雌激素對(duì)去卵巢大鼠骨組織Wnt16、β- catenin、OPG、RANKL 表達(dá)的影響

魏雙雙 張治芬 黃哲人 何軼然 吳紅艷 劉文華 湯珊珊 黃堅(jiān)

●論著

雌激素對(duì)去卵巢大鼠骨組織Wnt16、β- catenin、OPG、RANKL 表達(dá)的影響

魏雙雙 張治芬 黃哲人 何軼然 吳紅艷 劉文華 湯珊珊 黃堅(jiān)

目的研究雌激素對(duì)去卵巢大鼠骨組織中Wnt16、β-catenin、OPG、RANKL表達(dá)的影響，探討雌激素對(duì)骨組織的保護(hù)作用。方法選取3月齡Wistar雌性大鼠40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、去勢(shì)組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2。兩組實(shí)驗(yàn)組分別給予17β-雌二醇皮下注射4周和16周，其余兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液。16周后測(cè)定骨組織中Wnt16、OPG、RANKL、β-catenin表達(dá)量，HE染色分析大鼠脛骨平臺(tái)處骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）和骨小梁間距（Tb.SP）變化，ELISA法測(cè)定血清雌二醇（E2）水平。結(jié)果假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組2與去勢(shì)組比較，OPG、β-catenin、Wnt16 mRNA、血清E2水平、Tb.Th和Tb.N明顯升高，RANKL水平和Tb.SP明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組1與去勢(shì)組相比，β-catenin、血清E2水平、Tb.Th和Tb.N明顯升高，RANKL水平和Tb.SP明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論雌激素可能通過上調(diào)Wnt16、β-catenin、OPG表達(dá)，下調(diào)RANKL表達(dá)，來預(yù)防骨質(zhì)疏松。

雌激素 Wnt16 β-catenin OPG RANKL 骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，其中原發(fā)性骨質(zhì)疏松以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（postmenopausal osteoporosis, PMO）最常見[1-3]，這可能與絕經(jīng)后雌激素減少有關(guān)[4-5]?；A(chǔ)和臨床研究均證實(shí)雌激素的骨保護(hù)作用，但其作用機(jī)制仍不明確[6-7]。近年來隨著Wnt/β-鏈蛋白（βcatenin）信號(hào)途徑的發(fā)現(xiàn)，對(duì)其調(diào)節(jié)作用的研究也受到關(guān)注，研究表明Wnt1突變引起成骨不全癥[8]；成骨細(xì)胞高表達(dá)Wnt7b可促進(jìn)骨量的增加[9]，高表達(dá)Wnt4可在一定程度上緩解卵巢切除誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失[10]。Wnt16屬于Wnt家族，可通過Wnt/β-catenin信號(hào)途徑，參與調(diào)控人類骨骼系統(tǒng)疾病，與骨密度、骨皮質(zhì)厚度、骨強(qiáng)度、骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)利用去卵巢大鼠，探討雌激素通過調(diào)節(jié)Wnt16/β-catenin信號(hào)途徑預(yù)防骨質(zhì)疏松的可能作用機(jī)制。Henry等[11]提出雌激素的骨保護(hù)作用機(jī)制可能與骨保護(hù)素（OPG）/NF-κB活化受體(RANK)/ NF-κB活化受體配體（RANKL）系統(tǒng)有關(guān)，Wnt16/βcatenin信號(hào)途徑可調(diào)控OPG的表達(dá)，故本實(shí)驗(yàn)又對(duì)OPG、RANKL進(jìn)行檢測(cè)，試圖進(jìn)一步探討雌激素的保護(hù)機(jī)制，為雌激素防治PMO提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑雌二醇試劑（美國(guó)Sigma公司）；大鼠雌二醇免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒ESBL4287(美國(guó)EVER公司)；總RNA提取試劑盒（TRIzol）（美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司）；Wnt16引物（武漢谷歌生物科技有限公司合成）；一抗RANKL（美國(guó)Santa Cruz公司）；一抗β-catenin、一抗OPG（美國(guó)abcam公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔鼠通用二抗、組化試劑盒DAB顯色劑（丹麥DAKO公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取SPF級(jí)3月齡Wistar雌性大鼠40只，體質(zhì)量180～200g，由浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。Wistar雌性大鼠飼養(yǎng)于屏障動(dòng)物室，室溫（23±1）℃，濕度（50±10）%，自由進(jìn)水，普通飼料喂養(yǎng)，5只/籠。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組3月齡雌性大鼠隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)組、去勢(shì)組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，每組10只。去勢(shì)組和兩組實(shí)驗(yàn)組在喂養(yǎng)1周后切除雙側(cè)卵巢組織，假手術(shù)組切除等質(zhì)量的腹部脂肪組織。術(shù)后2周兩組實(shí)驗(yàn)組給予頸背部皮下注射17β-雌二醇（17β-E2）100mg/kg，其余兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液，1次/d。實(shí)驗(yàn)組1給藥4周，實(shí)驗(yàn)組2給藥16周。

