利用分子標(biāo)記輔助選擇創(chuàng)制抗赤霉病小麥新品系

劉建軍，李豪圣，陳雪燕，賈海燕，翟勝男，郭軍，程敦公，劉成，曹新有，劉愛峰，宋健民，劉佳，楚秀生，馬正強(qiáng)

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

小麥赤霉病（Fusarium head blight，F(xiàn)HB）是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum Schwabe）引起的一種嚴(yán)重的穗部病害。赤霉病一直是影響我國長江中下游麥區(qū)、東北春麥區(qū)以及華南麥區(qū)小麥產(chǎn)量與品質(zhì)最嚴(yán)重的病害。近年來，受氣候變暖、矮稈品種的推廣、復(fù)種指數(shù)的提高和秸稈還田等因素的影響，小麥赤霉病流行區(qū)域不斷擴(kuò)大，由長江中下游地區(qū)迅速向小麥主產(chǎn)區(qū)的黃淮冬麥區(qū)乃至北部冬麥區(qū)擴(kuò)展，并且由偶發(fā)性病害變?yōu)槌０l(fā)性病害和主要病害［1］。2012年我國小麥赤霉病大流行，全國小麥?zhǔn)芎γ娣e達(dá)1 000萬公頃［2］。赤霉病的發(fā)生不僅影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)，而且產(chǎn)生的DON等毒素給食品安全造成很大隱患［3］。培育和推廣抗病品種是防治赤霉病最經(jīng)濟(jì)、有效、安全和可靠的途徑。

小麥抗赤霉病基因／QTL主要有兩類，分別是抗擴(kuò)展（TypeⅡ）的Fhb1［4］、Fhb2［5］、Fhb3［6］和Fhb7［7］等以 及抗 侵入 （TypeⅠ）的Fhb4［8］和Fhb5［9］等，上述基因已被正式命名且已建立與其緊密連鎖的分子標(biāo)記或功能標(biāo)記［3-10］。其中，位于3B染色體上的Fhb1基因是目前為止公認(rèn)的效應(yīng)最大、抗性最穩(wěn)定的抗赤霉病基因［3，4］，一般認(rèn)為該基因位點(diǎn)具有良好的抗擴(kuò)展效應(yīng)，也有研究表明該位點(diǎn)同時(shí)具有抗侵染效應(yīng)和抗DON毒素積累效應(yīng)［11］；來源于6BS染色體的Fhb2是僅次于Fhb1的抗擴(kuò)展主效基因［11］。

通過品種間雜交，長江中下游麥區(qū)已創(chuàng)制和培育出一批在育種和生產(chǎn)上可以利用的抗源和中等抗病的品種，而目前黃淮冬麥區(qū)尤其是黃淮北片的小麥品種絕大部分高感赤霉病，缺少赤霉病抗性品種［12，13］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，抗病基因的定位和分子標(biāo)記技術(shù)日臻完善和成熟，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)開始被廣泛應(yīng)用。美國、加拿大、澳大利亞和日本等發(fā)達(dá)國家已經(jīng)利用Fhb1分子標(biāo)記輔助選育出了一批小麥新品種，其赤霉病抗性顯著提高［10］。2012年以來，提高小麥新品種赤霉病抗性成為黃淮冬麥區(qū)主要育種目標(biāo)之一。抗源篩選和抗病材料創(chuàng)制是抗赤霉病品種選育和推廣的基礎(chǔ)，長江中下游抗赤霉病較好的品種和種質(zhì)材料屬春性、耐寒性差，難以在黃淮北片抗赤霉病品種選育中直接應(yīng)用，冬性和半冬性的小麥赤霉病抗源種質(zhì)材料匱乏。

本研究以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)制的抗赤霉病中間材料為抗源、黃淮麥區(qū)北片優(yōu)良品種（系）為農(nóng)藝親本，利用分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)育種技術(shù)，創(chuàng)制出目標(biāo)性狀比較突出、綜合性狀較為優(yōu)良的半冬性抗赤霉病育種材料，為培育適宜種植黃淮地區(qū)、既高產(chǎn)又抗赤霉病的小麥品種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試親本材料

