結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在腎積水模型大鼠腎組織中的表達(dá)研究

劉永東 韓建強(qiáng) 張廣平李俊峰 張傳光 胡強(qiáng)

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在腎積水模型大鼠腎組織中的表達(dá)研究

劉永東 韓建強(qiáng) 張廣平李俊峰 張傳光 胡強(qiáng)

目的觀測(cè)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）在腎積水模型大鼠腎組織中的表達(dá)，并與先天性腎積水患兒進(jìn)行對(duì)比，為先天性腎積水的靶點(diǎn)防治研究提供可靠的動(dòng)物模型。方法將48只成年健康雄性Wistar大鼠分為模型組和對(duì)照組各24只。模型組行左側(cè)腎盂輸尿管處游離并結(jié)扎輸尿管，對(duì)照組僅行左側(cè)腎盂輸尿管處游離。兩組在術(shù)后1、2、4、8周各隨機(jī)選取6只，行腎臟病理學(xué)檢查，用免疫組織化學(xué)染色及Western blot法檢測(cè)CTGF在組織中的分布及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果CTGF蛋白含量隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而增加。CTGF在模型組腎臟中各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。結(jié)論CTGF在大鼠腎積水模型中為陽(yáng)性表達(dá)，且與梗阻時(shí)間呈正相關(guān)，與前期先天性腎積水患兒的研究結(jié)果相一致，此模型可用于先天性腎積水的CTGF靶點(diǎn)防治。

大鼠 腎積水 結(jié)蹄組織生長(zhǎng)因子

腎盂輸尿管連接處梗阻（ureteropelvic junction obstruction，UPJO）所致腎積水可使腎臟發(fā)生一系列的生理、病理變化，最終導(dǎo)致腎萎縮并纖維化。動(dòng)物研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達(dá)是介導(dǎo)間質(zhì)纖維化過(guò)程的關(guān)鍵機(jī)制，而結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）是TGF-β1致纖維化作用的下游關(guān)鍵性效應(yīng)因子，在促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、合成與分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。本研究通過(guò)應(yīng)用免疫組織化學(xué)及Western blot法檢測(cè)CTGF在組織中的分布及蛋白的表達(dá)水平，以明確CTGF在腎積水模型大鼠腎組織中的表達(dá)，從而為先天性腎積水的靶點(diǎn)防治提供可靠的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康雄性Wistar大鼠48只，體重170～190g，由濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供，常規(guī)飼養(yǎng)1周，期間無(wú)大鼠死亡。

1.2 試劑及儀器SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；BCA蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒、蛋白裂解液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；預(yù)染蛋白Marke、GAPDH抗體（北京博奧森公司）；即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒、兔抗大鼠CTGF多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立將大鼠分為模型組和對(duì)照組各24只。模型組采用3-0絲線結(jié)扎制備單側(cè)完全性輸尿管梗阻模型，以氯胺酮8mg/kg腹腔注射麻醉，固定備皮消毒，取腹正中切口，找到左側(cè)腎盂輸尿管并游離，距腎盂輸尿管連接處1cm雙重絲線結(jié)扎并切斷輸尿管，隨后逐層關(guān)閉腹腔；對(duì)照組打開腹腔后僅行左側(cè)腎盂輸尿管處游離。

1.4 病理學(xué)檢查兩組大鼠在術(shù)后1、2、4、8周各隨機(jī)選取6只，氯胺酮腹腔注射麻醉，固定備皮消毒，取腹正中切口，找到左側(cè)腎臟，取腎臟標(biāo)本，行腎臟病理學(xué)檢查。

1.4.1 HE染色將石蠟切片依次脫蠟，梯度乙醇水化，HE染色，梯度乙醇脫水，透明，固封，顯微鏡下觀察腎小球及腎小管間質(zhì)的變化。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色采用SABC法，石蠟標(biāo)本切片后放恒溫箱，取出后二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶；PBS緩沖液處理0.02mol/L檸檬酸微波修復(fù)；非免疫性動(dòng)物血清封閉非特異性抗原；兔抗大鼠CTGF多克隆抗體稀釋度為1∶100，4℃孵育過(guò)夜；按SP免疫組化試劑盒說(shuō)明加生物素標(biāo)記的二抗，孵育30min后加標(biāo)記過(guò)氧化酶的鏈霉親和素孵育30min；DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。經(jīng)蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片處理。同時(shí)取先天性腎積水患兒的腎臟標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照，顯微鏡下觀察陽(yáng)性顆粒的分布及表達(dá)水平。

