17β雌二醇刺激農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化PCR-DGGE指紋分析

田 琳, 張 珣(沈陽(yáng)大學(xué) a. 環(huán)境學(xué)院; b. 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng) 110044)

17β雌二醇刺激農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化PCR-DGGE指紋分析

田 琳a,b, 張 珣a,b
(沈陽(yáng)大學(xué) a. 環(huán)境學(xué)院; b. 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng) 110044)

采用PCR-DGGE技術(shù)分析在不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和暴露時(shí)間下17β雌二醇刺激農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化.結(jié)果表明,在暴露期間內(nèi),有部分細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制.部分細(xì)菌的數(shù)量隨著雌二醇濃度或暴露時(shí)間的增加而減少,而部分細(xì)菌則在雌二醇的影響下被富集,表現(xiàn)在DGGE 條帶由淺變深.雌二醇污染的農(nóng)田土壤樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大的變化, 200 ng/kg雌二醇刺激下的農(nóng)田土壤樣品中微生物群落多樣性指數(shù)明顯大于另外兩組;100 ng/kg雌二醇刺激下農(nóng)田土壤的微生物多樣性指數(shù)隨著暴露時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì);300 ng/kg實(shí)驗(yàn)組多樣性指數(shù)則變現(xiàn)為相似的平緩增長(zhǎng)趨勢(shì).研究發(fā)現(xiàn),適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)的雌二醇能夠增加農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性.

17β雌二醇; 農(nóng)田土壤; 微生物群落結(jié)構(gòu); PCR-DGGE

環(huán)境雌激素,又稱(chēng)為“內(nèi)分泌干擾物”,由于其在環(huán)境中具有危害性、持久性、生物蓄積性和易遠(yuǎn)距離遷移的特性,在2002年簽署的《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》中,第一次頒布了關(guān)于12種持久性有機(jī)污染物的禁令,其中的環(huán)境激素類(lèi)物質(zhì)也明令禁止使用.雌二醇,一般是指雌二醇的17-β-異構(gòu)體,類(lèi)固醇基團(tuán)和羥基分別位于芳香環(huán)的C18和3-β-、17-β-位置.雌二醇是天然類(lèi)固醇雌激素中雌激素活性最大的物質(zhì).研究表明,17β-雌二醇是內(nèi)分泌失調(diào)的一個(gè)公認(rèn)的指標(biāo),廢水痕量的情況下它就可以使雄魚(yú)產(chǎn)生卵黃蛋白原,此雌二醇是指天然雌激素而非具有雌激素活性的化學(xué)工業(yè)合成物質(zhì)[1].

環(huán)境雌二醇有兩個(gè)重要的來(lái)源:污水處理廠和禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)[2-3].雌二醇可以通過(guò)市政污泥、畜禽糞便或家禽糞便施肥轉(zhuǎn)移進(jìn)入農(nóng)田土壤.目前已發(fā)現(xiàn),垃圾中雌二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在14～904 μg/kg干重[4-5].污水處理廠中排放的雌二醇被認(rèn)為負(fù)責(zé)或促進(jìn)一些野生魚(yú)類(lèi)出現(xiàn)的女性化應(yīng)答[6-7].質(zhì)量濃度在10～100 ng/L的雌二醇會(huì)影響鱒魚(yú)的正常發(fā)展[8].研究發(fā)現(xiàn),河水中E2的質(zhì)量濃度范圍為0.1～0.57 pg/mL,人體尿液中E2的質(zhì)量濃度范圍為0.75～135 μg/mL[9].

中國(guó)是一個(gè)經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng)的國(guó)家,擁有豐富的人口和動(dòng)物,每天都會(huì)有大量的天然雌激素排放到環(huán)境中,應(yīng)該更加注重雌激素污染.2007年中國(guó)的天然類(lèi)固醇雌激素的總排放量大約高達(dá)10.6 t[10].研究人員于2007年6月在天津地區(qū)的北塘河、大沽河和永定新河中采集水樣,經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)水樣中17β-雌二醇的質(zhì)量濃度分別在2.51～21.2、0.93～32.4和最高值檢測(cè)到13.6 ng/L,平均質(zhì)量濃度分別為8.69、10.3和7.26 ng/L[11].