1.4 方法

1.4.1 取材大鼠稱質(zhì)量后給予10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，經(jīng)3 500r/min離心10min，分離血清，置-80℃冰箱保存。采血后，打開胸腔暴露心臟，將灌注針經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，剪開右心房，用0.9%氯化鈉溶液灌注。剝離出大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，天平稱其質(zhì)量，一側(cè)股骨、脛骨置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪粋?cè)股骨、脛骨采用4%多聚甲醛固定。

1.4.2 組織學(xué)觀察將各組已固定的脛骨標(biāo)本脫水脫鈣、包埋，制成蠟塊，連續(xù)切片，厚度約為5μm，HE染色。光鏡下隨機(jī)選取脛骨平臺(tái)骨皮質(zhì)區(qū)域，20倍高倍鏡視野下觀察骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁間距（Tb.SP）。

1.4.3 免疫組化方法檢測(cè)大鼠脛骨骨皮質(zhì)區(qū)RANKL、OPG、β-catenin表達(dá)水平取各組大鼠脛骨平臺(tái)區(qū)骨皮質(zhì)標(biāo)本，石蠟切片脫蠟至水后置于胰酶抗原修復(fù)緩沖液（0.1%）的修復(fù)盒中修復(fù)抗原20min，分別滴加相應(yīng)一抗（抗RANKL、抗OPG、抗β-catenin，1∶100），4℃孵育切片，過夜。然后滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔鼠通用二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。DAB顯色，常規(guī)脫水、封片、顯微鏡鏡檢和照相，觀察并比較各組棕黃色顆粒的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。

1.4.4 Western blot法檢測(cè)大鼠脛骨骨皮質(zhì)區(qū)RANKL、OPG、β-catenin表達(dá)水平取各組大鼠脛骨平臺(tái)區(qū)骨皮質(zhì)標(biāo)本，用不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白后轉(zhuǎn)膜固定，用5%脫脂牛奶封閉1h，加一抗（抗RANKL、抗OPG、抗β-catenin，1∶1 000）后4℃孵育搖晃過夜，TBST沖洗孵育二抗（1∶3 000）后，曝光顯色。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。用圖像分析軟件曝光后，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.4.5 RT-PCR法測(cè)定大鼠脛骨骨皮質(zhì)區(qū)Wnt16表達(dá)水平取各組大鼠脛骨平臺(tái)區(qū)骨皮質(zhì)標(biāo)本，采用總RNA提取試劑盒提取骨組織總RNA，取1μg RNA進(jìn)行隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得cDNA，用Wnt16特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物正鏈：AGAGGTGGAACTGTATGGTCGC，負(fù)鏈：AATGAATGCTGTCTCCTTGGTG。PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，60℃復(fù)性1min，72℃延伸1min。同時(shí)加入內(nèi)參GAPDH，正鏈：TTCCTACCCCCAATGTATCCG，負(fù)鏈：CATGAGGTCCACCACCCTGTT。取PCR產(chǎn)物10μl電泳，計(jì)算每一樣品和其內(nèi)參對(duì)照的相對(duì)含量。

1.4.6 血清E2水平測(cè)定采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清E2水平，使用大鼠雌二醇免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，操作按說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane′s檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組骨組織形態(tài)學(xué)比較去勢(shì)組與假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2比較，Tb.N減少且排列疏、Tb.Th變薄且Tb.SP增寬（均P＜0.05），骨髓環(huán)境中脂肪細(xì)胞數(shù)量增多，見表1和圖1。