1.4.3 Western blot法將兩組大鼠腎臟標(biāo)本盡量剪碎，加入裂解液內(nèi)30min，然后在4℃下12 000r/min離心5min，提取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行10% SDS-PAGE垂直凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)），兔抗大鼠CTGF多克隆抗體，稀釋比例均為1∶2 000，均4℃孵育過(guò)夜，TBST洗10min×3次。HRP標(biāo)記的山羊抗兔多克隆IgG二抗（THERMO）稀釋比例為1∶5 000，37℃孵育1h，TBST洗10min×3次。滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、攝片，測(cè)定蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果對(duì)照組腎臟各部位無(wú)明顯病理變化，腎小球及腎小管間質(zhì)無(wú)明顯異常改變（圖1a）。與對(duì)照組相比，模型組隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，腎小管擴(kuò)張逐漸明顯，腎實(shí)質(zhì)區(qū)腎小球萎縮（圖1b）。

圖1 HE染色結(jié)果（a：對(duì)照組，正常腎實(shí)質(zhì)；b：模型組，腎積水腎實(shí)質(zhì)；HE染色，×200）

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果CTGF蛋白染色陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，陰性則無(wú)棕黃色著色。正常腎組織無(wú)或僅有微量表達(dá)，染色為顆粒狀，著色稀疏（圖2a）。而在模型組則表達(dá)增多，主要集中在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)及腎間質(zhì)中，并隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)染色強(qiáng)度加重且數(shù)量增多（圖2b）。采用先天性腎積水患兒腎臟腎實(shí)質(zhì)免疫組織化學(xué)染色作陽(yáng)性對(duì)照，可見CTGF在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)明顯（圖2c）。

2.3 兩組大鼠腎組織CTGF蛋白定量比較CTGF在模型組腎臟中呈陽(yáng)性表達(dá)，且CTGF蛋白含量隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而增加，各時(shí)點(diǎn)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1和圖3。

圖2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（a：對(duì)照組正常腎實(shí)質(zhì)，CTGF無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)；b：模型組腎積水腎實(shí)質(zhì)，CTGF在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)、腎間質(zhì)組織中表達(dá)明顯；c：先天性腎積水患兒腎臟腎實(shí)質(zhì)，CTGF在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)明顯；SABC法，×200）

表1 兩組大鼠腎組織CTGF蛋白定量比較

圖3 Western blot法檢測(cè)兩組大鼠腎組織中CTGF蛋白的表達(dá)（N：對(duì)照組，K：模型組）

3 討論

1988年Almendral等[2]首先發(fā)現(xiàn)小鼠CTGF。1991年Bradham等[3]用親和色譜法在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中首次發(fā)現(xiàn)人CTGF，隨后發(fā)現(xiàn)CTGF廣泛存在于人的腎、肺、胰腺、動(dòng)脈、肝、心和腦等多種組織器官中，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及某些癌細(xì)胞均可表達(dá)CTGF[4]。

近幾年，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者從分子水平研究了梗阻性腎病的改變，制作了輸尿管完全及部分梗阻的動(dòng)物模型。研究表明腎萎縮及腎間質(zhì)纖維化與一些細(xì)胞因子表達(dá)改變有關(guān)，研究主要集中在表皮生長(zhǎng)因子（EGF）[5]、TGF-β[6]等，CTGF為TGF-β1致纖維化作用的下游關(guān)鍵性效應(yīng)因子，是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，其發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究腎臟纖維化的研究提供了新方向。

