胰高血糖素對胰島β細胞胰島素分泌的調(diào)節(jié)作用及機制

石艷秋，李軍，李思源，張震,孫侃，王彥文

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3鄭州市第一人民醫(yī)院;4濟南市協(xié)和醫(yī)院)

胰高血糖素對胰島β細胞胰島素分泌的調(diào)節(jié)作用及機制

石艷秋1，李軍1，李思源2，張震3,孫侃1，王彥文4

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3鄭州市第一人民醫(yī)院;4濟南市協(xié)和醫(yī)院)

目的 觀察胰高血糖素對胰島β細胞(MIN6細胞株)胰島素(INS)分泌的調(diào)節(jié)作用，并探討其作用機制。方法 將培養(yǎng)好的MIN6細胞均轉(zhuǎn)染對環(huán)磷酸腺苷(cAMP)敏感的熒光生物傳感器DNA質(zhì)粒ICUE3。轉(zhuǎn)染48 h將細胞隨機分為三部分，分別在無糖、低糖(葡萄糖2.8 mmol/L)、高糖(葡萄糖16.7 mmol/L)環(huán)境下培養(yǎng)400～600 s，之后各環(huán)境下的細胞隨機分為四組：0、100、500、1 000 ng/L組，分別用不同濃度(0、100、500、1 000 ng/L)胰高血糖素處理350～600 s。采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)檢測MIN6細胞中cAMP水平，ELISA法檢測細胞INS分泌量。結(jié)果 在無糖環(huán)境下，MIN6細胞內(nèi)cAMP水平及INS分泌量1 000 ng/L組>500 ng/L組>100 ng/L組，各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。在低糖、高糖環(huán)境下，MIN6細胞內(nèi)cAMP水平及INS分泌量1 000 ng/L組>500 ng/L組>100 ng/L組>0 ng/L組，各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；且高糖環(huán)境下以上差異更明顯。結(jié)論 胰高血糖素可能以濃度梯度的形式通過升高胰島β細胞內(nèi)cAMP水平來促進INS分泌，且該作用有一定的葡萄糖依賴性。

胰高血糖素；胰島素；胰島β細胞；環(huán)磷酸腺苷

1、2型糖尿病發(fā)病均與胰島素(INS)分泌密切相關(guān)[1～3]，INS分泌及其功能成為研究熱點[4]。INS分泌受多種因素的控制，除各種供能物質(zhì)外，多種激素和神經(jīng)遞質(zhì)可通過改變某些第二信使?jié)舛鹊韧緩秸{(diào)節(jié)INS分泌[5]。胰高血糖素是由胰島α細胞分泌的多肽類激素。有研究表明，胰高血糖素可使體外培養(yǎng)豬胰島細胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平升高，激活蛋白激酶，繼而促進INS的釋放[6]。2012年1月～2015年1月，本研究體外培養(yǎng)小鼠胰島β細胞MIN6，并給予不同濃度的葡萄糖及胰高血糖素干預(yù)，探討胰高血糖素對INS分泌的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 小鼠來源的胰島β細胞瘤株MIN6細胞(由湘雅二院饋贈)；對cAMP敏感的熒光生物傳感器DNA質(zhì)粒ICUE3(由美國霍普金斯大學(xué)實驗室構(gòu)建并饋贈)，經(jīng)提取擴增后儲存?zhèn)溆茫桓咛荄MEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)，L-谷氨酰胺、胰高血糖素(sigma)，胰高血糖素受體抗體(GLR ab75240，Abcam)，小鼠INS ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，cAMP-ELISA試劑盒(Biovision)，質(zhì)粒大提試劑盒(德國，QIAGEN)等。Krebs：119 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3，調(diào)定pH值7.40，定容1 000 mL，根據(jù)預(yù)實驗分別加入0、2.8、16.7 mmol葡萄糖制備無糖、低糖、高糖環(huán)境。

