美拉德反應(yīng)提高羊骨膠原肽抗氧化活性研究

楊璐，程稚玲，霍乃蕊

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801； 2.山西省農(nóng)業(yè)科技信息中心，山西 太原 030000；3.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太原 030801)

美拉德反應(yīng)提高羊骨膠原肽抗氧化活性研究

楊璐1，程稚玲2，霍乃蕊3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801； 2.山西省農(nóng)業(yè)科技信息中心，山西 太原 030000；3.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太原 030801)

[目的]確定還原糖種類和反應(yīng)條件，通過美拉德反應(yīng)提高羊骨膠原肽的抗氧化活性。[方法]研究各因素對反應(yīng)產(chǎn)物還原力的影響，以響應(yīng)面法進行數(shù)學建模，優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件；用鐵氰化鉀還原法測定還原力時，以膠原肽液(60 g·L-1)調(diào)節(jié)零點，結(jié)果以吸光度值表示。[結(jié)果]木糖作為修飾物時美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力顯著高于葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖(P<0.01)。羊骨膠原肽與木糖在所得最優(yōu)條件下反應(yīng)，即木糖與骨膠原肽質(zhì)量比為3∶1、反應(yīng)初始pH為12、100 ℃反應(yīng)3.5 h，反應(yīng)產(chǎn)物的還原力接近于預測值，高達0.810 2。[結(jié)論]美拉德反應(yīng)是提高羊骨膠原肽抗氧化活性的一種有效方法。

美拉德反應(yīng)； 羊骨膠原肽； 還原力

美拉德反應(yīng)是氨基化合物(氨基酸、肽和蛋白質(zhì))與羧基化合物(糖類)發(fā)生的一種羧氨反應(yīng)。該反應(yīng)不僅賦予食品特殊的色澤及氣味，還有大量研究證實其產(chǎn)物具有抗氧化、抗誘變、抗病毒等特性[1]。多肽本身就具有一定的抗氧化活性，但通過美拉德反應(yīng)可使其抗氧化活性進一步增強，研究者已用此法制備了抗氧化活性更強的灰樹花多肽[2]、乳清蛋白肽[3]、黑蒜[4]、馬氏珠母貝肉[5]和珍珠蚌抗氧化活性多肽[6]，且反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性好，適合各類食品加工。

羊骨經(jīng)過水解制備的骨膠原短肽不僅生物利用度大大提高[7,8]，且具備了抗氧化活性[9]，目前研究者多用提高水解度和短肽得率的方法提高其抗氧化活性，通過美拉德反應(yīng)提高其抗氧化活性的研究甚少。本研究將以羊骨膠原肽為底物，選擇合適的還原糖與其進行反應(yīng)，確定最優(yōu)反應(yīng)條件，制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物來提高其抗氧化活性[10]，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 原料與試劑

羊骨膠原肽粉由內(nèi)蒙古錫林郭勒盟鑫泰生物制品責任有限公司生產(chǎn)，經(jīng)實際測定，其中的蛋白質(zhì)含量為98.78%，活性低聚肽含量為96.23%，分子量分布在1 000道爾頓以下的肽占90.78%，羥脯氨酸占6.89%，灰分2.87%。

木糖購于Biotopped；葡萄糖購于天津風船化學試劑科技有限公司；乳糖購于天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；麥芽糖購于沈陽市試劑三廠；半乳糖購于天大化工實驗廠；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵均為分析純。

1.2 儀器

PSH-3型pH計(上海佑科儀器儀表有限公司)；722G型可見分光光度計(上海精密儀器有限公司)等。

2 試驗方法

2.1 制備工藝

以一定糖肽比將還原糖與羊骨膠原肽溶液混合，調(diào)pH，在設(shè)定水浴溫度下反應(yīng)一段時間，反應(yīng)液冷卻后5 000 r·min-1離心15 min，取上清液測定還原力。最優(yōu)工藝下制備的反應(yīng)產(chǎn)物于50 ℃烘箱中烘干，4 ℃冷藏備用。

2.2 單因素試驗

將木糖與羊骨膠原肽(60 g·L-1)按照1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1的比例混合，調(diào)節(jié)pH值為6，50 ℃水浴反應(yīng)3 h后終止反應(yīng)，離心取上清液測定還原力，確定用于響應(yīng)面試驗的糖肽比；糖肽比為3∶1，調(diào)pH值為6、7、8、9、10、11、12、13，50 ℃反應(yīng)3 h后測定還原力，確定pH；糖肽比為3∶1，pH 12， 50 ℃分別反應(yīng)0、0.5、1.5、2.5、3.5和4.5 h，確定反應(yīng)時間。調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度60、70、80、90、100 ℃，其他條件同上，反應(yīng)3.5 h，測定還原力，確定反應(yīng)溫度。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計及試驗

