遺傳和溫度因素對魚類性別分化相關(guān)基因表達及性別比例的影響

閆浩,梁利群,常玉梅,孫博,蘇寶鋒

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306)

遺傳和溫度因素對魚類性別分化相關(guān)基因表達及性別比例的影響

閆浩1、2,梁利群1,常玉梅1,孫博1,蘇寶鋒1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306)

魚類的性別決定機制較為復(fù)雜,是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果,具有很大的可塑性。隨著分子生物技術(shù)的不斷更新,對魚類性別決定及分化相關(guān)基因的鑒定和研究有了新的進展,環(huán)境因子如溫度、光照、pH、低氧、水壓等均能影響大多數(shù)魚類的性別決定和分化過程。本研究中,闡述了魚類遺傳型性別決定(GSD)和溫度依賴型性別決定(TSD)方式,并對TSD與遺傳型性別加溫度影響(GSD+TE)性別決定機制下,性別決定相關(guān)基因在雌雄異型中的表達及結(jié)合溫度誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)進行概述,分析了溫度對魚類性別比例的影響,并提出今后應(yīng)加強對性別決定基因的鑒定、解析和基因功能研究,為科學(xué)制定魚類繁殖計劃提供指導(dǎo)。

性別決定;遺傳型性別決定 (GSD);溫度依賴型性別決定 (TSD);性別比例;溫度效應(yīng)

作為脊椎動物中最低等的魚類,其性別決定和分化機制復(fù)雜多變,其中,性別是由遺傳和環(huán)境因素相互作用共同決定的。性別決定和分化類型主要分為3類:遺傳型性別決定(genetic sex determination,GSD)、溫度依賴型性別決定 (temperaturedependent sex determination,TSD)和遺傳型性別決定加溫度影響 (genetic sex determination plus temperature effect,GSD+TE)。魚類性別決定除了受基因控制外還受到其生活環(huán)境影響,由于其生活環(huán)境復(fù)雜,環(huán)境影響在性別決定和分化中甚至強于遺傳因素而發(fā)揮作用。這些環(huán)境因子包括光周期、溫度、pH、鹽度、溶氧量、水壓等。其中,溫度作為外界因素是最受關(guān)注的一個環(huán)境因子,溫度效應(yīng)影響性別決定和分化,從而影響后代的雌雄比例[1-2]。本研究中,對在TSD與GSD+TE性別決定機制下其相關(guān)基因在雌雄異型中的表達以及結(jié)合溫度誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)進行了概述,以期為進一步探究魚類性別決定及分化機制和生產(chǎn)實踐提供參考。

1 GSD和TSD型性別決定方式

在脊椎動物中,GSD和TSD型性別決定和分化具有不同的時空模式。GSD機制的受精卵在開始發(fā)育后,性別就已經(jīng)由個體染色體的組成所決定,在此后的發(fā)育過程中,受環(huán)境因素影響很小。然而TSD機制發(fā)生在性腺形成前期或性腺分化決定期,此時個體對溫度敏感,溫度不可逆地改變了動物的性別。TSD機制是通過GSD發(fā)揮作用。據(jù)報道,到目前為止總共有13科59種魚類的性別分化屬于TSD型。但是Ospina-álvarez等[3]認為,有試驗證據(jù)的魚類僅僅只有40種屬于TSD型,其余19種魚類可能由GSD和溫度效應(yīng)(GSD+TE)共同影響性別決定和分化過程。也有學(xué)者認為,即便是有試驗驗證的魚類屬于TSD,也可能僅代表某一個特殊地理位置的群體,比如在大西洋銀漢魚Menidia menidia中發(fā)現(xiàn)了依賴地理緯度的TSD群體,在高緯度地區(qū)生長的地理種群性別完全屬于GSD性別決定方式,而在中間緯度的地理種群性別屬于TSD性別決定方式;這可能是由于中緯度地區(qū)生長時間相對較長、溫度相對較高的生產(chǎn)季節(jié),有利于雌魚生產(chǎn)[4]。藍鰓太陽魚Lepomis macrochirus中存在2種性別決定方式。對溫度敏感的群體,TSD起主要作用,溫度升高后雄性比例多于雌性;對溫度不敏感的群體,溫度變化對雌雄性別比例未有顯著影響,但是存在遺傳性別與溫度效應(yīng)相互作用的性別決定方式 (GSD+TE)[5]。因此,在研究魚類TSD機制中,研究人員還需要考慮該物種是否存在不同緯度的地理種群,這些不同的地理種群是否存在溫度敏感家系或群體;當(dāng)把受TSD機制決定的群體置于極端溫度可控制的環(huán)境中,研究人員還需要考慮該物種在自然界中適宜的生長溫度變化等因素?，F(xiàn)有研究表明,魚類性別決定機制具有明顯的不穩(wěn)定性和性別分化的可塑性,這從一定程度可以證明GSD和 TSD間的過渡假說[5-6]。有學(xué)者認為,無論是TSD、GSD,還是GSD+TE機制,在某些特定環(huán)境比如極端溫度或?qū)嶒炇覘l件下,魚類能夠響應(yīng)環(huán)境條件 (如溫度)的變化,從而可能導(dǎo)致性別比例的失衡[5]。溫度效應(yīng)對性別分化所涉及的下游信號通路和TSD是相同的,這從另一個側(cè)面證實了魚類性別決定機制的不穩(wěn)定性和性別分化的可塑性。在漫長的進化過程中,魚類胚胎和個體發(fā)育進化出適應(yīng)各種自然環(huán)境的性別決定和分化機制。

