兔糞中產(chǎn)纖維素酶菌的分離 篩選與初步鑒定

董小英 ，詹沛運(yùn) ，任曉強(qiáng) ，胡鴻惠 ，唐勝球 *

（1.韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)學(xué)院粵北生豬生產(chǎn)及疾病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東韶關(guān) 512005；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

纖維素（cellulose）是由葡萄糖組成的大分子多 糖，屬于最豐富的綠色可再生資源，且是自然界中含量最多、分布最廣的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，其結(jié)構(gòu)致密、含有大量氫鍵且存在結(jié)晶區(qū)，不溶于水和一般有機(jī)溶劑，只能由纖維素酶水解成單糖才能被人和動(dòng)物所利用，因此，纖維素的有效利用仍存在不少生物障礙。我國(guó)每年有10億t以上的纖維素物質(zhì)，其中大部分沒有得到充分利用，若該資源有50%被加以利用，就能生產(chǎn)出1.0×107t的酒精[1]。可見，纖維素如能充分被人類利用或轉(zhuǎn)化，將為社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，甚至大大改變當(dāng)今世界能源需求的結(jié)構(gòu)與格局。

單胃動(dòng)物體內(nèi)缺乏β-葡萄糖苷酶，纖維素不能被降解成葡萄糖，難以被機(jī)體有效吸收與利用。但纖維素可被大多數(shù)草食動(dòng)物、軟體動(dòng)物、高等植物、昆蟲、細(xì)菌、放線菌和真菌高效降解與吸收，用于自身的營(yíng)養(yǎng)需求與生長(zhǎng)發(fā)育，究其原因是以上生物體內(nèi)能產(chǎn)生降解纖維素的纖維素酶。纖維素酶在自然界分布非常廣泛，除了存在于上述生物體內(nèi)外，還在反芻動(dòng)物的瘤胃、草食動(dòng)物盲腸及豬大腸中有產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌存在；而單胃動(dòng)物因缺乏產(chǎn)生纖維素酶的能力，故對(duì)于纖維素的吸收與利用非常有限。

截至目前，關(guān)于分解纖維素的微生物資源中，真菌是研究最多的一類[2]，而有關(guān)細(xì)菌的研究主要是從特殊環(huán)境中分離出來的細(xì)菌菌株[3～6]。當(dāng)前，利用微生物產(chǎn)纖維素酶菌將纖維素降解為單糖，并用以解決環(huán)境污染、能源短缺及動(dòng)物消化效率所帶來的世界性難題，已經(jīng)成為各國(guó)專家研究的重點(diǎn)[7]。對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的研究進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，限制纖維素資源應(yīng)用的主要因素之一是產(chǎn)纖維素酶菌活性普遍不高[8]。因此，對(duì)纖維素資源的高效利用，其關(guān)鍵是進(jìn)一步尋找和開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶能力的菌種，并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化推廣。

家兔為草食動(dòng)物，消化道內(nèi)含有自身腸道或外源攝入的產(chǎn)纖維素酶菌，能利用較高纖維素含量的植物作為食物來源，因此，其新鮮糞便中不僅存在大量未被利用的纖維素殘?jiān)€攜帶著來自腸道或外界的產(chǎn)纖維素酶菌。以普通家兔糞便為樣本，參照孫佑赫等[9]的分離方法稍做改進(jìn)，以期從兔糞中分離篩選出具有高產(chǎn)纖維素酶能力的菌株，為進(jìn)一步開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶菌種服務(wù)于現(xiàn)代化畜牧業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 兔糞 樣品為取自韶關(guān)市湞江區(qū)某肉兔養(yǎng)殖場(chǎng)健康成年兔的新鮮糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 分離培養(yǎng)基（Luria-Bertani，LB）。分別稱量蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、NaCl 5 g和瓊脂8 g，放入到500 mL錐形瓶中，加蒸餾水500 mL，調(diào)節(jié)pH值至中性[10，11]。在瓶口加入1條棉線，用錐形瓶塞塞緊，用報(bào)紙和橡皮筋包扎好，高壓蒸汽滅菌20 min。趁熱倒板，待其冷卻后放入冰箱內(nèi)備用。

1.1.2.2 純化培養(yǎng)基。與分離培養(yǎng)基相同。

1.1.2.3 產(chǎn)纖維素酶菌篩選培養(yǎng)基。分別稱量羧甲基纖維素鈉 （CMC-Na） 5 g、（NH4）2SO42 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、蛋白胨0.5 g和瓊脂8 g，放入到500 mL錐形瓶中，加蒸餾水至500 mL，pH值自然。在瓶口加入1條棉線，用錐形瓶塞塞緊，用報(bào)紙和橡皮筋包扎好，高壓蒸汽滅菌20 min。趁熱倒板，待其冷卻后放入冰箱內(nèi)備用。

