MALDI MSI在脂質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

李石磊，張陽(yáng)陽(yáng)，關(guān) 明，楊 慧，魏妍波，趙鎮(zhèn)文*

(1．中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所 活體分析實(shí)驗(yàn)室，北京質(zhì)譜中心，北京 100190;2．中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

MALDI MSI在脂質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

李石磊1,2，張陽(yáng)陽(yáng)1，關(guān) 明1,2，楊 慧1,2，魏妍波1，趙鎮(zhèn)文1,2*

(1．中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所 活體分析實(shí)驗(yàn)室，北京質(zhì)譜中心，北京 100190;2．中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

脂質(zhì)組學(xué)概念自2003年被提出以來，其已成為研究生物體、組織或細(xì)胞中脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及代謝途徑的一門學(xué)科。脂質(zhì)的種類眾多，同時(shí)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，脂質(zhì)的分析充滿了困難和挑戰(zhàn)?；|(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像(MALDI MSI)分析技術(shù)不僅可以進(jìn)行物質(zhì)鑒定，而且可對(duì)被分析物進(jìn)行空間分布成像，近年來，該技術(shù)廣泛地應(yīng)用于脂質(zhì)組學(xué)的研究。該文介紹了MALDI MSI在脂質(zhì)組學(xué)研究中的樣品處理、基質(zhì)噴涂及應(yīng)用方面的研究進(jìn)展，并就目前存在的問題及解決方案進(jìn)行了探討，以期擴(kuò)展MALDI MSI的應(yīng)用范圍。

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像；脂質(zhì)組學(xué)；樣品制備；基質(zhì)；標(biāo)志物;綜述

脂質(zhì)是組織結(jié)構(gòu)的重要組成成分。按照目前的推測(cè)，哺乳動(dòng)物體內(nèi)大約存在10 000～100 000種脂質(zhì)分子。按照脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，脂質(zhì)分子大體分為8大類：①脂肪酸類(Fatty acids)；②甘油酯類(Glycerolipids)；③甘油磷脂類(Glycerophospholipids)；④鞘脂類(Sphingolipids)；⑤固醇脂類(Sterol lipids)；⑥孕烯醇酮脂類(Prenol lipids)；⑦糖脂類(Saccharolipids)；⑧多聚乙烯類(Polyketides)。脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和種類的多樣性賦予其重要的生物學(xué)意義。研究表明，脂質(zhì)參與了包括能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸、信息識(shí)別與傳遞、細(xì)胞發(fā)育和分化、細(xì)胞凋亡等在內(nèi)的多種重要生命活動(dòng)[1-5]，還與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如腫瘤、動(dòng)脈硬化癥、糖尿病、肥胖癥、阿爾茨海默病等[6-7]。因此，定性定量分析脂質(zhì)以及研究其代謝極為重要。然而，脂質(zhì)分子種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分析困難，是長(zhǎng)期阻礙脂質(zhì)研究發(fā)展的絆腳石?；|(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像(Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging，MALDI MSI)分析技術(shù)憑借其高靈敏度以及可直接對(duì)生物樣品中脂質(zhì)檢測(cè)的特性，成為最具潛力的脂質(zhì)分析手段。

使用MALDI MSI進(jìn)行生物樣品脂質(zhì)成像分析時(shí)，通過采集同一個(gè)組織不同區(qū)域的質(zhì)譜圖，然后進(jìn)行疊加，可以獲得脂質(zhì)在樣品切片的分布情況。MALDI MSI分析脂質(zhì)有以下特點(diǎn)：①質(zhì)譜圖信號(hào)豐富。這是因?yàn)橹|(zhì)種類繁多，細(xì)胞膜內(nèi)外的磷脂、鞘脂和膽固醇含量豐富。②大部分脂質(zhì)信號(hào)集中在600～1 000 Da，這主要由脂質(zhì)的分子量決定。③正離子信號(hào)中PC類占很大比例。這是由于PC含量極高(細(xì)胞膜主成分)，并且，PC結(jié)構(gòu)中含有季銨基團(tuán)(永久正電性)，在正離子模式下檢測(cè)靈敏度高。