2 雄性決定相關(guān)基因及其與TSD和GSD+TE的關(guān)系

2.1 Sox9基因

Sox(Sry-related HMG-box)是一類與哺乳動物睪丸決定基因相關(guān)的基因家族的總稱,在脊椎動物Sox基因家族中,共有40多個Sox基因成員。Sox基因在進化上相對保守,在雌雄個體基因組中均有存在,但在不同的物種間呈現(xiàn)出不同的表達模式[7]。在哺乳動物中,Sox基因家族的典型代表是Sry(sex-determining region of the Y chromosome)基因,對哺乳動物精巢的發(fā)育有著決定性作用。Sox9和Sry同屬于HMG-box家族,HMG-box在哺乳動物不同物種間相對保守,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用。Sox基因家族中與魚類性別決定相關(guān)的基因主要是Sox3、Sox8和Sox9等,其中Sox9與精巢形成關(guān)系最為密切[8]。在對大多數(shù)魚類如斑馬魚 Danio rerio、青鳉Oryzias latipes、三刺魚Gasterosteus aculeatus、黃鱔 Monopterus albus和虹鱒 Oncorhynchus mykiss等的研究中發(fā)現(xiàn),Sox9基因有兩個拷貝即Sox9a(Sox9a1)和Sox9b(Sox9a2)[9]。成年斑馬魚Sox9a基因在腦、肌肉、腎和精巢等多個組織中均有表達,但Sox9b基因只在卵巢中表達,表明Sox9a基因在精巢功能維持中發(fā)揮作用,Sox9基因在卵巢中可能獲得了一些新的功能,這可能與魚類復(fù)雜多樣的性別決定機制有關(guān)。Sox9基因在青鳉卵巢中表達,在精巢中未檢測到,通過系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和序列比對發(fā)現(xiàn),青鳉Sox9基因更接近于斑馬魚Sox9a基因,但Sox9基因在成年青鳉腦和卵巢中表達,這又和斑馬魚Sox9b基因表達相同,但是,斑馬魚Sox9b基因不在腦中表達,而青鳉Sox9基因卻又在大腦中表達,推測青鳉Sox9基因具備斑馬魚Sox9a和Sox9b兩個基因的功能特點[10]。Nakamoto等[11]為了搞清Sox基因在青鳉性別決定和分化中的作用,分離得到一種新的基因 Sox9a2/ Sox9b,成年青鳉Sox9b基因在腦、胸鰭和精巢中表達,在卵巢中不表達,這和斑馬魚Sox9a基因的表達模式相同,說明該基因與精巢形成有密切關(guān)系。在青鳉性別決定和分化早期,Sox9b基因在雌雄性腺間無差別表達;但是該基因在雄性精巢表達的同時,伴隨著Dmy基因的表達,而Dmy基因在卵巢中卻不表達。隨后,Sox9b基因只在精巢中表達,而在卵巢中的表達受到抑制,表明Sox9b基因可能不參與青鳉早期的性別決定和分化,但參與精巢的維持[12]。Nakamura等[13]通過轉(zhuǎn)基因和嵌合基因獲得青鳉Sox9b基因突變體,證實Sox9b基因不直接參與性別決定和分化,但對生殖細胞的維持是必需的。Sox9僅在尼羅羅非魚Tilapia nilotica精巢分化的后期特異性表達,它參與精巢的形成,而不參與雄性性別的決定或精巢的分化[14-15]。楊超[16]在研究尼羅羅非魚Sox家族成員過程中,報道了Sox9a/Sox9b在正常性腺發(fā)育過程的表達模式,同時利用TALEN技術(shù)對Sox9a/Sox9進行基因敲除,發(fā)現(xiàn)Sox9b可能參與了雌激素合成酶Cyp19a1a的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。另外Sox9a對精原細胞的減數(shù)分裂及精原細胞、精母細胞和精小葉的維持有著重要作用。

2.2 Dmrt1基因

Dmrt(double-sex and mab-3 related transcription factor)基因是指與果蠅Dsx(double-sex)基因和線蟲Mab-3基因同源的基因[17]。它是一類下游性別決定基因,它編碼的轉(zhuǎn)錄因子具有一個保守的DM(double-sex and male aberrant-3 relative domain)結(jié)構(gòu)域,靠特殊的鋅指樣結(jié)構(gòu)方式連接特定的DNA序列及調(diào)控下游基因的表達來發(fā)揮作用,在雄性性腺發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,調(diào)控性別決定和性別分化。不同物種間性別決定與分化的作用機制表現(xiàn)出復(fù)雜的多樣性,然而參與性別決定的下游基因相對保守[18]。Dmrt在基因結(jié)構(gòu)和功能上具有保守性。奧利亞羅非魚Dmrt1與尼羅羅非魚、黑鯛Sparus macrocephlus、黃鱔、新月魚Xiphophorus maculatus、虹鱒等魚類的Dmrt1氨基酸序列同源相似度分別為99%、80%、78%、73%、62%,說明Dmrt1基因在不同魚類中具有同源性[19]。