表1 各組骨組織形態(tài)學(xué)分析

圖1 各組骨組織形態(tài)（a：假手術(shù)組；b：去勢(shì)組；c：實(shí)驗(yàn)組1；d：實(shí)驗(yàn)組2）

2.2 各組骨組織OPG、RANKL、β-catenin免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較骨組織OPG、β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞在假手術(shù)組最多，實(shí)驗(yàn)組2次之，實(shí)驗(yàn)組1較少，去勢(shì)組最少；骨組織RANKL陽(yáng)性細(xì)胞在假手術(shù)組最少，實(shí)驗(yàn)組2次之，實(shí)驗(yàn)組1較多，去勢(shì)組最多，見圖2。

圖2 免疫組化檢測(cè)OPG、RANKL、β-catenin蛋白表達(dá)結(jié)果（×200）

2.3 各組骨組織OPG、RANKL、β-catenin Western blot檢測(cè)結(jié)果比較假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組2與去勢(shì)組比較，OPG、β-catenin水平均升高，RANKL水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組1與去勢(shì)組比較，β-catenin水平升高，RANKL水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2與假手術(shù)組比較，OPG水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2和圖3。

2.4 各組骨組織Wnt16 mRNA及血清E2表達(dá)水平比較假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組2與去勢(shì)組比較，Wnt16 mRNA和血清E2水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組1與去勢(shì)組比較，血清E2水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組2與假手術(shù)組比較，Wnt16 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3和圖4。

3 討論

Wnt家族是富含分泌型半胱氨酸的糖蛋白，根據(jù)是否依賴β-catenin轉(zhuǎn)導(dǎo)，分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型[12-13]。Wnt16屬于Wnt家族，具有高度保守性，通過Wnt/βcatenin信號(hào)途徑，參與調(diào)控人類骨骼系統(tǒng)疾病[11]。Wnt16與配體結(jié)合后，通過活化低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白/卷曲蛋白受體，使β-catenin從β-catenin/糖原合酶激酶3β復(fù)合體中解離，引起β-catenin在胞質(zhì)中累積[14-15]。β-catenin表達(dá)量增加時(shí)，引起成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)活躍，促進(jìn)骨形成；β-catenin基因失活時(shí)，導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化而不是向成骨細(xì)胞分化[16-17]。因此，本研究采用去卵巢Wistar雌性大鼠，利用免疫組化、Western blot、RT-PCR法從蛋白質(zhì)、mRNA水平探討雌激素發(fā)揮骨保護(hù)的可能作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)切除大鼠雙側(cè)卵巢引起雌激素缺乏導(dǎo)致Wnt16 mRNA、β-catenin表達(dá)減少，Tb.N減小且排列稀疏、Tb.Th變薄且Tb.SP增寬，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[18]。給予外源性雌激素16周后，Wnt16 mRNA表達(dá)量升高[11]，提示W(wǎng)nt16的表達(dá)可能很大程度上依賴雌激素的作用，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為可能機(jī)制是，Wnt16啟動(dòng)子上含有功能性c-Jun結(jié)合位點(diǎn)[19]，雌激素直接和/或間接作用于Wnt16啟動(dòng)子，調(diào)控Wnt16的表達(dá)，激活Wnt16/βcatenin信號(hào)途徑，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)揮骨保護(hù)作用。此外，雌激素治療，可緩解因雌激素缺乏導(dǎo)致的骨髓環(huán)境中脂肪細(xì)胞的增多。Gao等[16]研究表明，17β-E2呈劑量依賴性，通過Wnt/β-catenin信號(hào)途徑抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。在鼠3T3-L1脂肪前體細(xì)胞中，β-catenin通過減少CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達(dá)[20]，抑制其分化為脂肪細(xì)胞。敲除β-catenin基因，可增加PPARγ表達(dá)，促進(jìn)骨髓環(huán)境的脂肪形成[21]。因此，雌激素可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)途徑抑制脂肪細(xì)胞形成，從而發(fā)揮骨保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，E2處理4周時(shí)，β-catenin即可增加，而Wnt16僅在16周時(shí)出現(xiàn)差異，這表明可能存在其他Wnt/β-catenin途徑參與雌激素調(diào)節(jié)的過程。馬威等[22]研究也證實(shí)，雌激素可以促進(jìn)Wnt2、β-catenin蛋白表達(dá)，通過調(diào)節(jié)Wnt2/βcatenin信號(hào)途徑促進(jìn)去卵巢后骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞增殖，這可能是引起Wnt16與β-catenin非同步變化的原因。

