PCR實(shí)驗(yàn)室的污染與對策

阮艷秋

四川省自貢市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 四川自貢 643000

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染與對策

阮艷秋

四川省自貢市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 四川自貢 643000

目的:探討PCR實(shí)驗(yàn)室防止和處理污染的辦法, 方法:從PCR技術(shù)對環(huán)境的要求和污染的3個(gè)來源分析污染的原因，提出應(yīng)采取的控制方法和預(yù)防措施。結(jié)果：有效防止實(shí)驗(yàn)室污染，結(jié)論；PCR技術(shù)在不斷發(fā)展，隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，PCR技術(shù)及其污染控制策略將會更加完善。

聚合酶鏈反應(yīng)；污染；控制方法；預(yù)防措施

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是由美國Kary Mullis于1983年發(fā)明的[1]。該技術(shù)通過重復(fù)高溫變性,低溫退火,中溫延伸等簡單的3個(gè)溫度循環(huán),能將靶DNA擴(kuò)增數(shù)百萬倍,獲得極高的檢測敏感性.但令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的結(jié)果[2].如果形成氣溶膠污染而擴(kuò)散,則可引起整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室的污染,處理起來非常麻煩棘手,嚴(yán)重的甚至要關(guān)閉PCR實(shí)驗(yàn)室.我實(shí)驗(yàn)室也曾經(jīng)遭遇過氣溶膠的污染,所幸的是經(jīng)過一段時(shí)間的處理,最終將PCR實(shí)驗(yàn)室污染排除掉了.現(xiàn)將經(jīng)過向大家報(bào)告如下。

1.資料與方法

1.1 檢測對象 本院感染科、內(nèi)外科、婦產(chǎn)科、兒科及門病科患者82例，年齡9～76歲。

1.2 檢測方法和儀器 乙型肝炎病毒的DNA檢測方法，均采用達(dá)安基因公司 PCR-熒光探針法。試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)有 BCJ一 1FD 型潔凈工作臺(上海博迅公司)；標(biāo)本制備區(qū)BSC-1500II-B2-X

型生物安全柜(上海力申公司)、HC-3018高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳公司)、XK96一A4型快速混勻器(姜堰新康儀器廠)、HB-100恒溫金屬浴（博日科技）；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)有FTC-2000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海楓嶺公司)，3個(gè)區(qū)域均備有ZXC-II型紫外線消毒車(上海躍進(jìn)器械廠)。

1.3 標(biāo)本采集 無菌試管采集空腹靜脈血 3mL，按說明書要求分離血清保存。

2 污染的發(fā)現(xiàn)

2013年8月5日,我實(shí)驗(yàn)室按正常的操作規(guī)程檢測HBV標(biāo)本，同時(shí)設(shè)立了陰性對照、陽性對照和質(zhì)控，陰陽性對照均為試劑盒中配備，擴(kuò)增結(jié)束分析結(jié)果時(shí)，發(fā)現(xiàn)HBVDNA所有的標(biāo)本及陰、陽性對照均為陽性，提示操作過程中出現(xiàn)污，但具體是什么原因引起的污染還不清楚。

3.PCR實(shí)驗(yàn)室污染的監(jiān)測和追蹤

出現(xiàn)污染后，我們首先考慮可能是試劑的污染，更換新批號的HBVDNA試劑重新檢測后,結(jié)果仍然為全部標(biāo)本陽性.將HBV標(biāo)本拿到其他正規(guī)的PCR實(shí)驗(yàn)室檢測,結(jié)果標(biāo)

本中陰、陽性結(jié)果都有，陰性對照是陰性，陽性對照是陽性，說明標(biāo)本沒有被污染，

將兩種批號的HBV 試劑拿到其他正規(guī)的PCR實(shí)驗(yàn)室檢測,也顯示試劑沒有問題.

我實(shí)驗(yàn)室用消毒液擦拭工作臺面后,打開所有的紫外燈照射一天,將所使用微量進(jìn)樣器、離心、槍頭進(jìn)行重新消毒；手套、記號、記錄本等都更換掉。再將HBV標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果全部標(biāo)本仍然為陽性。

用消毒液擦拭工作臺面后，打開所有的紫外燈照射一天，將HBV標(biāo)本重新檢測，同時(shí)設(shè)置了5個(gè)陰性對照，①試劑對照：將試劑的反應(yīng)管從試劑盒中拿出，不開蓋子，直接上機(jī)檢；② 環(huán)境取樣：用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源，用1ml去離子水浸泡，再取5ul做PCR實(shí)驗(yàn)。③氣溶膠?？蓪⒁粋€(gè)或多個(gè)空管打開靜置于標(biāo)本制備 10～30分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液，④不加任何試劑和樣本，只有相同體積的水。結(jié)果是全部標(biāo)本和②,③陰性對照為陽性,而①和④陰性對照為陰性。