在硬骨魚中,Dmrt1基因在不同種類中的表達模式有所不同。對半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis Dmrt1α基因cDNA克隆與表達的研究發(fā)現(xiàn),Dmrt1α基因只在雄性精巢中表達,在雌性卵巢及雌雄魚鰓、脾、肝、腎等組織中不表達,具有組織特異性。另外,Dmrt1α基因也在性逆轉(zhuǎn)成功的雄魚中表達,而在性逆轉(zhuǎn)未成功的雌魚體內(nèi)沒有檢測到,說明Dmrt1α基因可能在半滑舌鰨精巢形成中發(fā)揮作用[20]。王婷茹[21]通過組織細胞定位研究發(fā)現(xiàn), Dmrt1基因特異性表達于尼羅羅非魚精巢支持細胞中。在雄性尼羅羅非魚性別決定的關(guān)鍵期5 dah (days after hatching)敲除Dmrt1基因,精巢發(fā)育畸形不能產(chǎn)生正常的生殖細胞[22]。在用雌二醇和芳香化酶抑制劑對尼羅羅非魚進行誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)的試驗中發(fā)現(xiàn),在性腺決定的關(guān)鍵期 (3～5 dah)使用藥物誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn),尼羅羅非魚體內(nèi)雌雄兩個通路同時被打開。如果Dmrt1基因參與的雄性通路受到抑制,則性腺朝著卵巢方向發(fā)育;相反,如果Cyp19a1a基因參與的雌性通路被抑制,則性腺朝著精巢方向發(fā)育[21]。這些結(jié)果均表明,Dmrt1基因可能在雄性性別決定和分化中發(fā)揮重要作用。

Dmrt1基因家族內(nèi),家族成員基因存在組織和時間表達差異性。Dmrt1基因在牙鲆 Paralichthys olivaceus的原始性腺、性腺分化期和分化的卵巢中表達水平均較低,在分化的精巢中表達強度迅速上升;Dmrt4在原始性腺中高表達,在其后性腺分化期間表達量降到較低水平,然后在分化的精巢中又呈高表達[23]。Winkler等[24]發(fā)現(xiàn),青鳉的 Dmrt1a 和Dmrt2-4在早期性腺中未檢測到表達,但在幼體發(fā)育分化中的性腺和雄性成體性腺中均有表達。

關(guān)于環(huán)境溫度對魚類Dmrt1基因表達量的研究只在少數(shù)幾種魚中有報道。在高溫誘導(dǎo)尼羅羅非魚性別分化相關(guān)基因表達分析中發(fā)現(xiàn),將溫度敏感期的幼魚分成3組 (誘導(dǎo)組、恢復(fù)組和對照組),誘導(dǎo)組雌魚性腺中Dmrt1基因表達量顯著上調(diào),這與高溫誘導(dǎo)半滑舌鰨雌魚性逆轉(zhuǎn)為雄魚性腺中Dmrt1表達量上調(diào)、未性逆轉(zhuǎn)成功的雌魚性腺中Dmrt1未表達的研究結(jié)果相同[25]。在對歐洲鱸魚 Dicentrarchus labrax的研究中發(fā)現(xiàn),150～200日齡魚的性腺中Dmrt1基因表達量持續(xù)上升,200日齡后雌性卵巢中Dmrt1表達量開始下降,300日齡時雄性精巢中Dmrt1表達量達到卵巢的6倍[26]。說明Dmrt基因在性腺發(fā)育形成早期的表達比較保守,之后在雄性性腺中表達較高,而雌性則相反,同時也說明Dmrt1基因在卵巢維持階段并非是必需的。與尼羅羅非魚不同,Dmrt1基因在歐洲鱸魚性腺中的表達時間晚于性腺分化 (90日齡)時間,表明該基因與高溫誘導(dǎo)雄魚機制間不存在必然聯(lián)系。

綜上所述,Dmrt1基因在不同魚類表現(xiàn)出不同的表達模式,但可以肯定,該基因在精巢分化與高溫誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)的過程中發(fā)揮了重要作用,但解釋該基因在性腺發(fā)育機制過程中發(fā)揮的具體作用還需進一步研究。

2.3 Amh基因

Amh抗繆勒氏管激素 (Anti-müllerian hormone),也稱抗繆勒氏管抑制因子?？娎帐瞎芗礊檩斅压艿那吧?屬于TGF-β家族成員,由Stertoli細胞分泌,與其他TGF-β家族成員不同,Amh主要通過Amh/AmhII通路在性腺分化和發(fā)育中發(fā)揮作用。在雄性哺乳類、鳥類和爬行類中,Amh由睪丸支持細胞分泌,具有使繆勒氏管退化作用;在雌性動物卵巢中,Amh主要由顆粒細胞分泌,少量在卵巢膜細胞表達,抑制雌性生殖器官形成。因此, Amh基因在雄性性別決定和分化中起到重要作用。