抗赤霉病基因供體材料NMAS020是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)利用望水白主效QTL近等基因系與PH691雜交創(chuàng)制的抗赤霉病中間材料，含有Fhb1（位于3B染色體）、Fhb2（6B）、Fhb4（4B）和Fhb5（5A）共4個抗赤霉病基因；農(nóng)藝親本1濟(jì)麥22是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)廣適小麥品種；農(nóng)藝親本2石H083-366是石家莊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的綜合性狀優(yōu)良且高抗白粉病的小麥新品系。

1.2 選育方法

1.2.1 抗赤霉病育種群體構(gòu)建及雜種后代選育方法 2014年4月以NMAS020為母本、以濟(jì)麥22為父本進(jìn)行雜交，獲得F1。2015年4月以雜種F1為母本，以含抗白粉病基因Pm21的石H083-366為父本復(fù)交，復(fù)交目的主要是提高雜種后代白粉病抗性；2016—2019年復(fù)交后代采用系譜法主要針對耐寒性、株高、株型、穗部性狀、粒色及白粉病抗性等進(jìn)行選育，單株和株系利用分子標(biāo)記跟蹤檢測抗赤霉病基因；2020年對55個性狀基本穩(wěn)定、綜合性狀優(yōu)良的品系采用單花滴注法接種鑒定赤霉病抗性，濟(jì)麥22為感病對照。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測 與抗赤霉病基因Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5緊密連鎖的標(biāo)記特異引物序列及其擴(kuò)增程序參照相關(guān)文獻(xiàn)［4，5，8，9］，引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成。利用常規(guī)PCR篩選出每條染色體上擴(kuò)增效率高、多態(tài)性好的引物，采用不同顏色的熒光染料對其末端進(jìn)行標(biāo)記，應(yīng)用ABI3730XL全自動DNA分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳和熒光信號收集，利用GeneMapper v4.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 田間調(diào)查、抗性鑒定和評價(jià) 55個品系及對照濟(jì)麥22于2019—2020年度種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所15條田，順序排列，不設(shè)重復(fù)；6行區(qū)，小區(qū)長4 m，寬1.5 m，機(jī)械條播，基本苗15萬株（666.7m2）。幼苗習(xí)性、株型、粒型和株高等農(nóng)藝性狀調(diào)查參考農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范 小麥（NY／T 1301—2007）。

赤霉病抗性鑒定所用菌種為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）15-A DON型，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所惠贈，采用單花滴注法人工接種鑒定。用微量移液器取10μL分生孢子懸浮液（1.0×105～1.5×105個／mL），注入麥穗中部剛開花的小穗內(nèi)；每個品種接種5穗，接種麥穗套保鮮袋保濕3 d，接種后21 d調(diào)查每個接種穗的發(fā)病小穗和總小穗數(shù)，計(jì)算平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率（%），作為赤霉病抗性評價(jià)指標(biāo)［9］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SAS軟件Windows version 9.0系統(tǒng)（SASInstitute Inc.，Cary，NC，USA）、采用鄧肯氏多重比較法（Duncan’s Multiple Range Test，P＜0.05）進(jìn)行不同基因／QTL及其組合間感病小穗數(shù)和感病小穗率差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因／QTL及其組合出現(xiàn)的頻率

育種實(shí)踐表明，蘇麥3號和望水白等赤霉病抗源材料及其衍生系雖然具有良好的赤霉病抗性，但農(nóng)藝性狀、其它病害抗性和豐產(chǎn)性等較差，由于基因連鎖關(guān)系，在進(jìn)行綜合性狀選擇時(shí)往往會導(dǎo)致抗赤霉病目標(biāo)基因的丟失［10］。本研究的抗赤霉病復(fù)交育種群體，經(jīng)過連續(xù)4代田間優(yōu)良單株和株系農(nóng)藝性狀選擇最終保留了55個品系，經(jīng)抗赤霉病分子標(biāo)記檢測，55個品系中有35個品系含有1～3個抗病基因／QTL位點(diǎn)，占63.6%；不含任何位點(diǎn)的有20個，占36.4%（表1）。盡管雜種各世代都進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測，并且在早代曾出現(xiàn)過15種基因／QTL組合類型（包括4個基因／QTL組合類型，F(xiàn)hb1＋Fhb2＋Fhb4＋Fhb5），但可能由于田間綜合農(nóng)藝性狀的選擇，結(jié)果只出現(xiàn)了9種基因／QTL組合類型。