迄今為止，科學(xué)家已經(jīng)對(duì)包含大鼠鼠腦[8-12]、大鼠肝臟[8,13-14]、牛晶狀體[15-16]、小鼠子宮[17]以及幼鼠[18]在內(nèi)的多種組織進(jìn)行了脂質(zhì)成像的研究。眾多基質(zhì)如2,5-二羥基苯乙酮(2,5-Dihydroxyacetophenone,DHA)[19-22]、9-氨基吖啶(9-Aminoacridine,9-AA)[13]、1,5-萘乙二胺(1,5-Diaminonapthalene,DAN)[9]、2,5-二羥基苯甲酸(2,5-Dihydroxybenzoic acid,DHB)[23]、2-巰基苯并噻唑(2-Mercaptobenzothiazole,2-MBT)[14]、蒽三酚(Dithranol,DT)[15]和槲皮素(Quercetin)[24]等均被成功用于脂質(zhì)的檢測(cè)成像?，F(xiàn)階段MALDI MSI脂質(zhì)質(zhì)譜成像主要包含3個(gè)發(fā)展方向：其一是利用不同的方法(開發(fā)新的基質(zhì)或?qū)η衅M(jìn)行前處理優(yōu)化)獲得更豐富的質(zhì)譜信號(hào)，如采用有機(jī)揮發(fā)溶劑[25-26]或醋酸鈉溶液[27]沖洗切片除鹽，或使用酶溶液處理切片，以消除PC在正離子模式下對(duì)其他信號(hào)的抑制作用[28]。其二是通過更換基質(zhì)溶劑條件、優(yōu)化基質(zhì)噴涂條件或改進(jìn)儀器功能以求獲得更小的基質(zhì)結(jié)晶和更高的分辨率。如采用空氣噴槍噴涂DT基質(zhì)獲得微小結(jié)晶，并在10 μm分辨率下進(jìn)行脂質(zhì)成像[22]。其三是結(jié)合組織成像的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行疾病標(biāo)志物篩查、藥物分布等方面的研究[29]。

本綜述旨在介紹MALDI MSI在脂質(zhì)組學(xué)研究中的樣品處理、基質(zhì)噴涂及應(yīng)用方面的研究進(jìn)展，并就目前存在的問題及解決方案進(jìn)行探討，以期擴(kuò)展MALDI MSI在脂質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用。

1 MALDI MSI在脂質(zhì)組學(xué)研究中的樣品制備

典型的MALDI MSI流程如圖1所示，其中，樣品的制備是MALDI MSI分析中十分關(guān)鍵的步驟，直接關(guān)系到成像的質(zhì)量和所檢測(cè)物質(zhì)的種類及數(shù)量。樣品制備包括組織的獲得、儲(chǔ)存、切片制備、預(yù)處理、基質(zhì)噴涂等。對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理，如利用不同的溶劑對(duì)組織切片進(jìn)行洗劑，或者利用酶解的手段將干擾物除去，或者通過對(duì)低含量的脂質(zhì)分子的衍生化以達(dá)到增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度的目的，可以實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)某類脂質(zhì)。另外，基質(zhì)的噴涂是MALDI MSI分析的關(guān)鍵，包括基質(zhì)和噴涂方式的選擇兩方面，直接關(guān)系到成像質(zhì)量的好壞和所檢測(cè)物質(zhì)的種類及數(shù)量。

圖1 MALDI MSI分析流程圖Fig.1 The work flow diagram of the MALDI MSI analysis

1.1 洗 滌

由于組織切片中存在大量?jī)?nèi)源性堿金屬離子(Na+，K+)，因此在進(jìn)行MALDI MSI分析過程中會(huì)出現(xiàn)[M+Na]+或[M+K]+加合離子，這會(huì)導(dǎo)致所檢測(cè)到脂質(zhì)的相對(duì)豐度與實(shí)際分布相比發(fā)生偏差。Wang等[27]分別嘗試使用70%乙醇、水或150 mmol/L乙酸銨溶液對(duì)組織切片表面進(jìn)行洗滌，結(jié)果顯示，150 mmol/L乙酸銨溶液的處理不僅不會(huì)造成脂質(zhì)的丟失，而且使得PC和SM信號(hào)增強(qiáng)；本課題組Zhang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，使用乙醇洗滌鼠腦組織，然后利用3-氨基喹啉(3-AQ)作為基質(zhì)能夠大大增強(qiáng)負(fù)離子模式下MALDI MS對(duì)于神經(jīng)節(jié)苷脂(Gangliosides)類物質(zhì)的檢測(cè);Angel等[31]發(fā)現(xiàn)，使用pH 6.4的甲酸銨溶液或者pH 6.7的乙酸銨溶液對(duì)組織切片進(jìn)行洗滌能夠大大提高負(fù)離子模式下對(duì)于甘油磷脂類、硫苷脂類和神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度，相較于未洗滌處理的組織切片，信號(hào)提高程度能夠達(dá)到5倍，而且不影響MALDI MSI的成像分辨率。