繆勒氏管結(jié)構(gòu)只存在于某些古老的魚類如鱘魚中,目前所報道的近代硬骨魚類中不存在此結(jié)構(gòu)。在硬骨魚類中雖然沒有繆勒氏管,但在幼魚發(fā)育和成熟的性腺中也檢測到了Amh基因的存在,且在雌雄性別間呈二態(tài)性表達,說明Amh可能參與性腺的分化和雄性性腺的維持。在斑馬魚、鮭、尼羅羅非魚中,Amh基因在性腺未分化階段均呈低水平表達;而在性腺分化過程中,它在精巢中的表達量要顯著高于卵巢。但也有例外,例如青鳉從孵化到性腺分化再到性成熟過程中,Amh基因在不同性別分化階段中的表達水平均無顯著性差異[27]。

通過Western blot技術(shù)對尼羅羅非魚的研究發(fā)現(xiàn),成魚性腺組織中Amh基因均有表達。利用免疫組化技術(shù)對Amh基因進行定位發(fā)現(xiàn),Amh基因在卵巢顆粒細胞和鞘膜細胞中表達,在精巢中表達于Stertoli細胞[17]。這與Rodríguez-Marí等[28]對斑馬魚的研究結(jié)果相同。在對Amh基因在半滑舌鰨胚胎發(fā)育過程不同時間節(jié)點的作用研究中發(fā)現(xiàn):受精后20、25 h,Amh表達量顯著高于其他時間段;在孵化后至70 d前,Amh基因表達量在雄性魚中一直處于較低水平,在70 d時達到峰值;而在卵巢中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,孵化后133 d達到峰值;但8月齡的雄性半滑舌鰨Amh基因表達量出現(xiàn)一個低谷,其原因可能是雄激素和生精細胞共同抑制了Amh的表達[29]。用E2誘導(dǎo)雄性尼羅羅非魚和半滑舌鰨性逆轉(zhuǎn)中發(fā)現(xiàn),Amh基因表達不明顯。用芳香化酶抑制劑誘導(dǎo)雌性尼羅羅非魚和半滑舌鰨時發(fā)現(xiàn),Amh表達量逐漸上升[21,29]。推測Amh基因在精巢決定和分化中發(fā)揮重要作用。

另外還發(fā)現(xiàn),Amh基因的表達受外部激素的影響,將斑馬魚暴露于17α-E2中,Amh基因表達明顯受到抑制,同時精巢發(fā)育受阻或停滯[30]。目前,關(guān)于魚類中Amh基因及在AmhR-II信號通路中的功能研究較少,還需進一步探究。

3 雌性決定相關(guān)基因及其與TSD和GSD+TE的關(guān)系

3.1 Cyp19a1a和Cyp19a1b基因

芳香化酶是一種催化雄激素合成雌激素的關(guān)鍵酶和限速酶。芳香化酶的主要作用是將某些雄激素(睪酮等)轉(zhuǎn)化為雌激素,促進肝臟中卵黃蛋白原的合成及卵子中卵黃的形成與積累,為卵細胞的發(fā)育提供能量保證[31]。但是,過高的芳香化酶生物活性反而使17α、20β-黃體酮的合成受到抑制,阻止了卵母細胞的正常成熟和排卵。在硬骨魚類中,有兩種基因編碼 Cyp19a1a和 Cyp19a1b。Cyp19a1a基因也稱作性腺(卵巢)芳香化酶基因(或P450aromaA),其主要在分化和成熟的性腺中表達;而 Cyp19a1b基因又稱作腦芳香化酶基因(或P450aromaB),在腦中大量表達[32-33]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,研究人員對芳香化酶的表達進行了細胞定位,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)硬骨魚類Cyp19a1a基因主要在卵巢顆粒細胞和間質(zhì)細胞中表達,而關(guān)于其在腦組織中的表達情況卻較少報道。

采用Windows系統(tǒng)中自帶的畫圖工具—“畫圖”可以很形象地繪制圖形、文字、箭頭等圖文符號描述所要講述的內(nèi)容。下面探討用一套圖形符號來講解《C#程序設(shè)計》課程的部分內(nèi)容。

Cyp19a基因的表達具有時空特異性。在魚類性腺分化前和分化中均可以檢測到Cyp19a的表達,它和溫度誘導(dǎo)魚類性逆轉(zhuǎn)有直接關(guān)系[34]。在牙鲆性腺未分化之前 (50 dah),Cyp19a在雌雄群體中無差異表達。但在性腺開始分化后 (60 dah), Cyp19a在牙鲆雌性性腺中表達量顯著上升,然而在雄性性腺中卻明顯下降[35]。此外,Kitano等[35]報道:在高溫誘導(dǎo)牙鲆雌魚性逆轉(zhuǎn)為雄魚過程中, Cyp19a基因的表達受到抑制;研究中還表明,低表達量的Cyp19a是精巢分化的必須條件,高表達量的Cyp19a在卵巢分化過程中必不可少。還有研究表明,牙鲆在性腺分化過程中促卵泡素 (FSH) 和Foxl2參與了 Cyp19a的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,高溫抑制Foxl2和FSHr基因的表達[36]。對尼羅羅非魚體內(nèi)和體外試驗證明了Foxl2依靠其自身叉狀結(jié)構(gòu)域,結(jié)合在Cyp19a基因的啟動子ACAAATA序列,從而激活Cyp19a基因的表達。然而在歐洲黑鱸中,高溫誘導(dǎo)Cyp19a啟動子區(qū)域甲基化,通過阻止Foxl2和sf-1結(jié)合在啟動子區(qū)域,抑制了Cyp19a在溫度誘導(dǎo)的雄魚中表達[37]。在尼羅羅非魚中, Dmrt1通過抑制Ad4BP/sf-1的活性抑制Cyp19a的表達,Dmrt1通過抑制Cyp19a的轉(zhuǎn)錄表達和雌性激素產(chǎn)生抑制雌性性腺分化[21]。這些研究表明, Cyp19a基因是一個下游性別決定基因,上游基因可能激活了未分化的性腺轉(zhuǎn)化為卵巢和精巢。

