沉默Calnexin 基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC- 7901 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡及其信號(hào)通路的影響

張曉海 張洪濤 胡孝定 鐘華

沉默Calnexin 基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC- 7901 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡及其信號(hào)通路的影響

張曉海 張洪濤 胡孝定 鐘華

目的探討沉默鈣連蛋白（Calnexin）基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC-7901內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)通路的影響。方法構(gòu)建靶向Calnexin基因的慢病毒干擾載體，利用包裝細(xì)胞293T獲得重組慢病毒，轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞，并分為轉(zhuǎn)染shRNA-Calnexin的實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染shRNA空白質(zhì)粒的空白載體組，并將未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞作為對(duì)照組。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)靶向沉默Calnexin的表達(dá)，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測(cè)GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達(dá)水平。結(jié)果轉(zhuǎn)染shRNA沉默Calnexin基因可明顯下調(diào)Calnexin mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力明顯下降（P＜0.05）；沉默Calnexin基因可提高細(xì)胞凋亡率，轉(zhuǎn)染72h后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；沉默Calnexin基因使胃癌細(xì)胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP蛋白表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05）。結(jié)論靶向沉默Calnexin基因抑制人胃癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

鈣連蛋白 SGC-7901 細(xì)胞 慢病毒 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡 胃癌

在我國(guó)每年大約有50萬(wàn)新發(fā)胃癌患者，病例數(shù)占全球的1/2，胃癌在惡性腫瘤中發(fā)病率、死亡率均為第3位。目前我國(guó)對(duì)于胃癌的治療手段主要為手術(shù)治療及化療，但上述治療方法并不能達(dá)到患者及醫(yī)生的期望療效，且具有5年生存率低、不良反應(yīng)大等特點(diǎn)[1]。鈣連蛋白（Calnexin）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的I型跨膜蛋白，具有輔助糖蛋白折疊裝配、監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白質(zhì)量、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）等作用[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，ERS現(xiàn)象普遍存在[3]，并且ERS選擇性地保留了對(duì)ERS有拮抗傾向的細(xì)胞，使存活下的腫瘤細(xì)胞向更惡性的方向進(jìn)展[4]?；谏鲜鲅芯?，本研究提出下調(diào)Calnexin基因表達(dá)，干擾Calnexin/Calreticulin循環(huán)，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)及錯(cuò)誤蛋白降解能力失衡，促進(jìn)原本耐受ERS的腫瘤細(xì)胞向凋亡路線傾斜。本研究觀察了胃癌細(xì)胞SGC-7901沉默Calnexin基因后，對(duì)ERS下游凋亡相關(guān)因子GRP94、IRE1、ATF6及CHOP的表達(dá)，為胃癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料SGC-7901細(xì)胞（ATCC公司，美國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（BX51，Olympus公司，日本）；一氧化氮檢測(cè)儀（NO-501，IMN，日本）；水平搖床（WD-9405B，六一公司，中國(guó)）；GRP94、IRE1、ATF6及CHOP抗體（Boster公司,中國(guó)）、β-actin內(nèi)參抗體（wanleibio公司，中國(guó)）；Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒（SIGMA，美國(guó)）；RPMI 1640（GIBCO，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（LSR-Ⅱ，BD公司，美國(guó)）。

1.2 構(gòu)建針對(duì)Calnexin基因的shRNA慢病毒載體采用Ambion公司的設(shè)計(jì)軟件,針對(duì)人Calnexin的mRNA（NM 014062）設(shè)計(jì)4條siRNA序列,經(jīng)過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,根據(jù)其對(duì)Calnexin基因的抑制效率，確定有效RNAi序列為：sense：5′-CACAGCAACCACTTCCCTTC-3′，設(shè)計(jì)為短發(fā)卡shRNA序列合成并退火成雙鏈。慢病毒的骨架質(zhì)粒pLVTHM經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切消化后與雙鏈DNA進(jìn)行連接反應(yīng),進(jìn)行PCR鑒定,連接成功的載體送基爾頓生物科技公司進(jìn)行菌種培養(yǎng)擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒DNA。

1.3 shRNA慢病毒顆粒包裝出毒對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于25ml細(xì)胞培養(yǎng)皿,細(xì)胞密度約70%時(shí)將重組的慢病毒骨架質(zhì)粒與包裝輔助質(zhì)粒用磷酸鈣共轉(zhuǎn)染至病毒包裝細(xì)胞293T,培養(yǎng)12h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液,加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染72h的293T細(xì)胞上清液，于4℃，4 000g離心10min以去除細(xì)胞碎片，0.45μm濾器過(guò)濾后置于25 000r/min超速離心90min，而后以冰PBS液重懸病毒沉淀，分裝置于-80℃冰箱保存，該實(shí)驗(yàn)步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組SGC-7901細(xì)胞加入到10%滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中（條件：37℃；5%體積分?jǐn)?shù)CO2；飽和濕度，每2～3天傳代1次）。將細(xì)胞懸濁液以5×104/孔的密度接種于24孔板，細(xì)胞融合80%～90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞）、空白載體組（轉(zhuǎn)染shRNA空白質(zhì)粒）、實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染shRNA-Calnexin的胃癌細(xì)胞）。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（1）取出冷藏保存的病毒，并輕輕搖勻；（2）感染目的細(xì)胞：觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞貼壁，狀態(tài)良好則開(kāi)始實(shí)驗(yàn)；（3）用移液器精準(zhǔn)吸出10倍于細(xì)胞的病毒液加入培養(yǎng)基中；（4）加入ploybrene（8μg/ml）液體，加入培養(yǎng)基中以提高感染效率；（5）混勻后在37℃、5%CO2濃度條件的培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜；（6）孵育24h后將培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)液，在原有條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h[5]，該實(shí)驗(yàn)步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.6 采用RT-PCR檢測(cè)Calnexin基因表達(dá)引物信息：Calnexin F：5′-GAAGGGAAGTGGTTGCTGTG-3′，R：5′-CGTCTTTCTTGGCTTTGGAT-3′。經(jīng)過(guò)總RNA提取后進(jìn)行RNA濃度檢測(cè)，將得到的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到對(duì)應(yīng)的cDNA。在冰浴的無(wú)核酸酶的離心管中加入反應(yīng)混合物，加熱條件：70℃加熱5min，冷卻2min。離心后加入5×Buffer（4μl）、RNasin（0.5μl）、1μl M-MLV，輕輕混勻。25℃溫浴10min，42℃溫浴50min，95℃加熱5min，終止反應(yīng)。經(jīng)由PCR儀完成上述過(guò)程，可得20μl cDNA，待PCR循環(huán)結(jié)束后，馬上升溫至95℃，維持10min，再降至60℃，維持20s；從60℃提升至72℃，維持30s，最后降至4℃維持5min，此過(guò)程循環(huán)40次。每個(gè)樣品基因行6個(gè)復(fù)孔平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果舍去較大誤差數(shù)值后選取剩余值平均值為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)，該實(shí)驗(yàn)步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.7 采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率取各組轉(zhuǎn)染24h細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前用臺(tái)盼藍(lán)拒染法確認(rèn)SGC-7901細(xì)胞拒染率在95%以上，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4× 107/L，取200μl接種于96孔板中（每組細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔），設(shè)對(duì)照組、空白載體組、實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入5g/L MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后去上清液，逐一加入DMSO 100μl后震蕩混勻，待藍(lán)色晶體完全溶解反應(yīng)后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光度值（OD值），并計(jì)算抑制率。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%[6]。該實(shí)驗(yàn)步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡分別收集72h培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞，經(jīng)過(guò)消化、PBS沖洗、懸浮、300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞后加入300μl的Binding Buffer懸濁細(xì)胞，加入5μl的Annexin V-FITC混合，再加入Propidium Iodide并充分混勻；常溫下避光反應(yīng)20min；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并應(yīng)用軟件分析結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)步驟于基爾頓生物科技公司完成。