研究人員發(fā)現(xiàn)在E2質(zhì)量濃度低至1 ng/L時(shí)雄魚(yú)就會(huì)產(chǎn)生卵黃蛋白原 (VTG)[12-13].研究人員在悉尼馬拉巴爾的一個(gè)大型沿海一級(jí)污水處理廠的排放點(diǎn)附近采集海洋表層土壤樣本,經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其雌二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.22～2.48 ng/g之間[14].阿肯色州喀斯特地貌覆蓋下的含水層中的5個(gè)溫泉水中雌二醇質(zhì)量濃度在6～66 ng/L[15].研究發(fā)現(xiàn)雌二醇可以損害劍尾魚(yú)的睪丸和肝組織,且暴露時(shí)間越長(zhǎng),損害越嚴(yán)重[16].

17β-雌二醇可以通過(guò)食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)中富集,最終累積于機(jī)體內(nèi)的脂肪組織中,以形成一個(gè)長(zhǎng)期毒性作用.位于意大利北部的馬焦雷湖和加爾達(dá)湖中的鳳頭鸊鷉 (Podiceps critatus)蛋液經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含有雌二醇,且雌二醇的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 2.70和4.36 ng/g干重[17].雌二醇的代謝產(chǎn)物具有遺傳毒性,并促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[18].研究表明,17β-雌二醇與男性生殖系統(tǒng)紊亂和精子數(shù)減少、睪丸癌、 前列腺癌和乳腺癌的發(fā)病率的增加有直接關(guān)系[19].

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,從濃度和暴露時(shí)間方面探討雌二醇對(duì)農(nóng)田土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響.PCR技術(shù)利用細(xì)菌中進(jìn)化保守區(qū)域內(nèi)特定引物擴(kuò)增農(nóng)田土壤微生物群落的目標(biāo)16S rDNA 基因,DGGE指紋技術(shù)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多樣性.

1 材料與方法

1.1 土壤前處理

土壤樣本采自于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田土壤.該土壤常年種植水稻,并未施用畜禽糞便或者污水.農(nóng)田土壤樣本過(guò)2 mm篩子以去除石粒、植物殘?bào)w和動(dòng)物殘骸.農(nóng)田土壤樣品中有機(jī)質(zhì)含量和總氮含量分別用K2Cr2O4和消化蒸餾的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定[20].使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定農(nóng)田土壤樣品中速效K和有效P的含量[21].農(nóng)田土壤樣品的pH值由PHS-3C pH計(jì)在土壤與水溶液比為1 g土壤加2.5 mL水的水懸浮液中測(cè)得.表1列出了農(nóng)田土壤樣品的一些物理和化學(xué)性質(zhì).

表1 農(nóng)田土壤樣品的主要理化性質(zhì)Table 1 Main physical and chemical properties of agricultural soil samples

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)的主要裝置為塑料盒,其長(zhǎng)度、寬度和高度分別為490、350和160 mm.將15 kg的農(nóng)田土壤裝入塑料盒,500 mL不同濃度的雌二醇溶液分別加入到各塑料盒中,最后使得各裝置的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100、200和300 ng/kg,室溫培養(yǎng).通過(guò)攪拌器使各溶液與農(nóng)田土壤樣品混合,以確保所有的農(nóng)田土壤樣品充分混合.每個(gè)塑料盒每次收集20 mg再次充分混合的土壤樣品,重復(fù)三次,暴露時(shí)間分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 d.將樣品保存在-80 ℃用于分子生物學(xué)分析.

1.3 土壤中DNA提取與PCR-DGGE分析

本實(shí)驗(yàn)使用E.Z.N.ATM Soil DNA Kit試劑盒(美國(guó)OMEGA公司)提取農(nóng)田土壤樣品中的總DNA,用瓊脂糖凝膠(按1 g瓊脂糖粉與100 mL TAE緩沖液配制)電泳檢測(cè)其提取結(jié)果[22].總DNA保存于-20 ℃冰箱中.

PCR的擴(kuò)增區(qū)域是細(xì)菌16S rDNA的V3可變區(qū),選用引物對(duì)338F和518R.選用的上游引物P1(5’端連接GC夾)為GC-338F(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)和下游引物P2為518R(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)[23],直接對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系為:模板DNA 0.1 μL,引物P1和P2各0.75 μL,2×GoTaq buffer25 μL, 無(wú)核酸酶水23.4 μL.PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,65 ℃退火1 min(每個(gè)循環(huán)降低1 ℃),72 ℃延伸1 min,一共10個(gè)循環(huán);然后94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠(按2 g瓊脂糖粉與100 mL TAE緩沖液配制)電泳進(jìn)行驗(yàn)證.所有的PCR產(chǎn)物約240 bp,可進(jìn)行DGGE分析.