1.2 酶 解

對(duì)8類脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)分析可知，甘油磷脂類(Glycerophospholipids)分子，尤其是其中的PC類物質(zhì)，由于本身極性較大,容易帶正電荷，且在組織中的含量較高，導(dǎo)致在正離子檢測(cè)模式下，甘油磷脂類物質(zhì)會(huì)對(duì)其他脂質(zhì)分子產(chǎn)生強(qiáng)烈的離子抑制效應(yīng)，使得對(duì)其他類脂質(zhì)的檢測(cè)成為難題。為解決這一問題，Vens-Cappell等[32]使用磷脂水解酶PLC(Phospholipase-C)，特異性地水解PC分子的極性端基，將PC分子轉(zhuǎn)化成為中性的DAG(Diacylglycerol，甘油二酯)分子。利用這種預(yù)處理方式，Vens-Cappell等將鼠腦和腎組織表面的PC分子水解，檢測(cè)到鞘糖脂類(Glycosphingolipids)脂質(zhì)分子，相較未處理前，信號(hào)強(qiáng)度提高了10倍。 Amoscato等[28]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于鼠腦組織，首先通過EDCI(1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]-carbodiimide hydrochloride)的化學(xué)處理，然后進(jìn)行PLC酶的水解處理，能夠大大增強(qiáng)在負(fù)離子模式下MALDI MS對(duì)于心磷脂類(Cardiolipins，CLs )物質(zhì)的檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)于鼠腦部位CLs的MALDI MSI成像分析。

1.3 衍生化

在MALDI MSI分析過程中，保持被分析物的位置不變十分重要，另外不引入新的雜質(zhì)也是十分必要的。然而，由于化學(xué)反應(yīng)條件復(fù)雜，所以通過化學(xué)衍生的手段提高M(jìn)ALDI MSI分析的靈敏度時(shí)很難避免上述兩個(gè)問題。對(duì)大部分分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的脂質(zhì)分子進(jìn)行原位衍生更是一件十分具有挑戰(zhàn)的課題。FA(Fatty acid，脂肪酸)是脂質(zhì)中分子結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的一類物質(zhì)，由于分子結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)羧基，所以只能在負(fù)離子模式下進(jìn)行直接檢測(cè)，然而由于其離子化效率低、在組織中的含量少、分子量小(200～400)易被基質(zhì)自身的信號(hào)干擾，因此用MALDI對(duì)FA類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)困難重重。2016年，Wu等[33]利用電噴霧在組織表面噴涂衍生化試劑2-Picolylamine的方法實(shí)現(xiàn)了在鼠腦組織表面的原位FA衍生化，結(jié)果顯示，通過該衍生化處理，在正離子模式下可以在鼠腦組織表面檢測(cè)到6個(gè)FA成像信號(hào)，成像結(jié)果表明被分析物未發(fā)生明顯位移。

2 MALDI MSI在脂質(zhì)組學(xué)研究中的基質(zhì)使用

基質(zhì)的使用是MALDI分子離子化的基礎(chǔ)，所以基質(zhì)的使用非常重要，也是易受人為操作影響的步驟?；|(zhì)的使用主要包括兩個(gè)方面：基質(zhì)的選擇和基質(zhì)的噴涂方式。

2.1 基質(zhì)的選擇

有機(jī)小分子基質(zhì)，如DHB，CHCA，9-AA，MBT，3-AQ等，是進(jìn)行脂質(zhì)分析中使用最多的一類基質(zhì)，DHB在正負(fù)離子模式下皆可使用，CHCA和MBT主要用于正離子模式檢測(cè)，9-AA和3-AQ主要用于負(fù)離子模式檢測(cè)。通常的選擇策略是：正離子模式選擇酸性基質(zhì)，負(fù)離子模式選擇中性或堿性基質(zhì)。然而，隨著MALDI技術(shù)的不斷發(fā)展、脂質(zhì)研究的不斷深入，常見的有機(jī)小分子基質(zhì)無(wú)法完全滿足研究的需要，新型的有機(jī)小分子基質(zhì)、離子液體基質(zhì)以及無(wú)機(jī)納米材料基質(zhì)等不斷填補(bǔ)著傳統(tǒng)基質(zhì)的不足。

2.1.1 有機(jī)小分子基質(zhì) 有機(jī)小分子基質(zhì)是最早使用的MALDI基質(zhì)，對(duì)MALDI技術(shù)的發(fā)展起到了極大的推進(jìn)作用。近年來，隨著研究的深入，傳統(tǒng)有機(jī)小分子基質(zhì)已不能滿足要求，如在低m/z區(qū)域(<500 Da)出現(xiàn)的大量基質(zhì)信號(hào)影響到小分子物質(zhì)的檢測(cè)，對(duì)于中性的脂質(zhì)如甘油三脂(TAG)、甘油二酯(DAG)、膽固醇酯(CE)等的離子化效率較低，在磷脂(PLs)類物質(zhì)分子產(chǎn)生強(qiáng)烈離子抑制情況下無(wú)法進(jìn)行有效的檢測(cè)[34]。另外，有機(jī)小分子基質(zhì)在使用過程中由于存在重結(jié)晶的過程，基質(zhì)結(jié)晶的大小和均勻度很難控制，而且易導(dǎo)致“甜點(diǎn)”出現(xiàn)。由于MALDI離子化的機(jī)理尚不完全清晰，絕大部分有機(jī)小分子基質(zhì)都是偶然或是基于經(jīng)驗(yàn)嘗試中得到的，因此開發(fā)該類基質(zhì)具有挑戰(zhàn)性。Wang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，羥基黃酮類化合物可以作為基質(zhì)進(jìn)行MALDI MSI分析，在正離子模式下，該類物質(zhì)對(duì)于磷脂類分子具有很好的解析能力，其中1個(gè)化合物槲皮素可從鼠腦組織切片中解析到212種脂質(zhì)，顯著優(yōu)于常用的有機(jī)小分子基質(zhì)DHB，CHCA和MBT等，并且該類物質(zhì)還具有易于形成均勻結(jié)晶薄層、真空條件下穩(wěn)定、自身信號(hào)低、用量少等優(yōu)點(diǎn)；Nie課題組[36-38]近年來在研究中發(fā)現(xiàn)，萘的衍生物二氨基萘及其鹽酸鹽和N-(1-萘基)乙二胺及其鹽酸鹽或硝酸鹽作為基質(zhì)在負(fù)離子模式下對(duì)小分子化合物具有很好的解析能力。