含有不同抗病基因／QTL及不同抗病基因／QTL組合的品系赤霉病抗性不同（表1）。在僅含有一個抗病基因／QTL位點(diǎn)的4類品系中，含有Fhb1和Fhb4的品系平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率明顯低于含F(xiàn)hb2和Fhb5類型的品系及對照濟(jì)麥22，赤霉病抗性較好。在含有2個抗病基因／QTL組合中，含有Fhb2＋Fhb5的品系平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率最低，赤霉病抗性最好；含F(xiàn)hb1＋Fhb2的品系次之，兩者明顯低于Fhb1＋Fhb4和Fhb2＋Fhb4的品系；含F(xiàn)hb2＋Fhb4品系的平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率最高。含有單一抗病基因／QTL與含有兩個同類型抗病基因／QTL的表現(xiàn)不一致，可能是由于基因／QTL間互作等原因所致。

表1 不同基因／QTL及其組合的品系數(shù)量及感病小穗情況

2.2 不同基因／QTL及其組合赤霉病抗性效應(yīng)

從總體上看，含有不同數(shù)量的抗赤霉病基因／QTL的平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率均有顯著差異。含有3個抗赤霉病基因／QTL的平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率顯著低于含有2個抗赤霉病基因／QTL，含有2個抗赤霉病基因／QTL的平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率顯著低于含有1個抗赤霉病基因／QTL，含有1個抗赤霉病基因／QTL的顯著低于不含任何抗赤霉病基因／QTL的品系（表2）。根據(jù)赤霉病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)和評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)）［14］，含有一個抗病主效基因／QTL可達(dá)到中感水平，含2個基因可達(dá)到中抗及以上抗性水平，含有3個抗病基因／QTL可達(dá)到高抗水平，不含任何主效基因／QTL的品種（系）（包括對照濟(jì)麥22）表現(xiàn)高感赤霉病。

表2 含不同數(shù)量抗病基因／QTL品系赤霉病抗性

2.3 優(yōu)良品系濟(jì)麥8681和濟(jì)麥8775綜合表現(xiàn)

抗赤霉病基因／QTL分子標(biāo)記檢測結(jié)果顯示，55個品系中，濟(jì)麥8681和濟(jì)麥8775均含有Fhb1和Fhb2兩個抗赤霉病基因／QTL。田間單花滴注法接種鑒定結(jié)果表明，濟(jì)麥8681和濟(jì)麥8775的平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率均較低，表現(xiàn)抗或高抗赤霉?。ū?，圖1A、B），可作為抗赤霉病育種的優(yōu)良親本材料。

濟(jì)麥8681綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好（圖1C），該品系幼苗半匍匐，葉片較窄，苗色較淺，耐寒性好（2＋級）；株型較為緊湊，株高78 cm，抽穗期較對照濟(jì)麥22早5 d左右，成熟期早3 d，為中早熟品種；穗橢圓形，長芒，白殼，白粒，籽粒橢圓形，千粒重45 g。含抗白粉病基因Pm21，田間表現(xiàn)高抗白粉病。小區(qū)產(chǎn)量530.1 kg（每666.7m2，下同），較對照濟(jì)麥22增產(chǎn)3.29%。

濟(jì)麥8775綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好（圖1D），該品系幼苗半直立，葉片較窄，苗色較深，耐寒性好（2＋級）；株型較為松散，株高81 cm，抽穗期較對照濟(jì)麥22早4 d，成熟期早2 d，為中熟品種；穗長方形，長芒，白殼，白粒，籽粒橢圓型，千粒重42 g。田間表現(xiàn)中抗白粉病。小區(qū)產(chǎn)量518.0 kg，較對照濟(jì)麥22增產(chǎn)0.85%。

