脂肪干細(xì)胞促進(jìn)可注射性“軟骨細(xì)胞磚-富血小板血漿”復(fù)合體形成異位軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

李治冶 董巖 馮曉珂 曹強(qiáng) 吳煒 巴睿愷 趙銥民

大量的研究采用組織工程技術(shù)將種子細(xì)胞負(fù)載于支架材料，成功地實(shí)現(xiàn)了軟骨再生[1]。然而，現(xiàn)有的方法很難實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)，可注射性軟骨細(xì)胞磚-富血小板血漿(chondrocyte bricks- platelet rich plasma, CB- PRP)復(fù)合體，作為一種完全自體來(lái)源的組織工程復(fù)合體，可負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)通過(guò)皮下注射的方式可實(shí)現(xiàn)軟骨再生[2-3]。不過(guò)，BMSCs因取材較難、數(shù)量相對(duì)有限等因素阻礙了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用[4]。脂肪干細(xì)胞(adipose- derived stem cells, ADSCs)可以從皮下組織中大量分離獲取，并具備骨向、軟骨向和脂肪向等多項(xiàng)分化潛能[5]。因此在軟骨再生領(lǐng)域，ADSCs被認(rèn)為是一種更理想的種子細(xì)胞。本研究把ADSCs負(fù)載于CB- PRP復(fù)合體中，探究其能否作為種子細(xì)胞促進(jìn)異位軟骨的形成。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

成人ADSCs、成人BMSCs(Cyagen)；成人軟骨細(xì)胞(Sciencell，美國(guó))；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶、雙抗、PBS緩沖液(Hyclone，美國(guó))；胎牛血清(Gemini，美國(guó))；抗壞血酸、檸檬酸鈉(Sigma，美國(guó))；凝血酶(Biomedical，西班牙)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國(guó))；顯微鏡電腦分析系統(tǒng)(Nikon CX J30，日本)。

1.2 軟骨細(xì)胞磚的制備與組織學(xué)鑒定

成膜培養(yǎng)軟骨細(xì)胞約15 d后，用多片刀切割器將細(xì)胞膜片切割成面積約為1 mm2小顆粒，即CB。PBS沖洗兩次后重懸于PBS中待用。取適量CB置于4%多聚甲醛中固定24 h后做石蠟切片，經(jīng)HE和Safranin- O染色后鏡下觀察。

1.3 PRP的提取和制備

挑選健康志愿者，簽署知情同意書。配制3.8%檸檬酸鈉抗凝液，取肘正中靜脈血9 ml后加入1 ml抗凝液。兩步離心法制備PRP：靜脈血以1 800 r/min離心8 min后分為3 層：血細(xì)胞層(底層)、PRP層(中層)和乏血小板血漿層(頂層)。棄掉底層后以3 600 r/min離心8 min，留下底層1/4為PRP，置于冰中待用。

1.4 “干細(xì)胞- CB- PRP”復(fù)合體的構(gòu)建及異位成軟骨實(shí)驗(yàn)

1.4.1 “干細(xì)胞- CB- PRP”復(fù)合體的構(gòu)建 將ADSCs和BMSCs分別擴(kuò)增培養(yǎng)，第2代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)組(ADSCs- CB- PRP)：將約2.25×107個(gè)ADSCs，軟骨細(xì)胞磚(原始軟骨細(xì)胞數(shù)量為7.5×106個(gè))與500 μl PRP混合后吸入2 ml注射器，加入50 μl凝血酶混勻后待其凝結(jié)。對(duì)照組(BMSCs- CB- PRP)：將約2.25×107個(gè)BMSCs，軟骨細(xì)胞磚(原始軟骨細(xì)胞數(shù)量為7.5× 106個(gè))與500 μl PRP混合后吸入2 ml注射器，加入50 μl凝血酶混勻后待其凝結(jié)。

1.4.2 裸鼠背部皮下注射實(shí)驗(yàn) 6～8 周齡雄性裸鼠10 只，隨機(jī)分為2 組。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，2 組復(fù)合體分別通過(guò)16G針頭注射至實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠背部皮下組織。