用芳香化酶抑制劑處理尼羅羅非魚和青鳉,可使雌性的卵巢組織向精巢組織過渡,雌激素合成受阻,說明雌激素在已分化的卵巢組織維持中發(fā)揮了重要作用。利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)在雌性尼羅羅非魚卵巢中成功敲除Cyp19a1a基因,結(jié)果4月齡雌魚卵巢性逆轉(zhuǎn)為精巢結(jié)構(gòu),表明Cyp19a1a基因在尼羅羅非魚的性別決定和分化中發(fā)揮著重要作用。同樣,敲除雌性尼羅羅非魚Cyp19a1b基因,5月齡的雌性個體與對照組相比,原始生殖細胞不能進行正常的減數(shù)分裂,卵原細胞發(fā)育停滯,卵巢不能正常發(fā)育。通過ELISA測得雌魚血清中雌激素水平顯著降低。將Cyp19a1a基因在雄性尼羅羅非魚中過量表達,結(jié)果顯示,雄魚不會發(fā)生性逆轉(zhuǎn),其原因可能是雄性個體性腺發(fā)育的早期階段多數(shù)類固醇激素合成基因 (包括Cyp19a1a和Cyp19a1b)未表達,因此,缺乏類固醇類激素的合成途徑,所以即使在雄性個體中過量表達Cyp19a1a基因也不能促使其向卵巢方向轉(zhuǎn)化,即不會發(fā)生性逆轉(zhuǎn)[38]。

Cyp19a1a基因的表達與溫度密切相關(guān),并且Cyp19a1a基因可能是性別決定通路上的下游基因,不參與早期的性別決定,但在性別分化過程中發(fā)揮作用。尼羅羅非魚性腺形態(tài)學(xué)分化前,雌性個體中Cyp19a1a的表達量顯著高于雄性[39], 說明Cyp19a1a基因在尼羅羅非魚性腺決定及分化過程中發(fā)揮作用。在大西洋比目魚 Hippoglossus hippoglossus的研究中也有類似結(jié)果[40]。歐洲鱸魚無論在性腺分化前還是性腺分化中,即便高溫誘導(dǎo)會產(chǎn)生更多的雄魚 (73%),Cyp19a1a基因表達量在雄性和雌性生產(chǎn)溫度下也未有顯著差異[41]。

在大多數(shù)具TSD的硬骨魚中,通過高溫處理使Cyp19a1a基因啟動子甲基化和誘導(dǎo)Dmrt1基因的表達來使Cyp19a1a基因表達量下調(diào),使雌激素的合成受到抑制,進而導(dǎo)致雌性通路的發(fā)生受到抑制[5,42]。盡管對Cyp19a1a基因下調(diào)在卵巢發(fā)育過程中的作用還存在不同的說法,但可以肯定的是,在魚類性別決定及分化機制中該基因是一個很好的性別標(biāo)記基因,并發(fā)揮著重要作用。

3.2 Foxl2基因

Foxl2(forkhead domain transcription factor gene 2)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子,是一種在眼瞼、卵巢顆粒細胞和卵巢維持中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。Foxl2基因發(fā)生突變會導(dǎo)致眼瞼畸形和卵巢退化[43]。該基因在哺乳動物中被確定為雌性相關(guān)基因,并參與早期卵巢的發(fā)育和分化,與卵巢功能的維持相關(guān),呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)性,雌性中的表達量顯著高于雄性[44]。對稀有鮈鯽 Gobiocypris rarus Foxl2基因表達研究發(fā)現(xiàn),Foxl2在肝、肌肉、鰓等組織中均有表達,在卵巢中的表達量顯著高于精巢[45]。

在青鳉孵化的早期階段,Foxl2在雌雄性腺中均有微弱表達,隨后Foxl2基因的表達貫穿于整個卵巢發(fā)育的顆粒細胞中,在卵黃泡發(fā)育后期,成熟的卵泡內(nèi)Foxl2基因表達消失,然而在精巢中也未見其表達[50]。Foxl2并不是性別決定基因,但在卵巢分化后Foxl2開始表達,說明Foxl2基因在顆粒細胞的分化和卵巢的維持中發(fā)揮作用。在對具TSD牙鲆的研究中發(fā)現(xiàn),性腺分化的敏感期,不同的溫度處理對性別比例會產(chǎn)生明顯的不同作用,在牙鲆性別決定期 (30～100 dah),高溫 (27℃)處理使雌魚性逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生全雄魚,正常溫度 (18℃)養(yǎng)殖使雄魚性逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生全雌魚,在高溫條件下性腺中Foxl2基因表達受到抑制,表明Foxl2基因可能參與具TSD魚類雌性的性別決定和分化過程[36]。