表2 各組骨組織OPG、RANKL、β-catenin表達(dá)水平比較

圖3 各組骨組織OPG、RANKL、β-catenin蛋白的表達(dá)

表3 各組骨組織Wnt16 mRNA及血清E2表達(dá)水平比較

圖4 骨組織Wnt16 mRNA擴(kuò)增曲線

RANKL是表達(dá)在成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞上的膜結(jié)合蛋白，可被金屬蛋白酶分解為可溶性RANKL，通過與RANK特異受體結(jié)合后活化成熟破骨細(xì)胞，最終引起骨質(zhì)吸收[23]。OPG是成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的可溶性誘導(dǎo)受體，通過與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，阻斷RANK/RANKL信號(hào)通路，抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性[4,23]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予雌激素16周后，促進(jìn)OPG表達(dá)、抑制RANKL表達(dá)，進(jìn)而增加OPG/RANKL比率，對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松有明顯的防治作用。因此，雌激素可能通過OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)發(fā)揮骨保護(hù)作用。

Movérare-Skrtic等[24]研究表明，成骨細(xì)胞來源的Wnt16可增加OPG表達(dá)，間接抑制破骨細(xì)胞分化，也可作用于破骨祖細(xì)胞，直接抑制破骨細(xì)胞生成；特異性敲除成骨細(xì)胞Wnt16基因，可導(dǎo)致OPG表達(dá)減少，破骨細(xì)胞數(shù)量增多，骨皮質(zhì)變薄，使骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。結(jié)合本研究，E2處理16周后，Wnt16、β-catenin、OPG表達(dá)增加。因此，雌激素可能作用Wnt16/β-β-catenin途徑后，進(jìn)一步作用于OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)發(fā)揮骨保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)研究。

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Effects of estrogen on Wnt16,β-catenin,OPG,RANKL expression in bone tissue of ovariectomized rats

WEI Shuangshuang, ZHANG Zhifen,HUANG Zheren,et al.Department of Obstetrics and Gynecology，Hangzhou Hospital of Nanjing Medical University, Hangzhou 310006，China

ObjectiveTo investigate the effects of estrogen on the expression of Wnt16,β-catenin,OPG,RANKL in bone tissue of ovariectomized rats.MethodsForty female Wistar rats were randomly dividedinto sham operation group, ovariectomized group,estrogen group 1 and estrogen group 2.In the estrogen groups,17β-E2was injected subcutaneously for 4 weeks or 16 weeks after ovariectomy,respectively.The other two groups were given the same volume of normal saline.The expression of Wnt16 mRNA was detected with RT-PCR,the expressions of OPG,RANKL,β-catenin proteins in bone cortex tissue were detected with Western blot and immunohistochemistry,respectively.The thickness of the trabecular bone(Tb.Th), number of trabecular bone(Tb.N)and thetrabecular spacing(Tb.SP)were measured using HE staining analysis,and serum E2level was determined by ELISA.ResultsCompared to ovariectomized group,The expression of OPG,β-catenin,Wnt16 mRNA in bone tissue,the serum E2levels,and Tb.Th,Tb.N in estrogen group 2 and sham operation group were significantly increased, the expression of RANKL and Tb.SP were significantly decreased(all P＜0.05).Compared to ovariectomized group the expression of β-catenin,serum E2,and Tb.Th,Tb.N in estrogen group 1 were significantly increased,the expression of RANKL and Tb.SP were significantly decreased(all P＜0.05).ConclusionEstrogen may prevent osteoporosis by up-regulation of Wnt16, β-catenin,OPG and down-regulation RANKL expression in bone tissue.

EstrogenWnt16β-cateninOPGRANKLOsteoporosis

2016-09-22）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-1489

國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)研究基金-浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生重大科技計(jì)劃（WKJ-ZJ-024）；浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2014C03044-1）；杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目2011Z003）；杭州市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目（20142013A58,20140733Q16）

310006南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院婦產(chǎn)科（魏雙雙、張治芬、黃哲人、何軼然、吳紅艷）；杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科（劉文華、湯珊珊、黃堅(jiān)）

張治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn