE,(c)dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(d)TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(e)HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(f)TB/HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE

2.3 PEC適體傳感器制備過程的PEC表征

在 5 mL PBS緩沖溶液 (0.1 mol/L，pH7.0)和50 μL H2O2的混合溶液中進(jìn)行光電流測量。激發(fā)光源由LED燈提供，選擇波長為460 nm的單色光，在0.0 V電位下關(guān)-開-關(guān)10-20-10秒。在圖4中，與裸電極(a曲線)的PEC響應(yīng)信號(hào)相比，經(jīng)納米二氧化鈦修飾的電極具有較高的PEC信號(hào)(b曲線)；鍍金后，由于納米金遮擋住了納米二氧化鈦，納米二氧化鈦接受光照的效率降低，PEC信號(hào)降低(c曲線)；通過Au-N鍵作用，將TBA成功地固載到Au修飾的電極上，PEC信號(hào)再次降低(d曲線)；經(jīng)HT封閉住非特異性位點(diǎn)，PEC信號(hào)進(jìn)一步降低(e曲線)；通過TB與TBA的特異性結(jié)合，將TB成功地固載到電極上，由于TB是一種蛋白，會(huì)阻礙電子的傳遞，因此PEC信號(hào)繼續(xù)降低(f曲線)。

圖4 適體傳感器制備過程的PEC表征:(a)裸電極，(b)納米二氧化鈦/裸電極，(c)沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(d)凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(e)巰基己烷/凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(f)凝血酶/巰基己烷/凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極Fig.4 PEC responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)TiO2NPs/bare GCE,(c)dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(d)TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(e)HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(f)TB/HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE

2.4 光電流產(chǎn)生機(jī)理

光電流產(chǎn)生機(jī)理如圖5所示。利用納米二氧化鈦?zhàn)鳛楣怆娀钚晕镔|(zhì)，納米二氧化鈦因?yàn)槠涮厥獾募{米結(jié)構(gòu)而具有表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)。納米二氧化鈦具有優(yōu)異的光電活性，產(chǎn)生的光電流非常穩(wěn)定。當(dāng)光源的能量大于納米二氧化鈦的禁帶寬度時(shí)，納米二氧化鈦價(jià)帶上的電子獲得能量、受到激發(fā)、躍遷到導(dǎo)帶上，電子從導(dǎo)帶上進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到電極的表面，同時(shí)底液中的電子供體H2O2向納米二氧化鈦的價(jià)帶提供電子，從而產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的光電流信號(hào)?；赑EC分析方法原理，利用納米二氧化鈦優(yōu)異的光電特性，構(gòu)建了準(zhǔn)確、靈敏的PEC適體傳感器。通過檢測PEC適體傳感器對(duì)不同濃度TB的PEC響應(yīng)值，從而達(dá)到檢測TB濃度的目的。

圖5 光電流產(chǎn)生機(jī)理Fig.5 The generating mechanism of photocurrent

2.5 適體傳感器的PEC信號(hào)響應(yīng)特性

采用標(biāo)準(zhǔn)直線法，用合理稀釋過的待檢測物凝血酶(TB)配置一系列不同濃度的樣品作為目標(biāo)物，以測得適體傳感器對(duì)不同濃度凝血酶的光致電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)(圖6)。從圖6(A)中可以看到，適體傳感器對(duì)目標(biāo)物凝血酶的PEC響應(yīng)值隨凝血酶濃度的增加而降低，響應(yīng)范圍為0.01 pmol/L～10 nmol/L，檢測限為3.33 fmol/L。表明基于半導(dǎo)體納米二氧化鈦的光致電化學(xué)適體傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血酶TB的靈敏檢測。圖6(B)為線性范圍內(nèi)光致電化學(xué)峰電流值與lg cTB的線性相關(guān)圖，其線性方程為I=-82.2048 lgc+567.1205，相關(guān)系數(shù)r=0.9397。

圖6 適體傳感器對(duì)不同濃度TB的PEC響應(yīng)圖(A)及校正曲線(B)(TB的濃度分別為:0.01 pmol/L,0.1 pmol/L,1 pmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L)Fig.6 PEC responses of different concentrations of target TB(A)and the corresponding calibration curve(the concentrations of target TB were 0.01 pmol/L,0.1 pmol/L,1 pmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L)

表1 PEC適體傳感器同其他測定凝血酶的方法對(duì)比[19-21]Tab.1 The PEC captasensor compared with other thrombin analytical methods

此外，將所構(gòu)建的PEC適體傳感器的分析性能與其他檢測凝血酶(TB)的分析方法的分析性能進(jìn)行對(duì)比。如表1所示，該論文所構(gòu)建的適體傳感器具有相對(duì)較寬的線性范圍和相對(duì)較低的檢測限。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，該文所構(gòu)建的適體傳感器對(duì)TB的定量檢測是可靠和靈敏的。

2.6 PEC適體傳感器的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是檢驗(yàn)一個(gè)傳感器是否能得到實(shí)際應(yīng)用的重要指標(biāo)。一定濃度的待測物質(zhì)在一定條件下的PEC信號(hào)是否穩(wěn)定，通過多次測量PEC信號(hào)求取偏差來衡量。利用該適體傳感器對(duì)濃度為100 pmol/L的凝血酶進(jìn)行檢測，得到的PEC響應(yīng)信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.63%(圖7)。結(jié)果顯示，該傳感器具有較好的穩(wěn)定性，有望用于實(shí)際樣品的檢測。

圖7 PEC適體傳感器的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of the PEC aptasensor

2.7 PEC適體傳感器的選擇性

為探索所構(gòu)建適體傳感器的選擇性，該實(shí)驗(yàn)用L-Cys、CEA和AFP作為干擾物質(zhì)。在控制條件相同的情況下，在傳感器表面分別孵育L-Cys(100 pmol/L)，CEA(100 pmol/L)，AFP(100 pmol/L)和TB(10 pmol/L)。從圖8可以看出，孵育L-Cys、CEA和AFP的傳感器測得較高的PEC信號(hào)，并且與空白對(duì)照獲得的PEC信號(hào)相差不大。而孵育TB的傳感器測得較低的PEC信號(hào)，并且明顯低于這三種干擾物質(zhì)。結(jié)果表明，該適體傳感器對(duì)凝血酶的檢測具有良好的選擇性。

圖8 PEC適體傳感器的選擇性Fig.8 Selectivity of the PEC aptasensor

2.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)所構(gòu)建的適體傳感器在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。用稀釋過50倍的健康人體血清分別配制以下濃度的凝血酶：5 nmol/L、1 nmol/L、20 pmol/L、5 pmol/L、0.1 pmol/L。 對(duì)樣品進(jìn)行檢測，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，最終得到的結(jié)果如表2。由表可知，回收率在93.60%~104.00%之間，表明所構(gòu)建的適體傳感器在健康人體血清中的檢測效果良好，有望用于實(shí)際樣品的檢測。

表2 PEC適體傳感器對(duì)不同濃度TB的檢測Tab.2 Detection of different concentrations of TB by this PEC aptasensor

3 結(jié)論

文章旨在運(yùn)用光致電化學(xué)分析技術(shù)構(gòu)建一種準(zhǔn)確靈敏的PEC適體傳感器，用于凝血酶的檢測。正是由于納米二氧化鈦的優(yōu)良光電特性，獲得了較高的PEC響應(yīng)信號(hào)。由于凝血酶適體鏈TBA對(duì)凝血酶TB的特異性識(shí)別，該適體傳感器具有良好的選擇性。該適體傳感器制備簡單、檢測靈敏、穩(wěn)定性好、選擇性高，提供了一種快速、準(zhǔn)確測量凝血酶的檢測方案。在實(shí)際樣品中的檢測顯示，該適體傳感器對(duì)凝血酶的檢測有著較好的回收率，在臨床診斷中有著廣闊的發(fā)展前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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