4 溫度對魚類性別比例及生產(chǎn)的影響

對大多數(shù)硬骨魚類的研究發(fā)現(xiàn),影響性腺早期分化方向的有效溫度處理時間,應(yīng)該在組織學(xué)性腺分化前或至少與其同步[51]。奧利亞羅非魚在34℃時產(chǎn)生97.8%的雄性后代,在27℃ 時雄性率為63%,在21℃ 時性腺分化時間延長,表明高溫會使奧利亞羅非魚偏雄性化[52]。Azaza等[53]對尼羅羅非魚研究發(fā)現(xiàn):在溫度為26、30℃ 時,尼羅羅非魚的平均體質(zhì)量顯著高于22、34℃時;在26、30℃ 時,飼料轉(zhuǎn)化率及日增重更好;當(dāng)溫度超過閾值36.9℃時,存活率降低為60%～81%,表明當(dāng)溫度升高到一定程度會明顯降低存活率。另外,在牙鲆和金魚Carassius auratus水產(chǎn)動物中發(fā)現(xiàn),高溫時魚體均有利于向雄性化趨勢發(fā)展[54-55]。

Luckenbach等[56]在對牙鲆研究中發(fā)現(xiàn),高溫和低溫均會使雄性率增大,28℃時雄性率為96%, 18℃時雄性率為78%。在不同溫度處理下,歐洲鱸魚的雌雄比例和死亡率均有顯著性差異,在15℃時雌性率最高,但是生長速度減慢,死亡率升高。將受精卵放到17℃ 環(huán)境培育至53日齡,可以使鱸魚雌性率和生長速度達到一個平衡,更好地用于集約化生產(chǎn)[41]。

溫度敏感期和魚的個體生長、性腺分化發(fā)育間存在相互關(guān)聯(lián)。對大西洋銀漢魚的研究發(fā)現(xiàn),溫度敏感期與體長 (8～21 mm)有關(guān),過了這個階段即使溫度改變對性別比例也沒影響;高溫導(dǎo)致雄性化,低溫導(dǎo)致雌性化[57]。對斑點叉尾鮰的研究表明,性腺分化與年齡、體長和溫度有一定的相關(guān)性,PGC最早出現(xiàn)于 7 dah(體長為 10～10.5 mm)分化的性腺中,卵巢的分化發(fā)育關(guān)鍵時期為受精后22～90 d,精巢的分化發(fā)育關(guān)鍵時期則為90～102 d,在受精后10～24 d連續(xù)用高溫 (34℃)處理可以誘導(dǎo)高比例的雌性 (1.68雌∶1 雄)[58]。

水產(chǎn)動物性別決定及分化具有很大的可塑性,環(huán)境溫度確實能改變水產(chǎn)動物的性別決定和性腺發(fā)育分化過程。通過改變培育受精卵、仔魚和幼魚的水體養(yǎng)殖溫度,可以改變魚類的性別比例。在雌、雄魚經(jīng)濟性狀差異較大的養(yǎng)殖魚類中,通過聯(lián)合雌核發(fā)育、雜交育種、溫度誘導(dǎo)等遺傳育種手段,可以生產(chǎn)單性種群[59]。牙鲆 “北鲆1號”的培育過程就是采用了雌核發(fā)育技術(shù)和溫度誘導(dǎo)的育種手段,待牙鲆雌核發(fā)育的二倍體孵化后,在30～100日齡利用高溫 (28℃)可以誘導(dǎo)偽雄魚產(chǎn)生;通過控制溫度達到培育全雌魚苗,以提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和獲得經(jīng)濟價值高的商品魚,是一種既簡便環(huán)保同時又具備實際應(yīng)用價值的人工誘導(dǎo)性別分化方式[60]。

5 存在問題及展望

目前,對于魚類性別決定及分化機制的研究主要存在如下問題:(1)隨著全球氣候變暖,自然水體的溫度也將升高,這很有可能改變自然水體中溫度敏感魚類群體的性別比例;魚類性別比例的改變又可能導(dǎo)致該種群的滅絕[61]。對于某些溫度敏感群體,它們可能不能迅速適應(yīng)全球變暖所帶來的不良影響。(2)目前,常使用外源性激素來誘導(dǎo)魚類性別分化、培育單性魚苗供水產(chǎn)養(yǎng)殖的方法存在一定隱患,可能會帶來食品安全性風(fēng)險,損害消費者健康,影響水生態(tài)環(huán)境。(3)在研究外界環(huán)境對魚類的性別決定及分化影響中,溫度是研究最多的因子,其他環(huán)境因子是否也能影響其分化過程,現(xiàn)在還尚不清楚。(4)在利用溫度對魚類進行性別控制中,應(yīng)考慮在加熱和制冷過程中對生產(chǎn)設(shè)備及技術(shù)的要求,是否能產(chǎn)生更大的經(jīng)濟效益。(5)性別分化前后,相關(guān)基因的表達上調(diào)或下調(diào)是魚類性腺發(fā)育的原因還是結(jié)果,目前尚不清楚,魚類性別多基因決定的具體作用模式也不清楚[62]。