1.1.3 試劑 試劑有0.1%剛果紅染色液、1 mol/L NaCl溶液、草酸銨結(jié)晶紫染色液、150 mg/mL革蘭氏碘溶液、堿性復(fù)紅染色液和95%酒精等，均由韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.4 儀器與設(shè)備 主要儀器設(shè)備有LX-01.50L高壓滅菌鍋（購(gòu)于北京華威興業(yè)科技有限公司）、MP1100B電子分析天平（購(gòu)于上海恒平科學(xué)儀器有限公司）、BCD-206ZM2B冰箱（購(gòu)于合肥美菱股份有限公司）、超凈臺(tái)（購(gòu)于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、生化培養(yǎng)箱、電熱干燥箱（購(gòu)于上海申光儀器儀表有限公司）和光學(xué)顯微鏡等。所用玻璃器具先用自來水沖洗干凈，晾干后用報(bào)紙和橡皮筋包扎好，高壓蒸汽滅菌15～20 min，然后放在干燥箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離與純化 稱量新鮮兔糞樣品2.41 g，用無(wú)菌水溶解成20 mL，取上清液作為原液，待用。分別取原液以及稀釋濃度梯度10-2、10-4和10-6的樣液，在分離培養(yǎng)基（LB）上進(jìn)行涂布分離，各稀釋濃度均重復(fù)3次，置培養(yǎng)箱中37℃倒置黑暗厭氧培養(yǎng)48 h。挑選形態(tài)不同的菌落進(jìn)行劃線純化，同樣條件培養(yǎng)48 h。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌的篩選 將純化后的菌株采用點(diǎn)接法接種于產(chǎn)纖維素篩選培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中37℃倒置培養(yǎng)72 h。采用剛果紅染色法鑒定產(chǎn)酶能力，并篩選出產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株：在平板培養(yǎng)基中倒入0.1%剛果紅染色液5 mL，染色30 min后倒出染液，并用1 mol/L的NaCl溶液5 mL脫色20 min，觀察平板培養(yǎng)基中未染色的透明區(qū)域，用卡尺測(cè)定透明圈直徑（D） 和菌圈直徑（d），篩選透明圈直徑與菌圈直徑比值（D/d）較大的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3 革蘭氏染色（Gram Stain） 和制片 取D/d較大的菌株作為樣本，均勻涂布于玻璃片上，火焰固定，制成抹片。滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，處理1～2 min，水洗；加革蘭氏碘溶液于抹片上，作用3min，水洗；隨后用95%酒精進(jìn)行脫色，作用1 min，水洗；加堿性復(fù)紅液復(fù)染30 s，水洗，烘干制成標(biāo)本[12]。

1.2.4 產(chǎn)纖維素酶菌株的鑒定 將標(biāo)本在油鏡下進(jìn)行革蘭氏染色鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定，記錄并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

培養(yǎng)48 h后，從兔糞樣品中分離出乳白和金黃2種顏色的菌落（圖1）。其中，乳白色菌落占優(yōu)勢(shì)，菌落形態(tài)呈圓形凸起，表面有光澤，邊緣圓滑整齊、無(wú)滲出液；金黃色菌落在培養(yǎng)基上呈零星分布，菌落形態(tài)呈圓形凸起，表面有光澤，邊緣呈鋸齒狀、無(wú)滲出液。從中挑選出形態(tài)各異的菌株48株，于37℃純化培養(yǎng)48 h，均能正常生長(zhǎng)。

圖1 分離培養(yǎng)的菌落Fig.1 Isolated and cultured colonies

2.2 產(chǎn)纖維素酶菌的篩選

經(jīng)剛果紅染色并脫色后發(fā)現(xiàn)，CMC-Na培養(yǎng)基均呈紅色（圖2），其中，5個(gè)培養(yǎng)基中出現(xiàn)了水解的透明圈共8個(gè)，即具有產(chǎn)纖維素酶能力的細(xì)菌只有8株。

圖2 剛果紅染色后的產(chǎn)纖維素酶菌Fig.2 Cellulose producing bacteria by Congo red stain

對(duì)這8株細(xì)菌的透明圈和菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果（表1）顯示，各菌株的透明圈和菌圈直徑及其比值差別較大，其中，SK1和SK6菌株的D/d＞4，明顯＞其他菌株。表明SK1和SK6菌株的纖維素酶活性顯著高于其他菌株。因此，挑選出SK1和SK6作為最終目標(biāo)產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 菌株的透明圈和菌圈直徑及其比值Table 1 Ratios of transparent circle diameter to colony diameter

2.3 產(chǎn)纖維素酶菌的形態(tài)學(xué)鑒定

革蘭氏染色后進(jìn)行鏡檢，結(jié)果（圖3和4） 顯示，SK1和SK6兩目標(biāo)產(chǎn)纖維素酶菌菌株均呈藍(lán)紫色，桿狀。表明二者革蘭氏染色均為陽(yáng)性。故初步得出目標(biāo)菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+菌），且為桿菌[13～15]。