1.9 Western blot檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞內(nèi)GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達(dá)分別收集72h培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞，制備組織勻漿，Western blot檢測(cè)步驟：蛋白質(zhì)抽提→蛋白質(zhì)定量→SDS-PAGE→轉(zhuǎn)印至PVDF膜→封閉→孵育一抗→孵育二抗→ECL底物發(fā)光→圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液。檢測(cè)各組細(xì)胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP的表達(dá)[7]。該實(shí)驗(yàn)步驟由浙江省皮膚病防治研究所自行研究完成。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 采用RT-PCR檢測(cè)Calnexin基因表達(dá)經(jīng)RTPCR檢測(cè)，對(duì)照組細(xì)胞中Calnexin mRNA水平為1.00± 0.02，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Calnexin mRNA水平為0.35±0.01，明顯減少，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而空白載體組（1.02±0.01）與對(duì)照組比較，Calnexin mRNA水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Calnexin基因沉默后對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901抑制生長(zhǎng)作用明顯，且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白載體組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 各組細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而空白載體組與對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1和圖1。

表1 沉默Calnexin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC-7901增殖及凋亡的影響（n=6）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況（a：對(duì)照組；b：空白載體組；c：實(shí)驗(yàn)組）

2.4 各組細(xì)胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達(dá)沉默Calnexin基因后，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而空白載體組與對(duì)照組相比較上述蛋白表達(dá)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2和圖2。

表2 各組細(xì)胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP的表達(dá)（n=6）

3 討論

在我國(guó)胃癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，手術(shù)治療效果欠佳，臨床治療多以手術(shù)、化療相結(jié)合為主[8]。但化療藥物具有毒性反應(yīng)強(qiáng)、且靶向性不明確、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中受到了諸多限制。因此，尋找高效、靶向治療胃癌的方法不僅是目前的研究熱點(diǎn)，更是亟待解決的問(wèn)題。

圖2 各組細(xì)胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達(dá)電泳圖（a：對(duì)照組；b：空白載體組；c：實(shí)驗(yàn)組）

胃癌細(xì)胞由于其自身瘋狂繁殖和處于高酸環(huán)境等特點(diǎn)，傳統(tǒng)抗癌藥物難以將胃癌細(xì)胞殺死。目前現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)于細(xì)胞的靶向誘導(dǎo)逐漸成熟，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的希望和研究熱點(diǎn)。ERS是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的凋亡機(jī)制，現(xiàn)階段研究認(rèn)為ERS發(fā)生的主要原因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白功能異常，導(dǎo)致錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積[4]，短時(shí)間的ERS是細(xì)胞自我修復(fù)的一種方法，但長(zhǎng)期的ERS發(fā)生即可引起細(xì)胞凋亡。大量研究證實(shí)[8-9]，惡性腫瘤細(xì)胞瘋狂生長(zhǎng)和繁殖，致使腫瘤細(xì)胞普遍缺氧并發(fā)生ERS，但發(fā)生ERS的腫瘤細(xì)胞并不走向凋亡，這可能與腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期處于缺氧狀態(tài)已產(chǎn)生耐缺氧及ERS耐受有關(guān)[8]，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)ERS的耐受性，使腫瘤細(xì)胞更傾向于凋亡，可能成為治療胃癌的新靶點(diǎn)。

Calnexin是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系的重要組成部分,即Calnexin/Calreticulin循環(huán)，可使錯(cuò)誤折疊的糖蛋白重新折疊，而難以糾正構(gòu)象的糖蛋白為避免在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度堆積造成危害，則在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶I作用下從Calnexin/Calreticulin循環(huán)中釋放出來(lái),與受體蛋白EDEM結(jié)合,后者通過(guò)Sec61p通道進(jìn)入胞液,在泛素-蛋白酶體系中將其降解，這一過(guò)程稱為糖蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP94與腫瘤細(xì)胞關(guān)系密切，姚元春等[11]通過(guò)免疫組化及分子生物學(xué)等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)GRP94在人胃癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，并且與胃癌細(xì)胞侵襲力相關(guān)，可作為胃癌分期及惡性程度的檢驗(yàn)指標(biāo)?，F(xiàn)階段公認(rèn)的ERS信號(hào)通路共有（1）PERK→eIF2a→ATF-4→CHOP；（2）IRE1→CHOP；（3）ATF6→CHOP等3條，誘導(dǎo)CHOP、Caspase-3及JNK因子的表達(dá)及活化，驅(qū)使細(xì)胞凋亡。雖然已有研究證實(shí)，Calnexin與ERS的發(fā)生有關(guān)[12]，但尚未有研究報(bào)道Calnexin的表達(dá)是否可以干擾胃癌細(xì)胞這種長(zhǎng)期耐受ERS的“特能細(xì)胞”的增殖速度及凋亡情況。

慢病毒載體的研究發(fā)展迅速，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體且成功率較高[13]，本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)干擾RNA沉默Calnexin基因表達(dá)，并用RT PCR技術(shù)驗(yàn)證Calnexin基因沉默效果，觀察干擾后胃癌細(xì)胞增殖及凋亡情況，以了解Calnexin基因與胃癌細(xì)胞生存的關(guān)系。MTT結(jié)果顯示，沉默Calnexin基因后胃癌細(xì)胞增殖受到抑制，并且凋亡率增加，為了探討胃癌細(xì)胞增殖抑制的機(jī)制，本研究進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)ERS標(biāo)志物GRP94及ERS信號(hào)通路。研究結(jié)果顯示，當(dāng)Calnexin基因沉默時(shí)，GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表達(dá)增加，這說(shuō)明Calnexin基因沉默可使ERS標(biāo)志物GRP94表達(dá)更高，打破胃癌細(xì)胞原本對(duì)ERS耐受的平衡，并且通過(guò)IRE1→CHOP、ATF6→CHOP通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究雖然證實(shí)沉默Calnexin基因可通過(guò)IRE1→CHOP/ATF6→CHOP通路誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖，但對(duì)于胃癌細(xì)胞其他凋亡通路的影響、分裂周期時(shí)相的分布尚不得而知，下一步研究將更深入地挖掘Calnexin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞的影響，為胃癌的臨床治療提供新靶點(diǎn)和新思路。

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Effectsof calnexin silencing on endoplasmicreticulum stress-apoptosisand itssignaling pathway in gastriccancer cellline SGC-7901

ZHANG Xiaohai,ZHANG Hongtao,HU Xiaoding,etal.Departmentof Internal Medicine,Zhejiang Skin Disease Prevention and Treatment Center,313200Deqing,China

ObjectiveTo investigate the effects of calnexin gene silencing on endoplasmic reticulum stress-apoptosis and its signaling pathway in gastric cancer SGC-7901cells.MethodsLentiviral vectors for short hairpin RNAs targeting the coding region of human calnexin gene were constructed.The recombinant lentiviral vectors were harvested from 293T cells and were used to transfect human gastric cancer SGC-7901 cells.SGC-7901 cells were transfected with shRNA-Calnexin (experimental group)or shRNA blank plasmid(blank vector group),and the non-transfected SGC-7901 cells were used as control group.Expression of calnexin mRNA in SGC-7901 cells were detected by RT-PCR,cell proliferation was detected by MTT,cell apoptosis was detected by flow cytometry,expression of GRP94,IRE1,ATF6 and CHOP were detected by Western blot.ResultsThe expression of Calnexin mRNA was down-regulated in experimental group compared to control group(P＜0.05),and the cell proliferation was significantly decreased(P＜0.05).The apoptosis rate was increased 72h after transfection, compared with the control group(P＜0.05).The expression of GRP94,IRE1,ATF6 and CHOP was significantly increased in experimental group(P＜0.05).ConclusionCalnexin silencing can inhibit cell proliferation and induce apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells probably by inhibiting endoplasmic reticulum stress signaling pathway.

CalnexinSGC-7901 cellSlow virusEndoplasmic reticulum stressApoptosisGastric cancer

2016-08-17）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-1304

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目（2013KYB076）

313200德清，浙江省皮膚病防治研究所內(nèi)科

張曉海，E-mail：doczhangxiaohai@163.com