近年來,隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和測序平臺的不斷完善,對物種進行de novo測序和重測序的成本大大降低,水產(chǎn)動物性別決定和分化相關(guān)基因篩選研究取得了一些重要進展。加強對水產(chǎn)養(yǎng)殖物種基因組資源的挖掘有助于性別決定基因和信號通路的發(fā)現(xiàn),這將在一定程度上助力性別控制技術(shù)和單性苗種的培育研究。目前,雖然對外界環(huán)境因素影響魚類性別決定和分化的具體作用機制還不十分清楚,但隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的不斷發(fā)展,將會使研究者更深入地從分子水平解釋魚類性別決定和分化機制。此外,結(jié)合基因敲除和基因編輯技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用,可以加強對性別決定基因的鑒定、解析和基因功能性研究,這為實現(xiàn)苗種的人工性別控制,闡明魚類性別決定和分化機制提供了重要的技術(shù)手段。

[1] 周賀,李佳奇,馬海艷,等.低溫誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄性化及性腺分化的組織學(xué)觀察[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2015,30(1):41-47.

[2] Hayashi Y,Kobira H,Yamaguchi T,et al.High temperature causes masculinization of genetically female medaka by elevation of cortisol[J].Molecular Reproduction and Development,2010,77(8): 679-686.

[3] Ospina-álvarez N,Piferrer F.Temperature-dependent sex determination in fish revisited:prevalence,a single sex ratio response pattern,and possible effects of climate change[J].PLoS One, 2008,3(7):e2837.

[4] Munch S B,Conover D O.Nonlinear growth cost in Menidia menidia:theory and empirical evidence[J].Evolution,2004,58(3): 661-664.

[5] Shen Zhigang,Wang Hanping.Molecular players involved in temperature-dependent sex determination and sex differentiation in teleost fish[J].Genetics Selection Evolution,2014,46(1):26.

[6] Valenzuela N.Evolution and maintenance of temperature-dependent sex determination[M]//Valenzuela N,Lance V.Temperature Dependent Sex Determination in Vertebrates.Washington,DC: Smithsonian Institution Press,2004:131-147.

[7] 尚曉莉,曲憲成.魚類性別決定和性別分化機制研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(4):245-248,330.

[8] 路暢,蘇利娜,朱邦科.魚類性別決定及分化相關(guān)基因研究進展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,53(13):2981-2986.

[9] Chiang E F L,Pai C I,Wyatt M,et al.Two Sox9 genes on duplicated zebrafish chromosomes:expression of similar transcription activators in distinct sites[J].Developmental Biology,2001,231(1): 149-163.

[10] Yokoi H,Kobayashi T,Tanaka M,et al.Sox9 in a teleost fish, medaka(Oryzias latipes):evidence for diversified function of Sox9 in gonad differentiation[J].Molecular Reproduction and Development,2002,63(1):5-16.

[11] Nakamoto M,Suzuki A,Matsuda M,et al.Testicular type Sox9 is not involved in sex determination but might be in the development of testicular structures in the medaka,Oryzias latipes[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,333 (3):729-736.

[12] Kurokawa H,Saito D,Nakamura S,et al.Germ cells are essential for sexual dimorphism in the medaka gonad[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2007,104(43):16958-16963.

[13] Nakamura S,Watakabe I,Nishimura T,et al.Analysis of medaka Sox9 orthologue reveals a conserved role in germ cell maintenance [J].PLoS One,2012,7(1):e29982.

[14] Ijiri S,Kaneko H,Kobayashi T,et al.Sexual dimorphic expressionof genes in gonads during early differentiation of a teleost fish,the Nile tilapia Oreochromis niloticus[J].Biology of Reproduction, 2008,78(2):333-341.

[15] 楊東.尼羅羅非魚性別決定機制和性別相關(guān)的分子標(biāo)記[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[16] 楊超.尼羅羅非魚Sox家族生物信息學(xué)分析及Sox9α/β在性腺發(fā)育中的可能作用[D].重慶:西南大學(xué),2013.

[17] Zarkower D.Establishing sexual dimorphism:conservation amidst diversity?[J].Nature Reviews Genetics,2001,2(3):175-185.

[18] 鄒芝英,楊弘,李大宇.羅非魚性別決定和分化機制的研究進展[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2009,16(1):139-145.

[19] 王光花.奧利亞羅非魚Dmrt1基因的克隆及其性別決定機制的研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[20] 鄧思平,陳松林.半滑舌鰨Dmrt1α基因的cDNA克隆及其表達[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2008,15(4):577-584.

[21] 王婷茹.尼羅羅非魚Dmrt1基因、Amh基因和Cyp11b2抗體制備及其在正常發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)性腺中的表達研究[D].重慶:西南大學(xué),2013.

[22] 李明輝.羅非魚基因敲除技術(shù)的建立及其在性別決定與分化研究中的應(yīng)用[D].重慶:西南大學(xué),2014.

[23] 文愛韻.性別相關(guān)基因在牙鲆性腺分化和性別表型形成中的遺傳學(xué)分析[D].青島:中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所), 2010.

[24] Winkler C,Hornung U,Kondo M,et al.Developmentally regulated and non-sex-specific expression of autosomal dmrt genes in embryos of the medaka fish(Oryzias latipes)[J].Mechanisms of Development,2004,121(7-8):997-1005.