1.2 MIN6細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及干預(yù) MIN6細胞用含4.5 g/L葡萄糖、2%青鏈霉素、1% L-谷氨酰胺及1‰ β-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳至4～15代。將MIN6細胞以4×105/孔于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，在對數(shù)生長期細胞用于實驗，均轉(zhuǎn)染ICUE3質(zhì)粒48 h。將細胞隨機分為三部分，分別在無糖、低糖、高糖環(huán)境下培養(yǎng)400～600 s，之后各環(huán)境下的細胞隨機分為四組：0、100、500、1 000 ng/L組，分別用不同濃度(0、100、500、1 000 ng/L)胰高血糖素處理350～600 s。

1.3 MIN6細胞中cAMP水平檢測 采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)。取轉(zhuǎn)染后MIN6細胞置于激光共聚焦顯微鏡下，定位單個細胞視野。處理后的細胞分別追加毛喉素(FSK)處理200 s左右。細胞處理前100 s及處理過程中用激光共聚焦顯微鏡每10秒采集熒光圖像1次，記錄波長485、535 nm處接收到的熒光強度；以無糖環(huán)境未經(jīng)胰高血糖素處理的細胞作對照，將FRET發(fā)射比值青色熒光蛋白(CFP)/黃色熒光蛋白(YFP)的上升率作為cAMP水平上升率。CFP激發(fā)波長為420～440 nm，發(fā)射波長為485 nm；YFP激發(fā)波長470～490 nm，發(fā)射波長為535 nm。

1.4 MIN6細胞INS分泌量檢測 取處理后的各組細胞，收集細胞上清液，用ELISA法檢測上清液中INS水平。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度胰高血糖素在無糖、低糖、高糖環(huán)境下對MIN6細胞中cAMP水平的影響 在無糖環(huán)境下，cAMP水平1 000 ng/L組>500 ng/L組>100 ng/L組，各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。在低糖、高糖環(huán)境下，cAMP水平1 000 ng/L組>500 ng/L組>100 ng/L組>0 ng/L組，各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；且高糖環(huán)境下以上差異更明顯。見表1。

表1 不同濃度胰高血糖素在無糖、低糖、高糖環(huán)境下對MIN6細胞中cAMP水平的影響

2.2 不同濃度胰高血糖素在無糖、低糖、高糖環(huán)境下對MIN6細胞INS分泌量的影響 在無糖環(huán)境下，INS分泌量1 000 ng/L組>500 ng/L組>100 ng/L組，各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。在低糖、高糖環(huán)境下，INS分泌量1 000 ng/L組>500 ng/L組>100 ng/L組>0 ng/L組，各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；且高糖環(huán)境下以上差異更明顯。見表2。

表2 不同濃度胰高血糖素在無糖、低糖、高糖環(huán)境下對MIN6細胞INS分泌量的影響

3 討論

研究表明，胰高血糖素受體(GCGR)是由7個跨膜G蛋白偶聯(lián)形成，胰高血糖素與INS之間的比例是影響血糖濃度的一個重要因素[7]。胰高血糖素對β細胞INS分泌的調(diào)節(jié)作用可能通過先與細胞膜上的GCGR相結(jié)合，引起腺苷酸環(huán)化酶活化，從而使ATP環(huán)化為cAMP，再通過cAMP-PKA第二信使信號途徑實現(xiàn)的[8，9]，此作用中第二信使cAMP可能是胰高血糖素參與調(diào)控INS分泌的橋梁[10]，在INS分泌機制中扮演重要角色。