DGGE實(shí)驗(yàn)按照Webster等方法進(jìn)行并適當(dāng)修改[24].PCR 產(chǎn)物分離使用 DCodeTM 通用突變檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad,Dcode,USA.)進(jìn)行DGGE電泳分析.DGGE電泳聚丙烯酰胺凝膠(按8 g聚丙烯酰胺與100 mL TAE緩沖液配制),變性劑梯度為35%～65%.電泳電壓為150 V,電泳溫度為60 ℃,緩沖體系是1×TAE緩沖液,電泳時(shí)間為7.5 h.電泳后,將凝膠用EB(溴化乙錠)染色30 min并在紫外光下觀察.為獲得清晰的圖像,將使用凝膠照片系統(tǒng)(GelDoc,Bio-Rad,USA.)進(jìn)行拍照.

1.4 DGGE圖譜分析

使用Quantity one圖像分析軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析(4.0版本,Bio-Rad,USA.).該軟件能夠識(shí)別同一個(gè)凝膠不同泳道上占據(jù)相同位置的條帶.兩個(gè)樣本的相似性可以通過(guò)戴斯系數(shù)(Cs)條帶模式進(jìn)行估測(cè)(式(1)):

其中,j為兩條DGGE泳道中共有的條帶數(shù),a和b分別為兩條DGGE泳道各自的條帶數(shù)量.用非加權(quán)平均法(UPGMA)檢驗(yàn)農(nóng)田土壤樣品的相似性.

基于DGGE條帶數(shù)據(jù)而進(jìn)行的香農(nóng)-威納指數(shù)(H′),豐富度(S)和均勻度(E)的計(jì)算比較了細(xì)菌多樣性的變化.H′計(jì)算公式如下(式(2)):

pi為指i條帶出現(xiàn)在一條泳道中的概率;S為一條凝膠泳道的總條帶數(shù);E計(jì)算方法為H′/lnS.

2 結(jié)果與討論

2.1 雌二醇對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100、200、300 ng/ kg時(shí)各個(gè)不同的時(shí)間段的細(xì)菌的16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物DGGE電泳圖譜如圖1,暴露時(shí)間分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 d.在分離圖譜中,每個(gè)可以區(qū)分的條帶都代表一個(gè)獨(dú)立的細(xì)菌種群[25].如圖1所示,雌激素刺激農(nóng)田土壤樣品中某些細(xì)菌種群的生長(zhǎng).例如,條帶1到條帶3在DGGE凝膠圖譜中的顏色由背景色變成所有土壤樣本中的深色.在雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200 ng/kg的DGGE凝膠圖譜中,條帶5和條帶6變?yōu)檗r(nóng)田土壤樣品條帶中的深色條帶.然而,當(dāng)雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 ng/kg時(shí),對(duì)微生物種群的危害性加大.條帶4和條帶8在暴露前期被促進(jìn)生長(zhǎng),但隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng),在暴露的后期其生長(zhǎng)受到抑制.條帶7是雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 ng/kg的農(nóng)田土壤樣品暴露后期出現(xiàn)的.

2.2 相似性分析

圖2是不同雌二醇濃度下不同暴露時(shí)間的農(nóng)田土壤樣本與原始土壤樣本的戴斯系數(shù).與初始農(nóng)田土壤樣品相比,在第一個(gè)5 d內(nèi),由于剛加入17β-雌二醇,土壤微生物群落原始平衡被破壞,雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 ng/kg的土壤樣本的戴斯系數(shù)下降了60.1%,為200 ng/kg的土壤樣本的戴斯系數(shù)下降了52.8%,為300 ng/kg的土壤樣本的戴斯系數(shù)下降了43.1%.為200 ng/kg的農(nóng)田土壤樣本在第一個(gè)5 d之后,隨著暴露時(shí)間的增加,戴斯系數(shù)的變化很大.暴露時(shí)間為40 d時(shí),雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200 ng/kg的農(nóng)田土樣的戴斯系數(shù)僅為32.2%.暴露時(shí)間為25 d時(shí),雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 ng/kg的農(nóng)田土壤樣品的戴斯系數(shù)與初始樣品只有29.9%的相似性.隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng),不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下土壤樣品的戴斯系數(shù)均表現(xiàn)出下降趨勢(shì),200 ng/kg的農(nóng)田土樣其戴斯系數(shù)下降趨勢(shì)最迅速.不同雌激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的農(nóng)田土壤樣品,其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖譜有著顯著差異(圖3).圖中1～13號(hào)分別代表暴露時(shí)間為0～60 d.在雌二醇刺激的農(nóng)田土壤樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很大程度的變化,特別是雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 ng/kg的農(nóng)田土壤樣品.結(jié)果表明,雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高,對(duì)微生物種群的影響越深,種群的親緣關(guān)系也就越復(fù)雜.雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 ng/kg農(nóng)田土樣的微生物群落分布呈現(xiàn)出一個(gè)復(fù)雜的遺傳相似性,這可能與高濃度的雌激素有關(guān),又或者受到次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響.雌二醇可以在轉(zhuǎn)變?yōu)榇仆?、雌三醇以及在微生物作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)的E2-3G和E1-3G(G是葡萄糖苷酸),作為次級(jí)代謝物,這些物質(zhì)對(duì)原有的土壤微生物種群可能產(chǎn)生不同程度的脅迫作用.在次級(jí)代謝產(chǎn)物的選擇作用下,一些微生物種群生長(zhǎng)受到抑制,而一些微生物種群則發(fā)生改變,進(jìn)而存活下來(lái).

圖1 農(nóng)田土壤在不同雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同暴露時(shí)間細(xì)菌16S rDNA的DGGE分析Fig.1 DGGE analysis of bacterial 16S rDNA genes from agricultural soil samples with different mass fraction of estradiol at different culture times

圖2 不同雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同暴露時(shí)間下農(nóng)田土樣微生物群落的戴斯系數(shù)Fig.2 Dice coefficient of microbial communities for agricultural soil samples with different mass fraction of estradiol at different exposure duration

2.3 多樣性分析

多樣性指數(shù)能夠有效的表征微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性.香農(nóng)-維納指數(shù)越高,微生物群落的多樣性越大.除香農(nóng)-維納指數(shù)外,豐富度和均勻度也是多樣性指數(shù)表征的重要參數(shù):物種的總數(shù)即物種豐富度(S),不同物種個(gè)體數(shù)量的分布即物種均勻度(E).

雌二醇污染農(nóng)田土壤樣本中微生物群落的多樣性指數(shù)如表2所示.在暴露前,原農(nóng)田土壤的H′在3.419～3.420,S在39～40,E在0.901～0.902.在污染之前, 農(nóng)田土壤系統(tǒng)具有穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)和活性,同時(shí)具有基本的同質(zhì)性.雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 ng/kg時(shí)農(nóng)田土壤多樣性在暴露前期明顯高于200和300 ng/kg時(shí)的多樣性,但雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 ng/kg的農(nóng)田土壤的多樣性隨著暴露時(shí)間的增加總體呈下降趨勢(shì).而雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200和300 ng/kg的農(nóng)田土壤的多樣性隨著時(shí)間的推移有類(lèi)似的變化趨勢(shì),總體趨勢(shì)在逐步增長(zhǎng).縱向?qū)Ρ缺┞稌r(shí)間,暴露第一個(gè)5 d后,其多樣性指數(shù)都開(kāi)始增加.雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200 ng/kg在第45 d時(shí),其多樣性指數(shù)、豐度、均勻度都達(dá)到最大.雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 ng/kg時(shí),土壤在第10 d與第35 d時(shí)其多樣性指數(shù)與豐度相近,但是第35 d的均勻度高于第10 d時(shí),說(shuō)明此時(shí)微生物群落相比前期穩(wěn)定.在暴露前55 d,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 ng/kg的土壤其多樣性指數(shù)、豐度、 均勻度都低于100和200 ng/kg雌二醇時(shí)的值,說(shuō)明在暴露前55 d高質(zhì)量分?jǐn)?shù)雌二醇對(duì)微生物群落多樣性的影響高于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)雌二醇.暴露60 d時(shí)其多樣性指數(shù)與豐富度都達(dá)到最大值,造成該現(xiàn)象的原因可能是,出現(xiàn)可以有效抗雌二醇、降解雌二醇或同時(shí)可以降解次生代謝產(chǎn)物的新物種,極大地豐富了雌二醇污染農(nóng)田土壤的微環(huán)境.橫向?qū)Ρ炔煌珽2濃度發(fā)現(xiàn),質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200 ng/kg的農(nóng)田土壤中微生物群落多樣性指數(shù)明顯大于另外兩組.這表明,在一定范圍內(nèi),微生物群落多樣性隨著雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大,超過(guò)一定值其多樣性則會(huì)受到抑制,而隨著時(shí)間的推移,新適應(yīng)性物種的出現(xiàn)則會(huì)打破這種抑制作用.結(jié)果還表明,抗雌二醇和可以有效降解雌二醇的新物種可以在雌二醇污染土壤中富集.隨著暴露時(shí)間的增加,一些微生物物種數(shù)迅速增加,同時(shí)有一些有物種被抑制.雌二醇可以在轉(zhuǎn)變?yōu)榇仆?、雌三醇以及在微生物作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)的E2-3G和E1-3G(G是葡萄糖苷酸),這種相互轉(zhuǎn)變也會(huì)給微生物菌群多樣性帶來(lái)更加復(fù)雜的變化,原有優(yōu)勢(shì)種可能在這種雌激素的互相轉(zhuǎn)變過(guò)程中逐漸被抑制.

圖3 不同雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同暴露時(shí)間農(nóng)田土樣的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 System developmental evolutionary tree for agricultural soil samples with different mass fraction of estradiol at different exposure duration

表2 不同雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)刺激農(nóng)田土壤的微生物群落多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of microbial communities in groups with different mass fraction of estradiol

3 結(jié) 論

PCR-DGGE指紋技術(shù)可以有效分析雌二醇污染農(nóng)田土壤樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化.雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和暴露時(shí)間的變化能夠?qū)ξ⑸锏幕钚院凸δ墚a(chǎn)生影響,進(jìn)而造成微生物群落變化.

(1) 經(jīng)戴斯系數(shù)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖譜分析可知,雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高,對(duì)微生物種群的影響越深,種群的親緣關(guān)系也就越復(fù)雜.

(2) 經(jīng)不同暴露時(shí)間與不同雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)微生物群落多樣性指數(shù)對(duì)比分析可知,在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi),微生物群落多樣性隨著雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大,超過(guò)某一質(zhì)量分?jǐn)?shù)值其多樣性則會(huì)受到抑制,而隨著暴露時(shí)間的推移,新適應(yīng)性物種的出現(xiàn)則會(huì)打破這種抑制作用.

(3) 雌二醇可以轉(zhuǎn)變?yōu)榇仆?、雌三醇以及結(jié)合態(tài)的E2-3G和E1-3G,這種相互轉(zhuǎn)變也會(huì)給微生物菌群多樣性帶來(lái)更加復(fù)雜的變化.

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【責(zé)任編輯: 胡天慧】

Analysis of Effect of Estradiol on Microbial Community Structure in Agricultural Soil Using PCR-DGGE Fingerprinting

TianLina,b,ZhangXuna,b

(a. College of Environment, b. Key Laboratory of Regional Environment and Eco-Remediation (Ministry of Education), Shenyang University, Shenyang 110044, China)

The polymerase chain reaction (PCR) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) method is used to analyze the variation of the microbial community structure in estradiol-contaminated agricultural soil samples with different mass fraction and time of exposure. The results demonstrate that the growth of some bacterial species in the estradiol-contaminated agricultural soil samples is inhibited during the exposure. The number of some bacteria decreases with the increase of estradiol concentration or time of exposure, while other bacteria are enriched under the effect of estradiol, and their DGGE bands change from undertones to deep colors. The microbial community structure, however, show a wide variation in the estradiol contaminated agricultural soil samples, especially in the agricultural soil samples treated with estradiol concentration of 200 ng/kg. The diversity indices of microbial community with concentration of 200 ng/kg are greater than those of another two groups. Diversity indices show that the contaminated group of 100 ng/kg is decreased with the increase of exposure time, while the contaminated groups of 200 ng/kg and 300 ng/kg have a similar moderate growth trend over time. It is found that suitable mass fraction of estradiol could increase the diversity of the microbial community in the agricultural soil.

17β-estradiol; agricultural soil; microbial community structure; PCR-DGGE

2016-09-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41472237); 遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(LJQ2015077); 遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃資助項(xiàng)目(201602530).

田 琳(1991-),女,山西長(zhǎng)治人,沈陽(yáng)大學(xué)碩士研究生.

2095-5456(2017)01-0014-07

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