2.1.2 離子液體基質(zhì) 因?yàn)榫哂械驼羝麎汉蛯?duì)被分析物高的溶解度，離子液體被廣泛應(yīng)用于許多分析技術(shù)(如氣相色譜)。低蒸汽壓可保證離子液體在高真空條件下不易揮發(fā)，溶液狀態(tài)使得離子液體對(duì)于被分析物具有良好的溶解能力，Armstrong等[39]首次嘗試?yán)秒x子液體作為基質(zhì)進(jìn)行MALDI MS分析，結(jié)果顯示使用離子液體作為基質(zhì)可以得到均勻的樣品溶液，有效避免了“甜點(diǎn)”的出現(xiàn)，而且有些離子液體的解析能力優(yōu)于固體基質(zhì)。此后,Lemaire等[40]制備了離子液體CHCA/aniline作為基質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用該基質(zhì)后，MALDI MS具有檢測(cè)靈敏度更高，共結(jié)晶更加均勻，正負(fù)離子模式均可使用，以及易得到二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)等優(yōu)點(diǎn)。 Chan等[41]利用CHCA與1-Methylimidazole制備得到離子液體lmCHCA，然后使用lmCHCA作為基質(zhì)對(duì)鼠腦組織進(jìn)行MALDI MSI分析，發(fā)現(xiàn)該離子液體基質(zhì)對(duì)于鼠腦組織中的神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)具有較強(qiáng)的解析能力，而且避免了唾液酸端基斷裂。Meriaux等[42]利用有機(jī)堿分別與2,5-DHB和2,6-DHAP(2,6-Dihydroxyacetophenone matrix)反應(yīng)制備了多種離子液體，結(jié)果表明，以形成的離子液體作為基質(zhì)對(duì)于磷脂類化合物的解析靈敏度并未下降，而且能夠克服2,5-DHB作為基質(zhì)容易產(chǎn)生不均勻基質(zhì)結(jié)晶和2,6-DHAP在真空條件下易揮發(fā)的不足，體現(xiàn)出離子液體基質(zhì)的優(yōu)勢(shì)。但是大部分離子液體基質(zhì)對(duì)于脂質(zhì)的解析能力并無(wú)明顯提升，而且存在保存時(shí)間短、影響成像分辨率等不足。因此，該類基質(zhì)只能作為有機(jī)小分子基質(zhì)的補(bǔ)充，還亟待改進(jìn)和提高。