4. 結(jié)果

基本可以排除試劑和儀器污染。推斷為實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染。后來經(jīng)過調(diào)查，發(fā)現(xiàn)工作人員在操作過程中有一個(gè)強(qiáng)陽性標(biāo)本溢出，污染了生物安全柜未及時(shí)消毒處理所致。

5.污染的排除

在確定了污染的原因后，我們就開始著手排除污染，每天

都打開整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室的門窗和排氣扇,讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)室換氣通風(fēng)，可起到空氣稀釋的作用，有利于 PCR產(chǎn)物留量的減少，加快實(shí)驗(yàn)室污染的排除。用現(xiàn)配的3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液

消毒液擦拭整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室所有可能的污染源：實(shí)驗(yàn)臺面、離心機(jī)、冰箱門把手、可疑器具等等!用消毒液對生物安全柜進(jìn)行噴霧，使氣溶膠沉降后,每天重復(fù)以上操作三至五次，下班后紫外燈通宵照射，一周后，重復(fù)檢查所有轉(zhuǎn)陰再投入使用，PCR實(shí)驗(yàn)室恢復(fù)正常。

6 分析討論

PCR技術(shù)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染。極其微量的污染就可造成假陽性結(jié)果，一旦發(fā)生污染，后果不堪設(shè)想。要消除污染就是要預(yù)見污染、承認(rèn)污染和采取措施防止污染。通常我們對 PCR實(shí)驗(yàn)室污染的預(yù)防是采取操作分區(qū)、試劑的分裝處理、移液器的使用、Eppendorf管、規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作等規(guī)則,對污染的處理是用現(xiàn)配3%雙氧水或 10%次氯酸鈉溶液擦拭或浸泡;紫外線照射法[3]。而對于實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)方面沒有給予足夠的重視，為了防止實(shí)驗(yàn)區(qū)間之間的相互污染，各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)間都是盡可能的密閉，從而使得實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)PCR產(chǎn)物殘留污染的幾率增大，從本次PCR實(shí)驗(yàn)室污染排除的過程來看，我覺得污染得以排除的一個(gè)關(guān)鍵是通風(fēng)，適當(dāng)?shù)慕o予實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)，可起到空氣稀釋的作用，有利于 PCR產(chǎn)物殘留量的減少，加快實(shí)驗(yàn)室污染的排除。

PCR技術(shù)在不斷的發(fā)展，隨著定量 PCR、熒光 PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR，特別是生物芯片等技術(shù)的出現(xiàn)[4]，[5]，PCR技術(shù)及其污染控制策略將會更加完善。

開展 PCR必須具備一定的條件，為保證臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)的有效應(yīng)用，在衛(wèi)生部的指導(dǎo)下。經(jīng)國內(nèi)專家多次研究論證，并結(jié)合該技術(shù)在國內(nèi)外的發(fā)展現(xiàn)狀，衛(wèi)生部于2002年1月14日正式發(fā)布了《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》及其附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心也隨后發(fā)布了《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》等配套文件[6]。每個(gè)操作PCR實(shí)驗(yàn)的工作人員,必須要具有相應(yīng)理論知識及操作培訓(xùn)合格證書,這也是確保實(shí)驗(yàn)室避免污染的重要基礎(chǔ)。平時(shí)要注重實(shí)驗(yàn)室管理，嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)規(guī)章制度，積極參加相關(guān)知識培訓(xùn)，努力提升業(yè)務(wù)能力。本院在 2005年申報(bào)了臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室評審，是四川省衛(wèi)生廳頒發(fā)了評審合格證。這樣使基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，才能使 PCR技術(shù)在科研和臨床工作中發(fā)揮更大的作用。

[1]朱忠勇.實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)[M].2版.北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：1041.

[2] KwoK s,Higuchi R. Avoiding false positives with PCR[J].Na-ture,1989,339(2):223-238.

[3]林萬明,楊瑞馥,黃尚志.等.PCR技術(shù)操作和應(yīng)用指南[M].第1版.北京:民軍醫(yī)出版社,1993:28-30.

[4] Or lando C.Developments in antiative PCR.Cl in.Chem Lab Med,1998,36:255-269.

[5]Whitcombe D.Advance in approaches to DNA based diagnostics.Curr Opin Biotechnol,1998,9:602-608.

[6]申子瑜，李金明.臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2002：176-186.

[7]李園,PCR實(shí)驗(yàn)室的消毒與防污染措施[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2010.(7)3:285.

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