本研究預(yù)實驗?zāi)M人體低糖、高糖環(huán)境，確定葡萄糖的終濃度。FSK是一種疏水性腺苷酸環(huán)化酶(AC)激活劑，可以直接刺激升高哺乳動物細胞內(nèi)AC(除去IX型所有亞型)的活性，使細胞內(nèi)cAMP水平升高，增強熒光接收強度。ICUE3質(zhì)粒可表達一種生物合成的對cAMP敏感的熒光生物傳感器。當(dāng)胞內(nèi)cAMP水平增加時，除細胞外觀上熒光疊加圖像的顏色變化以外，CFP/YFP的FRET發(fā)射比值增加，可作為細胞內(nèi)cAMP水平增加的指標(biāo)。據(jù)文獻[11，12]報道，低濃度少量的胰高血糖素和高濃度大量胰高血糖素對β細胞的作用機制稍有不同。少量的胰高血糖素通過使細胞去極化致電壓依賴性鈣通道開放，胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高，直接引起INS釋放；當(dāng)大量胰高血糖素刺激時，cAMP水平升高，激活PKA等途徑以促進INS分泌。本研究中MIN6細胞內(nèi)cAMP水平檢測結(jié)果顯示，單純葡萄糖環(huán)境下高糖較無糖、低糖升高；無糖環(huán)境下1 000、500 ng/L胰高血糖素高于0、100 ng/L胰高血糖素，1 000 ng/L與500 ng/L差異不明顯；低糖、高糖環(huán)境下1 000 ng/L胰高血糖素高于0、100 ng/L胰高血糖素，且高糖環(huán)境時，1 000 ng/L胰高血糖素高于500 ng/L胰高血糖素。這表示胰高血糖素可能以濃度梯度增加細胞內(nèi)cAMP的水平，也顯示了對葡萄糖的依賴性。同時觀察不同濃度胰高血糖素對INS分泌量的影響，無糖環(huán)境下，經(jīng)胰高血糖素處理后INS分泌量均升高，且隨著胰高血糖素濃度升高，INS分泌量依次升高。

綜上所述，本研究在活細胞中測得隨著胰高血糖素濃度的增加胰島β細胞內(nèi)cAMP水平增加，INS分泌增加。這說明胰高血糖素可能通過增加MIN6細胞內(nèi)cAMP水平促進INS分泌，且這一作用具有一定的葡萄糖依賴性。

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Regulatory effect of glucagon on insulin secretion of pancreatic β cells

SHIYanqiu1,LIJun,LISiyuan,ZHANGZhen,SUNKan,WANGYanwen

(1TheFirstAffiliatedHospitalofMedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

Objective To explore the regulation effect and mechanism of glucagon on insulin secretion of the pancreatic β cell-MIN6 cells. Methods The cultured MIN6 cells were transfected with ICUE3, a fluorescent biosensor DNA sensitive to cyclic adenosine monophosphate (cAMP), and then were randomly divided into three groups, respectively, which were cultivated for 400-600 s under the glucose-free, low-glucose (2.8 mmol/L glucose) and high-glucose (16.7 mmol/L glucose) conditions. Then the cells in each group were randomly divided into four groups: 0, 100, 500, and 1 000 ng/L groups which were treated with 0, 100, 500, and 1 000 ng/L glucagon for 350-600 s. Using fluorescence resonance energy transfer technology (FRET) to detect the cAMP levels in MIN6 cells, and the Ins secretion was measured by enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA).Results Under the glucose-free condition, the levels of cAMP and Ins secretion in MIN6 cells of the 1 000 ng/L group were significantly higher than those in the 500 ng/L group, and significant difference was found between every two groups (allP<0.05). Under the low-glucose and high-glucose conditions, the levels of cAMP and Ins secretion in MIN6 cells: 1 000 ng/L group > 500 ng/L group >100 ng/L group >0 ng/L group, significant difference was found between every two groups (allP<0.05). And under the high glucose environment, the difference was more significant.Conclusion Glucagon may stimulate insulin secretion by increasing cAMP levels in the way of concentration gradient within the islet β cell line-MIN6 cells, and this trend is glucose-dependent.

glucagon; insulin; pancreatic β cells; cyclic adenosine monophosphate

兵團中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才專項(2015BC001)；兵團科技援疆項目(2014AB049)；兵團博士資金專項(2012BB019)。

石艷秋(1989-)，女，在讀碩士，主要研究方向為內(nèi)分泌及代謝性疾病。E-mail：576497847@qq.com

李軍(1972-)，女，博士，教授，主要研究方向為內(nèi)分泌及代謝性疾病。E-mail: xjlijun@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.006

R458.5

A

1002-266X(2017)05-0019-03

2016-10-07)