2.1.3 無(wú)機(jī)納米材料基質(zhì) 無(wú)機(jī)納米材料基質(zhì)是近年來發(fā)展較快的一類基質(zhì)。相較于傳統(tǒng)的有機(jī)小分子基質(zhì)，該類物質(zhì)作為基質(zhì)在MALDI MS中背景信號(hào)低，具有較強(qiáng)的耐鹽性，對(duì)于提高小分子區(qū)域(<500 Da)物質(zhì)的檢測(cè)效果明顯。Hayasaka等[43]利用平均粒徑為(3.84±0.45) nm的AgNPs(銀納米顆粒)在負(fù)離子模式下從鼠肝組織中檢測(cè)到DHB不能檢測(cè)的6種FA，棕櫚酸的檢出限甚至達(dá)到50 pmol，并完成了這幾種FA在老鼠視網(wǎng)膜組織中的MALDI MSI分析;Jackson等[44]研究發(fā)現(xiàn)，使用粒徑為6 nm的AgNPs作為基質(zhì)，在負(fù)離子模式下對(duì)甘油磷脂類分子具有較強(qiáng)的解析能力，在正離子模式下對(duì)于甘油酯類化合物TAG具有較強(qiáng)的檢測(cè)能力；Goto-Inoue等[45]研究發(fā)現(xiàn)(4.3±0.7) nm粒徑的AuNPs(金納米顆粒)作為基質(zhì)在負(fù)離子模式下對(duì)于糖鞘脂類化合物(GM3,GM2,GM1,GD1,GD3)具有極強(qiáng)的解析能力，檢測(cè)靈敏度比DHB基質(zhì)大約高20倍；Dufresne等[46]利用AuNPs作為基質(zhì)，正離子檢測(cè)模式下成功檢出鼠肝組織中的25種TAG，該信號(hào)強(qiáng)度大約是DHB的30倍，檢出的TAG種類幾乎是DHB的4倍，另外，對(duì)于DAG和CE等中性脂質(zhì)也具有良好的解析效果；TiO2NPs(二氧化鈦納米顆粒)由于具有對(duì)紫外光強(qiáng)吸收的特點(diǎn),Shrivas等[47]嘗試以其作為基質(zhì)，結(jié)果顯示，正離子模式下，TiO2NPs對(duì)于低分子區(qū)域(<500 Da)的物質(zhì)具有非常強(qiáng)的解析能力。另外，Chen等[48]研究發(fā)現(xiàn)碳納米管作為基質(zhì)在負(fù)離子檢測(cè)模式下對(duì)于小分子物質(zhì)FA、氨基酸、多肽等具有很強(qiáng)的解析能力，對(duì)于硬脂酸的最低檢出限能夠達(dá)到0.2 fmol。雖然無(wú)機(jī)納米材料基質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)有機(jī)小分子基質(zhì)的諸多特性，但無(wú)機(jī)納米材料的性質(zhì)與其制備方法、尺寸等密切相關(guān)，因此在使用該類材料作為基質(zhì)時(shí)必須考慮重復(fù)性的問題。

2.2 基質(zhì)的噴涂方式

目前，常用的基質(zhì)噴涂方式按機(jī)理的不同主要有3大類：①噴槍法；②升華法；③自動(dòng)噴霧法。其中噴槍法是操作最為簡(jiǎn)單、效率最高的基質(zhì)噴涂方式，但是受人為操作因素影響較大，重復(fù)性差；升華法可以制備均勻的基質(zhì)結(jié)晶薄層，但要求基質(zhì)在真空條件下具有一定的揮發(fā)性；自動(dòng)噴霧法是目前應(yīng)用最為廣泛，發(fā)展最為活躍的一種基質(zhì)噴涂方式，相較于前兩種方式，該方法具有基質(zhì)結(jié)晶較為均勻、自動(dòng)化程度高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，幾乎所有的基質(zhì)都可以使用該種方法并可獲得比較理想的噴涂效果，也是商業(yè)化的基質(zhì)噴涂裝置常用的噴涂方式。 Gemperline等[49]的研究表明，在MALDI MSI分析中，自動(dòng)噴霧法制備樣品的成像分辨率和重現(xiàn)性均優(yōu)于噴槍法，升華法是其中成像分辨率最高和重現(xiàn)性最好的基質(zhì)噴涂方法，但檢測(cè)到脂質(zhì)的種類最少；Guo等[50]的研究表明，利用高壓電噴霧的方法進(jìn)行NEDC(N-(1-萘基)乙二胺鹽酸鹽)噴涂能夠顯著增強(qiáng)在負(fù)離子模式下對(duì)小分子代謝物質(zhì)(如脂肪酸、核苷類物質(zhì)等)的檢測(cè)靈敏度。

3 MALDI MSI在脂質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

相較于LC-MS方法，MALDI MSI無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行萃取、純化、分離等復(fù)雜的前處理，并且保留了脂質(zhì)的原位信息，這些特點(diǎn)使得MALDI MSI分析方法在生物標(biāo)志物的識(shí)別、代謝機(jī)理的研究、犯罪科學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域均有著廣泛的應(yīng)用。

3.1 腫瘤標(biāo)志物的識(shí)別

脂質(zhì)尤其是其中的磷脂類物質(zhì)是細(xì)胞膜的主要構(gòu)成成分，在細(xì)胞中發(fā)揮了重要和多樣性的功能，包括化學(xué)能量的儲(chǔ)存、細(xì)胞膜和細(xì)胞器、細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、組織中細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用等。這些細(xì)胞過程與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、癌變、轉(zhuǎn)移等變化有著密切的聯(lián)系。因此，一些種類的脂質(zhì)在腫瘤組織中的含量會(huì)發(fā)生變化，且MALDI MSI分析技術(shù)非常適用于研究這種脂質(zhì)的空間位置變化。Jones等[51]利用MALDI FTICR-MS對(duì)腎細(xì)胞癌及其正常組織進(jìn)行綜合脂質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)m/z672的PC(26∶0) 和m/z718的PC(30∶3) 在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)有明顯升高，m/z723的PC(30∶2) 在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)較正常組織低；Ishikawa等[52]研究發(fā)現(xiàn)：相較于正常組織，在甲狀腺癌組織中有3種磷脂的含量明顯升高，分別是m/z798的PC(16∶0/18∶1) +K+，m/z796的PC(16∶0/18∶2) +K+和m/z741的SM(d18∶0/16∶1) +K+，這3種脂質(zhì)分子可以作為甲狀腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物;Uehara等[53]使用MALDI-TOF-MSI對(duì)人的胃癌組織和癌旁粘膜組織進(jìn)行綜合脂質(zhì)成像分析，結(jié)果顯示：m/z798的PC(16∶0/18∶1) +K+和m/z496的LPC(16∶0)+H+在胃癌組織中的表達(dá)分別高于和低于癌旁粘膜組織，分析表明LPCAT1(溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶1)在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁粘膜組織，并且與腫瘤的分化呈現(xiàn)正相關(guān)，與腫瘤浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；Morita等[54]利用MALDI MSI技術(shù)對(duì)肝癌組織的研究結(jié)果表明：相較于癌旁組織，腫瘤區(qū)域中sn-2位置被棕櫚酸或油酸取代的PC含量有明顯升高，正相反，sn-1位置被棕櫚酸取代的LPC含量有明顯降低。

Morita等的進(jìn)一步研究表明，肝癌組織中某些種類PC或LPC含量的改變是由于LPCAT1(溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶1)表達(dá)的異常升高所致，LPCAT1作為一種促進(jìn)LPC轉(zhuǎn)化為PC的酶會(huì)特異性地識(shí)別sn-1位置被棕櫚酸取代的LPC，并使其轉(zhuǎn)化為sn-2位置被棕櫚酸或油酸取代的PC，因此出現(xiàn)了肝腫瘤組織中特定種類PC含量升高、LPC含量降低的現(xiàn)象。Jiang課題組[55]通過比較擴(kuò)散性強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞系及擴(kuò)散性弱的乳腺癌細(xì)胞系中的脂質(zhì)信息發(fā)現(xiàn)，前者有31種脂質(zhì)的表達(dá)上調(diào)，8種脂質(zhì)的表達(dá)下降，這些脂質(zhì)分子或許可以作為乳腺癌疾病診斷的新的生物標(biāo)志物。

3.2 指紋成像

由于其獨(dú)特性，指紋一直是身份鑒定的重要依據(jù)，是刑偵鑒定中的關(guān)鍵證據(jù)。然而，對(duì)于指紋的檢測(cè)長(zhǎng)期依賴于信號(hào)增強(qiáng)的方法，主要通過物理或化學(xué)試劑與其中的某些成分結(jié)合或反應(yīng)，僅獲取了指紋的物理特征，而可能忽略了其他信息，比如嫌疑人在作案之前是否接觸過毒品、嫌疑人的性別、年齡、身體健康狀況等。質(zhì)譜成像技術(shù)為解析這些信息提供了可能。指紋中主要包含內(nèi)源性和外源性的物質(zhì)，內(nèi)源性的物質(zhì)主要包括金屬離子、脂質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)和維他命等；外源性的物質(zhì)主要是一些物質(zhì)的沾染(如藥物、化妝品、食物等)。這些物質(zhì)均可作為質(zhì)譜分析的對(duì)象。2009年，Wolstenholme等[56]首次使用MALDI MSI技術(shù)對(duì)指紋中的內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行了成像分析，結(jié)果顯示：利用CHCA作為基質(zhì)在正離子模式下共檢測(cè)到包括13-Aminotridecanoic acid、油酸、硬脂酸、十九烷酸、DAG、脫水膽固醇和Dimethyldioactadecylammonium在內(nèi)的7種脂質(zhì)，利用這些脂質(zhì)信號(hào)可對(duì)指紋的特征進(jìn)行清晰的成像，另外，將指紋表面的基質(zhì)洗滌后，還可以用常規(guī)的刑偵學(xué)方法對(duì)指紋進(jìn)行鑒定和掃描；2011年，F(xiàn)erguson等[57]通過改進(jìn)基質(zhì)噴涂方法，既實(shí)現(xiàn)了對(duì)指紋信號(hào)的增強(qiáng)又可以進(jìn)行指紋的質(zhì)譜成像分析，該文章稱之為“干-濕”法：首先將CHCA基質(zhì)粉末撒到指紋表面，然后將多余的粉末吹掉后進(jìn)行溶劑的噴涂，干燥后對(duì)指紋表面的CHCA基質(zhì)分別進(jìn)行紫外和熒光成像分析，最后通過質(zhì)譜成像分析以獲取指紋中的分子信息；另外，在犯罪現(xiàn)場(chǎng)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)交叉指紋，使用常規(guī)的染色方法很難獲取精細(xì)的重疊區(qū)域指紋圖譜，影響比對(duì)的成功率，由于不同的嫌疑人指紋中內(nèi)、外源性物質(zhì)的含量和種類差別較大，而Bradshaw等[58]利用MALDI MSI技術(shù)很好的解決了這一問題。

3.3 單細(xì)胞脂質(zhì)分析

分子生物學(xué)、腫瘤醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等的快速發(fā)展對(duì)分析技術(shù)提出了更高的要求，單細(xì)胞成像分析是目前面臨的挑戰(zhàn)之一。近年來，隨著MALDI MS技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，MALDIMS成像的分辨率可以達(dá)到10 μm以內(nèi)。Zavalin等[59]通過改造MALDIMS離子源由反射結(jié)構(gòu)變?yōu)橥干浣Y(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了1 μm以內(nèi)的成像分辨率，對(duì)HEK-293和RKO細(xì)胞成功進(jìn)行了MALDI MSI分析，m/z782的成像圖與光學(xué)圖像完全一致；Schober等[60]對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行了7 μm分辨率下的MALDI MSI成像分析，成像結(jié)果與光學(xué)圖像一致，而且對(duì)于磷脂分子和小分子物質(zhì)具有較高的檢測(cè)靈敏度。

3.4 臨床應(yīng)用

微生物疾病引起的死亡是人類死亡的主要原因，因此，病原菌的早發(fā)現(xiàn)對(duì)于感染的預(yù)防、控制和治療十分重要，也是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的迫切需求。相較于傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定手段，如表型特征觀察、16S核糖體RNA測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)等，MALDI MS檢測(cè)手段具有準(zhǔn)確度高、方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，適合于臨床應(yīng)用。近年來，MALDI MS技術(shù)在該領(lǐng)域發(fā)展迅猛，目前Bruker MicroflexBiotyper和bioMérieux VITEK MS兩種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的MALDI-TOF MS檢測(cè)方法獲得了FDA的批準(zhǔn)，在臨床中獲得了廣泛應(yīng)用。然而，該技術(shù)仍有一些不足，如對(duì)于十分相似細(xì)菌的鑒定仍然存在困難。脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展或許會(huì)為解決這一問題提供可能。Cox等[61]的研究表明，使用CeO2催化的MALDI-TOF MS脂肪酸分析方法，以脂肪酸作為指紋信號(hào)，可獲得100%準(zhǔn)確度的種類鑒定，98%準(zhǔn)確度的株系鑒定，準(zhǔn)確度明顯高于以上兩種商業(yè)化分析方法。

隨著研究的不斷深入，MALDI MSI技術(shù)在臨床應(yīng)用中也取得了重要進(jìn)展。傳統(tǒng)的MALDI MSI分析流程中，樣本的制備通常采用冰凍切片的形式，然而，福爾馬林固定-石蠟包埋(Formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)人體組織切片樣品是臨床組織學(xué)檢查最常用的保存形式。近年來，Walch課題組[62-63]發(fā)展了基于FFPE人體組織切片的MALDI MSI分析方法，該分析方法為MALDI MSI技術(shù)的臨床應(yīng)用提供了可能。該課題組對(duì)350位腫瘤患者的組織樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該方法不僅能夠區(qū)分正常組織與腫瘤組織，而且能夠區(qū)分來自于相同組織的不同種類腫瘤，另外還發(fā)現(xiàn)與腫瘤病人存活率相關(guān)的生物標(biāo)志物。由于臨床上對(duì)于組織分布的特異性要求較高，這就要求在進(jìn)行MALDI MSI過程中需要更高的成像分辨率，再加之，對(duì)于質(zhì)量分辨率的要求也越來越高，導(dǎo)致在進(jìn)行MALDI MSI分析過程中會(huì)生成龐大的數(shù)據(jù)和消耗過多的采集時(shí)間，這些問題都會(huì)給臨床應(yīng)用帶來挑戰(zhàn)。 Heijs等[64]開發(fā)了組織學(xué)引導(dǎo)的高分辨MALDI MSI分析新方法，該方法首先利用軟件將組織學(xué)染色的樣本圖片進(jìn)行區(qū)域標(biāo)記，然后對(duì)于標(biāo)記區(qū)域進(jìn)行高分辨MALDI MSI分析。與傳統(tǒng)的MALDI MSI分析流程相比較，該方法能夠大大縮短成像的時(shí)間和數(shù)據(jù)采集量，提高了分析效率。另外，Carter等[65]開發(fā)了對(duì)于肺活檢組織樣本的MALDI MSI分析新方法，該方法不僅能夠保存呼吸道系統(tǒng)的生理狀態(tài)，而且樣本制備過程不會(huì)影響到其他的臨床檢測(cè)手段。

