大櫻桃潰瘍病病原菌的分離純化和鑒定

張鵬鵬+李園園+劉露

摘要：為研究大櫻桃潰瘍病的發(fā)病機(jī)制，明確其病原菌種類(lèi)及其生物學(xué)特性，從山東省青島市黃島區(qū)張家樓鎮(zhèn)采集了幾株發(fā)病的大櫻桃樹(shù)枝條，從其腐爛交接口取樣篩選出1株導(dǎo)致大櫻桃樹(shù)潰瘍病的病原菌YT-2。根據(jù)柯赫氏法則驗(yàn)證了YT-2的致病性，通過(guò)觀察形態(tài)學(xué)特征，并提取ITS序列進(jìn)行分析，將YT-2的ITS序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)YT-2菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病原菌YT-2的形態(tài)特征與葡萄座腔菌相符，ITS序列與已發(fā)布的葡萄座腔菌的ITS序列相似度達(dá)到100%，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果也與之相同。說(shuō)明引起山東省青島市大櫻桃潰瘍病的病原為葡萄座腔菌，尤其是對(duì)長(zhǎng)勢(shì)旺盛的布魯克斯大櫻桃品種危害最為嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞：葡萄座腔菌；布魯克斯大櫻桃；rDNA-ITS；有性型；潰瘍病

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.629 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0145-03

櫻桃是原產(chǎn)于歐洲的古老樹(shù)種[1]，大櫻桃因具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，口味鮮美而成為人們最喜愛(ài)的水果之一。隨著大櫻桃產(chǎn)量的增加，現(xiàn)在的供求關(guān)系已由原來(lái)供不應(yīng)求變?yōu)楣┐笥谇?，因此消費(fèi)者對(duì)櫻桃的內(nèi)在品質(zhì)要求也越來(lái)越高。布魯克斯大櫻桃因具有早熟、大果脆甜的特點(diǎn)，日益引起消費(fèi)者的關(guān)注和青睞，成為目前銷(xiāo)量最好的櫻桃新品種之一[2]，因此研究布魯克斯大櫻桃的病蟲(chóng)害對(duì)今后櫻桃種植業(yè)的發(fā)展具有重大意義。然而在山東省青島市黃島區(qū)張家樓鎮(zhèn)的大櫻桃園里，布魯克斯大櫻桃植株出現(xiàn)根腐、枝干干腐、流膠、葉片發(fā)黃等一系列潰瘍病病癥，并且發(fā)病集中于1～2年的幼苗。發(fā)病迅速，樹(shù)干干枯，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得不到運(yùn)輸，造成整株死亡，大櫻桃植株成片死亡，給櫻桃園造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因?yàn)闈儾〉牟≡N類(lèi)較多、癥狀表現(xiàn)多樣、危害巨大、發(fā)生期蔓延面廣且迅速，并且采用市面上的殺蟲(chóng)劑、殺菌劑均無(wú)明顯的改善作用，較難控制等，使其成為林業(yè)種植和病害防治的重難點(diǎn)[3]。因此，找出病害的根源并鑒定出該病原菌，為大櫻桃的綜合防治提供理論基礎(chǔ)尤為重要。

目前已有的報(bào)道表明，樹(shù)木潰瘍類(lèi)病害危害的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)林木主要有楊樹(shù)、蘋(píng)果、梨樹(shù)、石榴、松樹(shù)等[4]。我國(guó)的樹(shù)木潰瘍病主要是由真菌引發(fā)的，目前研究表明，引起樹(shù)木潰瘍病的病原真菌類(lèi)群主要有葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria Cas.）、瘍殼孢屬（Dothichiza Lib.）、殼囊孢屬（Cytospora Ehrenb.）、盾殼霉屬（Coniothyrium Sacc.）等4屬真菌，這些真菌也成為阻礙我國(guó)現(xiàn)階段林業(yè)發(fā)展的有害生物。其中，分布范圍最廣泛的葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria sp.）因?qū)?shù)木的影響最大、危害最嚴(yán)重，而成為導(dǎo)致樹(shù)木潰瘍病最主要的病原真菌，也成為目前在我國(guó)受到最廣泛關(guān)注的重大生物災(zāi)害之一。但迄今為止，葡萄座腔菌屬在大櫻桃樹(shù)上發(fā)病的情況并不多見(jiàn)，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)樣采集與分離

2014年6—7月于山東省青島市黃島區(qū)張家樓鎮(zhèn)大櫻桃園潰瘍病發(fā)病區(qū)域采集標(biāo)樣，采集時(shí)沿病斑周?chē)鷮⒄麄€(gè)發(fā)病枝條取下，完整保存整個(gè)病斑，記錄發(fā)病癥狀、采集時(shí)間、地點(diǎn)、樹(shù)齡、胸徑、危害程度，于4 ℃冰箱保存。

在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)將采集的病斑枝條切成5 mm×5 mm 的小塊，用75%乙醇消毒2 min，0.1%的氯化汞消毒 5 min，然后在無(wú)菌水中清洗幾次，以防止氯化汞殘留。將消毒處理好的病斑塊放入含有抗生素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿2塊，28 ℃下培養(yǎng)，待菌落直徑長(zhǎng)至2 cm時(shí)，挑取菌落邊緣未被污染的少許菌絲轉(zhuǎn)接于新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行純化，將純化后菌株轉(zhuǎn)入試管，置于4 ℃冰箱中保存，以便下一步研究。

1.2 菌株的致病性測(cè)定

根據(jù)柯赫氏法則，以健康品種為易感病的品種布魯克斯大櫻桃枝條作為接種對(duì)象，檢測(cè)分離病原菌的致病性。取直徑約2 cm的2年生枝條，截成25 cm段，用75%乙醇進(jìn)行表面消毒、晾干，用灼燒滅菌處理后的直徑6 mm的打孔器刺入枝條，形成1個(gè)燙傷傷口，將同樣大小的病原菌菌餅放入傷口處，然后用保鮮膜密封，對(duì)照組則用無(wú)菌PDA餅處理。將枝條上端用保鮮膜密封后插入盛有水的燒杯，放入培養(yǎng)箱中 28 ℃ 下培養(yǎng)，每天進(jìn)行觀察，記錄是否發(fā)病以及發(fā)病特征。

1.3 病原菌菌落與菌絲特征

1.3.1 菌落特征觀察

將分離純化后的菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)快慢、菌落形狀、質(zhì)地、氣生菌絲特征、正背面顏色、有無(wú)色素沉積、有無(wú)特殊氣味等。

1.3.2 菌絲形態(tài)觀察

采用斜面插片法，使菌絲生長(zhǎng)至斜插在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的蓋玻片上，取出蓋玻片在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.3.3 孢子觀察

將培養(yǎng)基上產(chǎn)生的子實(shí)體置于載玻片上，先用解剖刀切開(kāi)子實(shí)體，加上1滴蒸餾水，再用解剖針將其撥開(kāi)，使孢子散落在載玻片上，簡(jiǎn)單染色后，在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原物的分離培養(yǎng)

病斑組織在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上培養(yǎng)3 d，在邊緣切口處長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基多次純化后得到3個(gè)純培養(yǎng)物YT-1、YT-2、YT-3。

2.2 致病性測(cè)定

利用上述3株菌株進(jìn)行致病性測(cè)定（回接試驗(yàn)），結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有菌株YT-2能引起枝條潰瘍病的癥狀。枝條感染后出現(xiàn)暗褐色至黑褐色不規(guī)則形病斑，在28 ℃條件下培養(yǎng)5 d后，病斑部位再分離，所獲分離菌株與菌株YT-2完全一致，符合柯赫氏法則。

2.3 病原物的培養(yǎng)性狀及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)觀察

病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最好，而在改良馬丁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)相對(duì)遲緩。氣生菌絲十分發(fā)達(dá)，會(huì)呈現(xiàn)“峰”狀聳起，菌絲最高可以觸到培養(yǎng)皿蓋；生長(zhǎng)初期菌落呈白色，后期呈灰色。在野外病株中可以觀察到該病原菌的有性或無(wú)性繁殖結(jié)構(gòu)（圖1）。經(jīng)近紫外線(xiàn)照射培養(yǎng)后，病原菌可在改良馬丁培養(yǎng)基上產(chǎn)生繁殖體。培養(yǎng)30 d后，菌落表面局部有直徑約1～2 mm的顆粒狀角質(zhì)化凸起物（分生孢子器）生成，分生孢子紡錘形，單細(xì)胞，無(wú)色，大小15～20 μm×3～5 μm（圖2-F）。根據(jù)上述病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定該病原菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。為了進(jìn)一步確認(rèn)，利用ITS基因分析方法對(duì)病原菌進(jìn)行分子鑒定。

2.4 病原菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，ITS基因片段的大小在540 bp左右（圖3）。序列經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)葡萄座腔菌菌株的相似性均達(dá)到100%。系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4）也表明病原菌株YT-2與已報(bào)道葡萄座腔菌種在一個(gè)分支內(nèi)（自展支持率達(dá)98%），與葡萄座腔菌屬其他種類(lèi)遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定YT-2菌株為葡萄座腔菌（B. dothidea）。

3 結(jié)論與討論

葡萄座腔菌（B. dothidea）是一種分布十分廣泛的真菌，在世界范圍內(nèi)均有報(bào)道，它不僅可以侵染植物，成為植物的病原菌，也可以寄生在植物組織內(nèi)成為內(nèi)生真菌，甚至存活在某些壞死的植物組織上作為腐生菌[1]。作為病原菌，該菌的寄生性比較弱，目前已經(jīng)有研究報(bào)道它能侵染的主要林業(yè)樹(shù)木有蘋(píng)果、葡萄、松樹(shù)、楊樹(shù)、黑莓、桃樹(shù)、橄欖、芒果等[5-10]，由于不同林木的生理生化性質(zhì)不同，因此該菌的致病性、林木的抗病性和在二者共生過(guò)程中，不同種類(lèi)的林木產(chǎn)生的防御反應(yīng)差異也比較大，這很容易造成相同癥狀的不同寄主擁有不同的反應(yīng)機(jī)制；而同種林木因?yàn)閭€(gè)體間的生長(zhǎng)差異以及不同環(huán)境地域的差異，對(duì)同一真菌的反應(yīng)也不盡相同[11]。因此，葡萄座腔菌引起的病癥也因樹(shù)種和樹(shù)體自身差異而表現(xiàn)不同，主要的病癥表現(xiàn)為葉斑、枝干潰瘍、枝條枯萎、果實(shí)腐爛等。目前研究表明病害多發(fā)生在長(zhǎng)勢(shì)衰弱的植株上，尤其當(dāng)植物受到干旱、霜凍或其他病蟲(chóng)害侵染時(shí)發(fā)病率更會(huì)極大地提高[12-14]，但是，在本研究中，長(zhǎng)勢(shì)健壯的大櫻桃植株會(huì)迅速感染該病原菌，并且造成植株死亡的嚴(yán)重后果，尤其以布魯克斯大櫻桃表現(xiàn)最為明顯，這也是首次發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌可以感染大櫻桃，因此，在大櫻桃上首次發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌，為研究大櫻桃的栽培管理技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。雖然布魯克斯大櫻桃適應(yīng)環(huán)境的能力強(qiáng)，但卻是對(duì)葡萄座腔菌抗性最弱的品種，在嫁接時(shí)應(yīng)注意消毒殺菌，施用腐熟好的農(nóng)家肥，并注意做好防寒措施。

葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）真菌的無(wú)性型在自然界和實(shí)驗(yàn)室人工條件下培養(yǎng)比較常見(jiàn)，但是有性型在這2種條件下都較少見(jiàn)，尤其是在實(shí)驗(yàn)室條件下，很少能觀察到它的有性型形態(tài)。因此，目前對(duì)于該屬真菌主要基于無(wú)性型的形態(tài)特征進(jìn)行分類(lèi)學(xué)鑒定的[15]。但是，葡萄座腔菌種間的形態(tài)十分相似，不易產(chǎn)生有性繁殖結(jié)構(gòu)，葡萄座腔菌的寄主廣泛、容易交叉污染等特點(diǎn)使無(wú)性態(tài)區(qū)別十分模糊，并且這些特征也使該類(lèi)群有性型和無(wú)性型種的建立比較混亂，所以單純依靠傳統(tǒng)的鑒定方法有一定的局限性。目前該屬真菌種類(lèi)的分類(lèi)學(xué)和親緣關(guān)系仍不是很清楚，需要進(jìn)一步深入研究。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，基因組DNA中的保守序列（LSU、ITS等）已越來(lái)越多地應(yīng)用到該類(lèi)病原菌的鑒定中。本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察并對(duì)rDNA-ITS序列進(jìn)行分析，對(duì)引起大櫻桃潰瘍病的病原菌進(jìn)行鑒定，最終確認(rèn)其為葡萄座腔菌（B. dothidea），為山東省青島地區(qū)大櫻桃潰瘍病的防治奠定了理論基礎(chǔ)。

在進(jìn)行病原菌鑒定的過(guò)程中，本研究主要通過(guò)紫外線(xiàn)照射的方法進(jìn)行人工誘導(dǎo)產(chǎn)孢，最終觀察到該菌株的孢子結(jié)構(gòu)特征，但耗時(shí)1個(gè)月，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，由于種間的形態(tài)比較相似，鑒定需要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，難度相對(duì)較大。而利用 rDNA-ITS序列分析方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，操作不僅簡(jiǎn)單，而且快速。但是，因?yàn)镮TS序列在遺傳變異性上屬于中等保守區(qū)，難以充分顯示葡萄座腔菌種間復(fù)雜的相關(guān)性和多樣性。所以，在進(jìn)行病原鑒定時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)方法作為驗(yàn)證仍是十分必要的。而且，由于葡萄座腔菌屬真菌侵染寄主的廣泛性，以及不同菌株對(duì)于不同寄主致病性的顯著差異，找到能夠快速區(qū)別不同致病力菌株的分子標(biāo)記或相關(guān)方法也是亟待開(kāi)展的工作。

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