圖3 革蘭氏染色后的SK1菌株Fig.3 SK1 strain after Gram’s stain

圖4 革蘭氏染色后的SK6菌株Fig.4 SK6 strain after Gram’s stain

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

3.1.1 水解圈與酶活性 產(chǎn)纖維素酶菌可以通過剛果紅染色法來進(jìn)行快速鑒定與簡(jiǎn)便篩選，該菌的產(chǎn)纖維素酶能力可根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）直接反映，原理是剛果紅是一種能夠與大分子多糖相結(jié)合的染色劑，使用后與大分子多糖的纖維素結(jié)合形成紅色。CMC平板內(nèi)的纖維素被產(chǎn)纖維素酶菌產(chǎn)生的產(chǎn)纖維素酶水解，形成了小分子還原糖，所以經(jīng)剛果紅染色后，沒有被水解的纖維素與剛果紅結(jié)合呈現(xiàn)紅色，而水解部分由于缺少大分子多糖，不能與剛果紅作用染成紅色，而是呈現(xiàn)出未染色的透明圈。因此，透明圈直徑與菌圈直徑的比值反映了纖維素酶的活性和菌落的產(chǎn)酶能力，比值越大表示酶活越強(qiáng)，反之越弱。本研究中，經(jīng)過剛果紅染色并脫色后發(fā)現(xiàn)，5個(gè)培養(yǎng)基中共出現(xiàn)了8個(gè)水解透明圈，即篩選出8株具有產(chǎn)纖維素酶能力的細(xì)菌。

3.1.2 革蘭氏染色鑒定 從化學(xué)組成和生理性質(zhì)上來說，革蘭氏陽(yáng)性菌（G+菌） 和革蘭氏陰性菌（G-菌）存在明顯差別，其染色結(jié)果也不一樣。G+菌體內(nèi)含有獨(dú)特的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，能與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物牢牢地結(jié)合，不易脫色；而G-菌與該復(fù)合物結(jié)合程度較低，吸附染料的效果很差，極易被酒精脫色。因此，G+菌染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色，G-菌染色反應(yīng)呈紅色。

家兔屬草食性動(dòng)物，其飼料大部分是植物成分，所以，兔糞中存在大量的來自外界和腸道中的產(chǎn)纖維素酶菌。本研究以普通家兔新鮮糞便為樣本，從中分離出2種菌落形態(tài)不同的細(xì)菌。新鮮兔糞中存在一些腸道內(nèi)的細(xì)菌，而在腸道微生態(tài)環(huán)境中生存的細(xì)菌大多是不可培養(yǎng)的，因此，分離出的細(xì)菌僅僅是其中的一部分[16]。從分離出來的細(xì)菌中按照比例挑選48株，并接種到產(chǎn)纖維素酶菌篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，72 h后通過剛果紅染色法對(duì)CMC培養(yǎng)基進(jìn)行染色，脫色后各平板上共出現(xiàn)8個(gè)大小不一的透明水解圈，即有8株菌株具有產(chǎn)纖維素酶菌的能力，挑選率為16.67%。本研究條件下挑選率較低，分析原因是進(jìn)行篩選培養(yǎng)時(shí)沒有采取黑暗培養(yǎng)，部分細(xì)菌由于離開了腸道的黑暗厭氧環(huán)境，在有氧的情況下影響了其正常的生命活動(dòng)，導(dǎo)致其死亡或產(chǎn)酶能力下降等。對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行D/d分析，結(jié)果顯示，有2株菌株D/d＞4.00，產(chǎn)纖維素酶活性較高。選擇這2株細(xì)菌作為目標(biāo)菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，二者均為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+菌），形態(tài)為短棒狀，屬于桿菌。

產(chǎn)纖維素酶菌在世界上分布十分廣泛，發(fā)掘與研究不同的產(chǎn)纖維素酶菌對(duì)人類更好地利用纖維素資源具有重要意義。對(duì)兔糞中存在的產(chǎn)纖維素酶菌進(jìn)行初步研究，目的是為今后研究與利用兔糞中的產(chǎn)纖維素酶菌提供科學(xué)理論和奠定基礎(chǔ)。

3.2 結(jié)論

從普通家兔新鮮糞便中分離并篩選出了具有較高酶活性的產(chǎn)纖維素酶菌菌株SK1和SK6，采用革蘭氏染色初步鑒定為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+菌），屬于桿菌。從本研究中得到提示，利用兔糞可分離篩選出具有較高酶活的產(chǎn)纖維素酶菌，若能加以開發(fā)利用將具有較高的市場(chǎng)價(jià)值與應(yīng)用前景。

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