在單因素的基礎(chǔ)上，以還原力(Y)為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計試驗(表1)進行美拉德反應(yīng)。3因素分別是反應(yīng)時間(A)、pH(B)、糖肽比(C)，其(-1、0、+1)水平分別為：A(2.5 h、3.5 h、4.5 h)，B(11、12、13)，C(2、3、4)，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

2.4 還原力的測定

鐵氰化鉀還原法[11]：在1 mL的樣品中加入2.5 mL的0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴20 min后加入10%的三氯乙酸2.5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取2.5 mL上清液加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min。以60 g·L-1膠原肽液調(diào)零，在700 nm波長處測定吸光度OD值。OD值越高表示樣品的還原力越大。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SigmaPlot 10軟件進行單因素分析、MiniTab16軟件進行回歸分析、Statistix 8.1進行差異顯著性分析、Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 還原糖種類對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原力的影響

由圖1可見，木糖的還原力可達到0.259 8，與麥芽糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖的還原力相比差異極顯著(p<0.01)，所以本研究選用木糖對羊骨膠原肽進行修飾，與其進行美拉德反應(yīng)。

圖1 糖種類對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原力的影響Fig.1 Effect of reductive sugars on reducing power of Maillard Reaction products

3.2 單因素試驗結(jié)果

由圖2A可知，糖肽比由1∶2增加到3∶1的過程中，OD值呈上升趨勢，隨后隨著糖肽比由3∶1到4∶1，OD值沒有明顯的增加，而是趨于平緩。圖2B和2C可看出，隨著pH從6升高到12，反應(yīng)時間從0上升到3.5 h，OD值均呈上升趨勢；而pH由12到13，反應(yīng)時間由3.5 h增加到4.5 h時OD值開始下降。所以可看出當糖肽比達到3∶1、pH為12、反應(yīng)時間為3.5 h時，OD值達到最大值。而隨著反應(yīng)溫度的升高，還原力如圖2D所示呈上升的趨勢，在受試的溫度范圍內(nèi)，100℃時還原力最大，表明在常壓下，溫度越高美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性越強[12]，由此確定最佳反應(yīng)溫度為100 ℃。所以選擇各因素的上述條件作為響應(yīng)面試驗的0水平。

圖2 糖肽質(zhì)量比、pH、反應(yīng)時間和溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原力的影響Fig.2 Effect of ratio of peptide to xylose, pH value, reaction time and temperature on reducing power of Maillard Reaction products 注：固定因素水平為糖肽質(zhì)量比3∶1、pH12、反應(yīng)時間3.5 h、溫度100 ℃。Note:fixed level of ratio of peptide to xylose is 3∶1, pH value 12, reaction time 3.5 hours,temperature 100 ℃

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計結(jié)果與分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表1的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程為：

Y=0.80+(9.167E-004)A+0.070B+0.056C+(9.417E-003)AB-(9.167E-004)AC+0.025BC-0.098A2-0.23B2-0.040C2

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果

注：*：p<0.05，差異顯著；**：p<0.01，差異極顯著。

Note : * and ** indicated significance at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3.4 響應(yīng)面分析圖

通過上述回歸方程所做兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖曲面及等高線圖(圖3)可知，A、B、C對還原力的影響均表現(xiàn)為先上升后下降。

3.5 工藝參數(shù)優(yōu)化及驗證實驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件計算得到最佳制備參數(shù)為：pH值為12.20，加熱時間為3.51 h，溫度為100 ℃，糖肽比為3.77，此時的還原力預測值為0.825 113。

考慮到實際操作，將羊骨膠原肽-木糖抗氧化美拉德產(chǎn)物的制備工藝調(diào)整為：pH值為12，加熱時間為3.5 h，溫度為100 ℃，糖肽比為3。經(jīng)驗證，在此條件下羊骨膠原肽的還原力為0.810 2，與預測值0.825 113相比，相對誤差較小，說明響應(yīng)面法優(yōu)化具有必要性。因此，基于響應(yīng)面法所得的的優(yōu)化工藝參數(shù)具有參考的價值。