1.4.3 “干細(xì)胞- CB- PRP”復(fù)合體的大體形態(tài)觀察

12 周后處死裸鼠并取材，觀察比較2 組復(fù)合體在形態(tài)、色澤、光滑度和彈性等方面的異同。

1.4.4 “干細(xì)胞- CB- PRP”復(fù)合體的組織學(xué)分析 將標(biāo)本在4%多聚甲醛固定24 h后浸入10%EDTA脫鈣處理2 周，石蠟包埋切片后，進(jìn)行HE、Safranin- O和TB染色觀察，并對(duì)Safranin- O和TB染色陽(yáng)性區(qū)域面積進(jìn)行定量計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 軟骨細(xì)胞磚的組織學(xué)觀察

培養(yǎng)約15 d后，軟骨細(xì)胞形成白色半透明細(xì)胞膜片，表面平整且無(wú)褶皺、破潰(圖 1A)。切割后，軟骨細(xì)胞膜片形成一致的顆?；败浌羌?xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)”復(fù)合體，即軟骨細(xì)胞磚(圖 1B)。HE染色顯示軟骨細(xì)胞磚在垂直方向上由2～4 層圓形的軟骨細(xì)胞構(gòu)成，周圍環(huán)繞有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，其厚度約為50～90 μm(圖 1C)。Safranin- O染色顯示細(xì)胞外基質(zhì)中顯示大量均勻的桔紅色深染區(qū)域(圖 1D)。

A： 軟骨細(xì)胞膜片; B： 軟骨細(xì)胞磚; C～D： 軟骨細(xì)胞磚的HE和Safranin- O染色

2.2 大體形態(tài)觀察結(jié)果

經(jīng)凝血酶激活后，流動(dòng)的復(fù)合體逐漸凝結(jié)成凝膠樣結(jié)構(gòu)(圖 2A)。注射后，復(fù)合體具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，可在裸鼠皮下維持一定的大體形態(tài)(圖 2B)。經(jīng)過(guò)12 周的體內(nèi)生長(zhǎng)，2 組復(fù)合體均可觀察并觸及裸鼠背部明顯的半圓形隆起(圖 2C、2D)。與周圍組織分離后，2 組復(fù)合體均呈現(xiàn)輪廓規(guī)則、表面光滑、具有彈性的乳白色半透明的軟骨樣形態(tài)。此外，2 組復(fù)合體均與周圍組織實(shí)現(xiàn)了良好的融合，復(fù)合體表面及周圍可見(jiàn)明顯的血管分布，表明2 組復(fù)合體均可在動(dòng)物體內(nèi)存活并生長(zhǎng)，無(wú)明顯吸收和變形(圖 2E、2F)。

2.3 組織學(xué)結(jié)果

HE、Safranin- O及TB染色結(jié)果顯示，2 組復(fù)合體均觀察有較大較圓的成熟軟骨細(xì)胞位于軟骨陷窩內(nèi)，成群分布在中央，周圍包繞豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，Safranin- O和TB染色在細(xì)胞外基質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性，符合軟骨的典型組織學(xué)表現(xiàn)。較小較扁的幼稚軟骨細(xì)胞尚未成熟，單個(gè)分布在周圍，細(xì)胞外基質(zhì)較少，Safranin- O和TB染色顏色稍淺，呈弱陽(yáng)性(圖 3A～F)。定量分析顯示，Safranin- O染色陽(yáng)性區(qū)域面積在實(shí)驗(yàn)組占總面積的66.10%±7.81%；在對(duì)照組占62.11%±6.39%(P>0.05)(圖 3G)。TB染色陽(yáng)性區(qū)域面積在實(shí)驗(yàn)組占總面積的61.85%±8.22%；對(duì)照組占57.26%±7.63%(P>0.05)(圖 3H)。

A： 凝血酶激活后的復(fù)合體; B： 注射后裸鼠背部可見(jiàn)明顯隆起; C～D： 2 組復(fù)合體在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)12 周; E～F： 2 組復(fù)合體均呈現(xiàn)軟骨樣大體形態(tài)

圖 3 “干細(xì)胞- CB- PRP”復(fù)合體的組織學(xué)觀察與檢測(cè)

3 討 論

對(duì)于頜面部軟骨組織的缺損修復(fù)，傳統(tǒng)的手術(shù)方法往往造成明顯的創(chuàng)傷和疤痕[6]?，F(xiàn)有的方法是將種子細(xì)胞負(fù)載于支架材料并加入相應(yīng)細(xì)胞因子，采用組織工程的方法來(lái)改善和提高新生軟骨的特性[2]。目前的支架材料雖然具有良好的生物降解性和生物活性，但卻無(wú)法有效地實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)修復(fù)。

前期研究發(fā)現(xiàn)將成膜培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞制備成CB并與PRP混合后，再將擴(kuò)增培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞負(fù)載至其中，形成的“軟骨細(xì)胞- CB- PRP”復(fù)合體可通過(guò)注射的方式實(shí)現(xiàn)軟骨組織的再生[2];為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法并減少軟骨細(xì)胞的用量,用單純擴(kuò)增的BMSCs取代軟骨細(xì)胞，構(gòu)建出“BMSCs- CB- PRP”復(fù)合體，成功實(shí)現(xiàn)軟骨組織再生，并能夠有效改善復(fù)合體中央的血流灌注情況[3]。該復(fù)合體能夠在體內(nèi)形成軟骨發(fā)育的微環(huán)境，通過(guò)啟動(dòng)機(jī)體自身的愈合機(jī)制進(jìn)而形成軟骨組織，在保證移植物具有足夠機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)，又確保其具有良好的塑形性和可注射性以滿足頜面部軟骨組織不同形態(tài)缺損的微創(chuàng)修復(fù)[4，7]。BMSCs雖然作為經(jīng)典的種子細(xì)胞在軟骨缺損修復(fù)領(lǐng)域被大量研究，但是其取材困難、細(xì)胞數(shù)量相對(duì)有限和分化能力隨年齡退化等弊端往往阻礙其實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化。

Zuk等[5，8]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs同樣具有形成軟骨樣基質(zhì)的能力。ADSCs不僅具備軟骨向分化的能力，而且在人體中含量更豐富、獲取更容易、隨年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)分化能力退化的程度更為緩慢[9-10]。因此本研究把ADSCs負(fù)載于CB- PRP復(fù)合體，探索其作為種子細(xì)胞實(shí)現(xiàn)頜面部軟骨組織微創(chuàng)修復(fù)的可行性。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)約15 d的培養(yǎng)，組織學(xué)結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞不僅可以貼壁生長(zhǎng)，還可以在垂直方向上通過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積實(shí)現(xiàn)CB在厚度上的增加，大量的糖胺多糖被分泌至細(xì)胞外參與了細(xì)胞外基質(zhì)的形成。CB中包含有大量的軟骨細(xì)胞和豐富的細(xì)胞外基質(zhì)。激活后，CB- PRP復(fù)合體形成的凝膠樣結(jié)構(gòu)具有高度的可塑性，可將干細(xì)胞穩(wěn)定負(fù)載于其中。ADSCs- CB- PRP和BMSCs- CB- PRP 2 組復(fù)合體經(jīng)過(guò)體內(nèi)12 周的生長(zhǎng)均能夠完成組織重塑，并與機(jī)體實(shí)現(xiàn)融合。2 組復(fù)合體均具呈現(xiàn)良好的軟骨樣形態(tài)，無(wú)明顯吸收和變形。組織學(xué)結(jié)果顯示，2 組復(fù)合體均呈現(xiàn)軟骨組織的典型組織學(xué)表現(xiàn)并有新生的軟骨細(xì)胞形成。對(duì)Safranin- O和TB染色陽(yáng)性區(qū)域面積百分比進(jìn)行定量分析顯示，ADSCs- CB- PRP組較BMSCs- CB- PRP組形成了更多的軟骨組織，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，我們認(rèn)為ADSCs可以作為一種理想的種子細(xì)胞應(yīng)用于可注射性細(xì)胞磚技術(shù)中，ADSCs- CB- PRP復(fù)合體能夠在動(dòng)物體內(nèi)形成具有良好形態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度和軟骨表型的新生組織工程軟骨。

ADSCs的引入推進(jìn)了可注射性細(xì)胞磚技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化，為其在頜面部微創(chuàng)軟骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的方法和途徑。不過(guò)，如何再進(jìn)一步減少軟骨細(xì)胞的用量和培養(yǎng)的難度則需更多的研究去探索。此外，復(fù)合體內(nèi)新生軟骨細(xì)胞的來(lái)源，ADSCs的最終去向及其軟骨形成機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究和探討。