4 問題及展望

經(jīng)過近20年的發(fā)展，MALDI MSI技術(shù)在脂質(zhì)組學(xué)研究中獲得了廣泛的應(yīng)用，極大地推動(dòng)了脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。然而，該技術(shù)目前仍然處于快速發(fā)展階段，MALDI MSI分析存在離子抑制效應(yīng)、靈敏度偏低、樣品分析的過程冗長(zhǎng)、基質(zhì)信號(hào)干擾、分辨率偏低、難以準(zhǔn)確定量、數(shù)據(jù)生物學(xué)意義解析困難等一系列問題，這些問題亟需進(jìn)一步研究。

采用有機(jī)揮發(fā)溶劑[25-26]或醋酸鈉溶液[27]沖洗切片除鹽，或使用酶溶液處理切片，可以消除部分高豐度脂質(zhì)對(duì)其他低豐度脂質(zhì)的信號(hào)抑制作用[28]。新基質(zhì)(如槲皮素、二氨基萘等)的應(yīng)用，可以極大提高特定脂質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。儀器性能，如激光性能的改進(jìn)及提高、質(zhì)譜儀器檢測(cè)速率的提高，對(duì)于樣品分析過程的縮短提供了可行性。無(wú)機(jī)納米材料基質(zhì)的應(yīng)用，對(duì)于解決傳統(tǒng)有機(jī)小分子基質(zhì)在m/z500以下區(qū)域的干擾提供了方案。新的基質(zhì)噴涂方法，使得更小的、更均一的基質(zhì)結(jié)晶成為可能，從而極大地提高了MALDI MSI成像的空間分辨率、重現(xiàn)性及定量能力?，F(xiàn)在，許多大學(xué)和國(guó)家科研機(jī)構(gòu)紛紛成立脂質(zhì)組學(xué)研究中心，如美國(guó)NIH資助的LIPIDMAPS、歐盟資助的LipidomicNet,包括早期的ELIfe(The European Lipidomics Initiative)(http://www.lipidomics.net)以及日本政府資助的Lipid Bank(http://www.lipidbank.jp)，華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的ORY研究小組和堪薩斯州立大學(xué)成立的脂質(zhì)組學(xué)研究中心以及格拉茨大學(xué)、奧地利科學(xué)院及格拉茨技術(shù)大學(xué)等研究機(jī)構(gòu)共同成立的格拉茨脂質(zhì)組學(xué)研究中心(Lipidomics Research Center Graz，LRCGraz)，新加坡國(guó)立大學(xué)也成立了以Wenk教授為首的Lipidprofile課題組。這些脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)等的建設(shè)，將推動(dòng)脂質(zhì)功能的研究及其生物學(xué)意義的研究?？傊?，隨著新型基質(zhì)的不斷開發(fā)、新的樣品制備方法的涌現(xiàn)、儀器性能的不斷改進(jìn)和提高、生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，MALDI MSI技術(shù)必將為脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展注入新的動(dòng)力。

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Application of MALDI MSI in Lipidomics Research

LI Shi-lei1,2,ZHANG Yang-yang1,GUAN Ming1,2,YANG Hui1,2,WEI Yan-bo1,ZHAO Zhen-wen1,2*

(1.Beijing Mass Spectrum Center,Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems,Institute of Chemistry Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

Lipidomics,firstly proposed in 2003,is an emerging field,where the structures,functions and dynamic changes of lipids in cells,tissues or body fluids are investigated.Studies have showed that the disturbance of lipid metabolism is closely related to some diseases,such as cancer,atherosclerosis,diabetes,obesity and Alzheimer disease.Therefore, the comprehensive analysis of lipid becomes significant.However,due to the diversity and complexity of lipids,lipids analysis is still full of challenges.Recently,Matrix-assisted laser desorption and ionization mass spectrometry imaging(MALDI MSI) has been developed quickly in lipidomics research.Compared with traditional LC-MS,MALDI MSI provides spatially resolved ion intensity maps corresponding to the mass-to-charge ratio of intact molecular species at specific locations in a prepared tissue sample,which is very useful in biomarker identification analysis,drug distribution analysis,etc.MALDI MSI is a relatively new technique,it still has many aspects needing further improved,such as small molecules detection,neutral lipids detection,ion suppression elimination,detection sensitivity improvement,etc.In MALDI MSI analysis,sample preparation,new matrix development and application research are the three hotspots.This review aims to introduce the research progress of MALDI MSI in sample processing,matrix coating and its application.The existing problems and possible solutions are discussed,in order to extend the application of MALDI MSI.

matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrum imaging(MALDI MSI);lipidomics;sample preparation;matrix;marker;review

2016-09-21；

2016-10-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(21575146，21321003，21405160)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.003

O657.63；O623.732

A

1004-4957(2017)02-0170-08

*通訊作者：趙鎮(zhèn)文，博士，研究員，研究方向：脂質(zhì)組學(xué)研究，Tel：010-62561239，E-mail：zhenwenzhao@iccas.ac.cn