4 討論

美拉德反應(yīng)不僅可以使食品呈現(xiàn)更好的色香味，還會生成具有抗氧化活性的天然物質(zhì)蛋白黑素[13]及中間產(chǎn)物還原酮和揮發(fā)性雜環(huán)化合物[14]。而美拉德反產(chǎn)物是食品加工和貯藏過程中自身產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，這使其成為天然的抗氧化劑[15]。肽則是很重要的食品配料之一，其具有獨特的呈味性，并且有著良好的溶解性、吸收性和抗氧化性，已廣泛用于多種食品的加工及調(diào)味中。

化學合成抗氧化劑丁基羥基茴香醚(BHA)的出現(xiàn)推動了食品工業(yè)的發(fā)展，由于其產(chǎn)量大、價格低、抗氧化能力較強，作為食品添加劑更是壟斷了抗氧化劑市場[16]。然而不斷有人對合成抗氧化劑的安全性提出質(zhì)疑，越來越多的研究表明，人工合成抗氧化劑的確具有一定毒性并有致癌作用[17]。所以開發(fā)新的、安全的、可替代BHA的抗氧化劑十分必要。作為美拉德反應(yīng)的重要前體物質(zhì)，肽能夠與糖經(jīng)加熱處理形成獨特的風味，增強食品風味的同時還能提高食品的抗氧化性，甚至可與BHT相媲美[18]，但在此過程中可能有潛在的不利因素產(chǎn)生，因此本研究的產(chǎn)物還有待進一步完善。

圖3 兩因素交互作用對還原力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the effect of reducing power

本研究使用的羊骨膠原肽，其中的分子量小于1 000道爾頓以下的肽占90.78%，分子量越小，肽的抗氧化化活性及其它活性就越強[19]。在進行還原力測定時，本研究以此未發(fā)生美拉德反應(yīng)的羊骨膠原肽的OD值設(shè)為0，在最優(yōu)工藝下制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物OD值高達0.810 2，可見其抗氧化活性進一步大幅提升,有望作為BHA的替代品，用于食品工業(yè)。

5 結(jié)論

采用Design-Expert 軟件在單因素試驗的基礎(chǔ)上建立數(shù)學模型。方差分析結(jié)果表明糖肽比、pH、反應(yīng)時間和溫度均對還原力有影響。結(jié)合響應(yīng)面分析結(jié)果和實際情況預測并驗證，得到羊骨膠原肽-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物制備的最佳工藝條件為：糖肽比3∶1，pH值12、加熱時間3.5 h 、反應(yīng)溫度100 ℃ 。在此條件下羊骨膠原肽的還原力(設(shè)置為0)提高到0.810 2。

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(編輯：馬榮博)

Improving of the antioxidant activity of ovine ossein peptide by Maillard Reaction

Yang Lu1, Cheng Zhiling2, Huo Nairui3*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu0308011,China; 2.ShanxiAgriculturalScienceandTechnologyInformationCenter,Taiyuan030000,China; 3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]The suitable reductive sugar and reaction conditions were determined in this study to improve the antioxidative ability of ovine ossein peptides by Maillard Reaction.[Methods]Based on the effect of the related factors on the reductive power, the responsive surface analysis was used to establish the mathematical models to optimize the conditions for Maillard Reaction. The reductive power was expressed by OD value and determined by the reductive method of potassium ferricyanide during which the 0 point was set by 60 g·L-1ossein peptide solution.[Results]The reductive power the resulted reaction product using xylose as decorative sugar was significantly higher than using glucose, lactose, galactose and maltose (P<0.01).The optimum condition was determined as the mass ratio of xylose to peptide was 3 to 1, the initial pH was 12, react for 3.5 h at 100 ℃，under this technology, the reductive power of the product reached to 0.810 2 which is approximately close to the predicted value of the mathematical model.[Conclusion]Maillard Reaction is an effective method to improve the antioxidative activity of ovine ossein peptide.

Maillard Reaction， Ovine ossein peptide， Reducing power

2016-08-13

2016-11-07

楊璐(1993-)，女(漢族)，山西懷仁人，在讀研究生，研究方向：食品生物技術(shù)

*通信作者：霍乃蕊，教授，碩士生導師。Tel:0354-6289236,E-mail：tgnrhuo@163.com

國家自然科學基金(31201347);山西省留辦留學回國人員資助項目(2014-042)

TS251.94

A

1671-8151(2017)02-0115-06