表3 濟(jì)麥8681和濟(jì)麥8775赤霉病抗性檢測結(jié)果

圖1 濟(jì)麥8681和濟(jì)麥8775的赤霉病抗性表現(xiàn)及田間生長情況

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)外小麥抗赤霉病育種的抗源主要是中國的蘇麥3號和望水白、日本的新中長、巴西的01234232及偃麥草等外源種質(zhì)等［15］。蘇麥3號和望水白是田間赤霉病抗性表現(xiàn)最佳、遺傳背景不同的兩個品種，均含有Fhb1和Fhb2主效基因／QTL［11］。美國北達(dá)科他州立大學(xué)利用蘇麥3號育成了攜帶Fhb1抗赤霉病硬紅春小麥品種Alsen，年推廣面積為95萬公頃，占該州小麥種植面積的1／3左右。20世紀(jì)70年代，西北農(nóng)林科技大學(xué)利用蘇麥3號進(jìn)行抗赤霉病育種，創(chuàng)制出一批抗病中間材料，為黃淮麥區(qū)選育具有赤霉抗性的品種奠定了基礎(chǔ)［3］。廖玉才等［16］的研究表明控制望水白抗赤霉病基因有5～6對。賈高峰等［17］研究表明，望水白赤霉病抗性受2～3對主基因控制，可解釋70%以上的抗性。Lin等［18］從望水白／南大2419重組自交系群體中定位到了4B和5A的2個抗侵染QTL，分別可以解釋17.5%和27.0%的表型變異。此后，Xue等［8，9］將位于4BL染色體上的位點(diǎn)定位在1.7 cM的范圍并命名為Fhb4，將位于5AS位點(diǎn)精細(xì)定位到0.3 cM的范圍內(nèi)并命名為Fhb5。本研究發(fā)現(xiàn)含有3個抗赤霉病基因／QTL的品系赤霉病抗性＞含有2個抗赤霉病基因／QTL的品系＞含1個抗赤霉病基因／QTL的品系＞不含抗赤霉病基因／QTL的品系；不同抗赤霉病基因／QTL及不同抗病基因／QTL組合對小麥赤霉病抗性表現(xiàn)不同，含F(xiàn)hb2＋Fhb5的品系平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率表現(xiàn)最低、赤霉病抗性最好，含F(xiàn)hb1＋Fhb2的品系次之，兩者明顯低于Fhb1＋Fhb4和Fhb2＋Fhb4的品系，含F(xiàn)hb2＋Fhb4品系的平均感病小穗數(shù)和平均感病小穗率最高。本研究還發(fā)現(xiàn)，含有1個或幾個抗赤霉病基因／QTL的品系也不一定都表現(xiàn)良好的赤霉病抗性，所以，分子標(biāo)記跟蹤檢測雜交后代比較有效，但只是輔助手段，最終需要田間赤霉病抗性鑒定進(jìn)行抉擇。

高產(chǎn)或豐產(chǎn)與抗赤霉病相結(jié)合是小麥育種的世界性難題，程順和院士等［1］提出用中感到中抗的豐產(chǎn)親本材料之間進(jìn)行配組取代赤霉病抗性好但豐產(chǎn)性差的親本間的組配，在后代鑒定篩選時(shí)，針對綜合豐產(chǎn)性的同時(shí)進(jìn)行抗赤霉病選擇，以解決豐產(chǎn)性與赤霉病抗性之間的矛盾。蘇麥3號和望水白等赤霉病抗源材料及其衍生材料主要來自長江中下游等春麥區(qū)，由于生態(tài)類型不同、光溫反應(yīng)差異大及植株高、穗育性差和白粉等病害重等不利因素，根據(jù)小麥赤霉病抗性是由多基因控制的數(shù)量遺傳特點(diǎn)，黃淮冬麥區(qū)尤其是黃淮北片難以直接利用這些抗源材料選育既抗病又高產(chǎn)廣適的品種，因此，宜采取循序漸進(jìn)、逐步改良的策略，首先創(chuàng)制各具特色的抗病材料，進(jìn)而再利用創(chuàng)制的含有不同抗病基因或不同抗性來源的材料選育高產(chǎn)抗病品種；在雜交組配方式上宜采取復(fù)交、回交、階梯聚合雜交等，聚合多個抗赤霉病基因和多個優(yōu)良性狀；在雜種后代群體數(shù)量上宜適當(dāng)放大群體，增加抗赤霉病和綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良個體選擇概率；在雜種后代選擇上要借助分子標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率；同時(shí)，更要重視對優(yōu)良株系或品系進(jìn)行表型抗性鑒定，最終實(shí)現(xiàn)抗赤霉病和高產(chǎn)的有機(jī)結(jié)合。本研究綜合利用分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)育種策略，創(chuàng)制出綜合性狀優(yōu)良且高產(chǎn)抗赤霉病小麥新品系濟(jì)麥8681和濟(jì)麥8775，為抗赤霉病種質(zhì)在冬小麥育種中奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。