前期通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究UPJO引發(fā)腎積水患兒的患腎標(biāo)本與正常腎組織標(biāo)本，應(yīng)用HE染色觀察其形態(tài)學(xué)特征，免疫組織化學(xué)染色法、免疫電鏡檢測(cè)其CTGF的表達(dá)和分布差性，結(jié)果顯示對(duì)照組腎臟各部位無(wú)明顯病理改變；觀察組腎實(shí)質(zhì)見腎小球數(shù)目和面積減少、腎小管間質(zhì)纖維化明顯、呈灶狀分布，腎盂及腎盂輸尿管連接處的移行上皮細(xì)胞被擠壓變形[7]；CTGF在患腎的腎實(shí)質(zhì)、腎盂、腎盂輸尿管連接處狹窄段中的表達(dá)明顯增高[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用輸尿管結(jié)扎并剪斷法制作腎積水模型，分別取術(shù)后1、2、4、8周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，觀察其病理變化。結(jié)果顯示CTGF在模型組中結(jié)扎側(cè)腎臟各時(shí)間點(diǎn)均有陽(yáng)性表達(dá)，主要分布于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)及增生的腎間質(zhì)細(xì)胞中，并且隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，CTGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，表達(dá)增強(qiáng)。Western blot法顯示，隨梗阻病情進(jìn)展，CTGF蛋白表達(dá)量增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后4周及8周的數(shù)值與前期研究CTGF在先天性腎積水患兒中表達(dá)結(jié)果相一致。由此，可在此模型上行腎積水CTGF的研究并行后續(xù)藥物療效觀察等實(shí)驗(yàn)。

[1]AlmendralJ M,Sommer D,Macdonald-Bravo H,et al.Complexity of the early genetic response to growth factor in mouse fibroblass [J].MolCellBiol,1988,8(5):2140-2148.

[2]Bradham D M,Igarshi A,Potter R L,et al.Connective tissue growth factor:a cystine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cell is related to the SRC-induced immediate early gene product CEF-10[J].J CellBiol,1991,114(6):1285-1294.

[3]Chaqour B,Goppelt-Struebe M.Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins[J].PEBS J,2006,273(16): 3639-3649.

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[5]楊屹,吉士俊,趙國(guó)貴,等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子在先天性腎積水中的表達(dá)研究[J].中華泌尿外科雜志,2001,10(22):604-606.

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[7]曹廣信,李俊峰,張廣平,等.結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在UPJO引發(fā)腎積水兒童患者腎組織中的表達(dá)[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,41(10):1224-1230.

[8]閔亞麗,藍(lán)天座.單側(cè)輸尿管結(jié)扎致大鼠腎間質(zhì)纖維化模型中CTGF、a-SMA的動(dòng)態(tài)觀察[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,31(3):251-256.

Expression of CTGF in kidney tissue of rat hydronephrosis model

LIU Yongdong,HAN Jianqiang,ZHANG Guangping,et al. Department of Urology,Weifang People's Hospital,Weifang 261041,China

ObjectiveTo investigate the expression of connective tissue growth factor(CTGF)in kidney tissue of rat hydronephrosis model.MethodsForty eight healthy male Wistar rats were equally divided into two groups:in model group the left pelviureteric junction was dissociated and the ureter was ligated,and in control group the left pelviureteric junction was dissociated only.Six rats in each group were sacrificed 1,2,4 and 8 weeks after the operation and the left kidney was taken for histopathologicalexamination.TheexpressionofCTGFproteinandmRNAinkidneytissuewasdetectedwith immunohistochemistry and Western blot,respectively.ResultsThe expression of CTGF mRNA and protein in model group was significantly higher than that in the control group(P＜0.01)and increased with the time length of pelviureteric junction obstruction. ConclusionThe expression of CTGF is upregulated in the rat hydronephrosis model and positively correlated with the obstruction duration,indicating that CTGF might be used as a target of preventing congenital hydronephrosis.

RatsHydronephrosisCTGF

2016-06-26）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-966

261041山東省濰坊市人民醫(yī)院小兒外科（劉永東、韓建強(qiáng)、李俊峰、張傳光、胡強(qiáng)）；山東省蘭陵縣人民醫(yī)院小兒外科（張廣平）

胡強(qiáng)，E-mail：DHQ7936@163.com