[25] 李春歌.高溫誘導(dǎo)對羅非魚性別分化相關(guān)基因表達的影響研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[26] Deloffre L A M,Martins R S T,Mylonas C C,et al.Alternative transcripts of Dmrt1 in the European sea bass:expression during gonadal differentiation[J].Aquaculture,2009,293(1-2):89-99.

[27] 沈志剛.黃顙魚與藍鰓太陽魚性別控制及性別決定機制研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[28] Rodríguez-Marí A,Yan Yilin,BreMiller R A,et al.Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (Amh)relative to Sox9a,Sox9b,and Cyp19a1a,during gonad development[J].Gene Expression Patterns,2005,5(5):655-667.

[29] 劉珊珊.半滑舌鰨Amh基因的克隆及表達分析[D].上海:上海海洋大學(xué),2012.

[30] Schulz R W,Bogerd J,Male R,et al.Estrogen-induced alterations in Amh and Dmrt1 expression signal for disruption in male sexual development in the zebrafish[J].Environmental Science& Technology,2007,41(17):6305-6310.

[31] 洪萬樹,方永強.魚類芳香化酶活性研究的進展[J].水產(chǎn)學(xué)報,2000,24(3):285-288.

[32] Callard G V,Tchoudakova A V,Kishida M,et al.Differential tissue distribution,developmental programming,estrogen regulation and promoter characteristics of Cyp19 genes in teleost fish[J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2001, 79(1-5):305-314.

[33] Valle L D,Ramina A,Vianello S,et al.Cloning of two mRNA variants of brain aromatase cytochrome P450 in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss Walbaum)[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2002,82(1):19-32.

[34] Wang Hanping,Gao Zexia,Rapp D,et al.Effects of temperature and genotype on sex determination and sexual size dimorphism of bluegill sunfish Lepomis macrochirus[J].Aquaculture,2014, 420-421(S1):S64-S71.

[35] Kitano T,Takamune K,Kobayashi T,et al.Suppression of P450 aromatase gene expression in sex-reversed males produced by rearing genetically female larvae at a high water temperature during a period of sex differentiation in the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)[J].Journal of Molecular Endocrinology,1999,23(2):167-176.

[36] Yamaguchi T,Yamaguchi S,Hirai T,et al.Follicle-stimulating hormone signaling and Foxl2 are involved in transcriptional regulation of aromatase gene during gonadal sex differentiation in Japanese flounder,Paralichthys olivaceus[J].Biochemical and Biophysical Research Communication,2007,359(4):935-940.

[37] Navarro-Martín L,Vi?as J,Ribas L,et al.DNA methylation of the gonadal aromatase(Cyp19a)promoter is involved in temperaturedependent sex ratio shifts in the European sea bass[J].PLoS Genetics,2011,7(12):e1002447.

[38] 李夢茹.尼羅羅非魚兩種芳香化酶(Cyp19a1a和Cyp19a1b)表達與功能的初步研究[D].重慶:西南大學(xué),2014.

[39] D'Cotta H,Fostier A,Guiguen Y,et al.Aromatase plays a key role during normal and temperature-induced sex differentiation of tilapia Oreochromis niloticus[J].Molecular Reproduction and Development,2001,59(3):265-276.

[40] Van-Nes S,Andersen ?.Temperature effects on sex determination and ontogenetic gene expression of the aromatases Cyp19a and Cyp19b,and the estrogen receptors esr1 and esr2 in Atlantic halibut(Hippoglossus hippoglossus)[J].Molecular Reproduction and Development,2006,73(12):1481-1490.

[41] Piferrer F,Blázquez M,Navarro L,et al.Genetic,endocrine,and environmental components of sex determination and differentiation in the European sea bass(Dicentrarchus labrax L.)[J].General and Comparative Endocrinology,2005,142(1-2):102-110.

[42] Tong S K,Chung B C.Analysis of zebrafish Cyp19 promoters[J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2003, 86(3-5):381-386.

[43] Schmidt D,Ovitt C E,Anlag K,et al.The murine winged-helix transcription factor Foxl2 is required for granulosa cell differentiation and ovary maintenance[J].Development,2004,131(4): 933-942.

[44] 曹冬梅,盧建.叉頭框(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)與功能[J].生命科學(xué),2006,18(5):491-496.

[45] 江文波.稀有鮈鯽Foxl2和斑馬魚Zar1l基因克隆及其時空表達分析[D].武漢:華中師范大學(xué),2011.

[46] Wang Deshou,Kobayashi,Zhou Linyan,et al.Foxl2 up-regulates aromatase gene transcription in a female-specific manner by binding to the promoter as well as interacting with ad4 binding protein/steroidogenic factor 1[J].Molecular Endocrinology, 2007,21(3):712-725.

[47] Baron D,Cocquet J,Xia Xuhua,et al.An evolutionary and functional analysis of Foxl2 in rainbow trout gonad differentiation[J]. Journal of Molecular Endocrinology,2004,33(3):705-715.

[48] Jiang Wenbo,Yang Yuhui,Zhao Dongmei,et al.Effects of sexual steroids on the expression of Foxl2 in Gobiocypris rarus[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B,2011,160(4):187-193.

[49] 吳風(fēng)瑞.南方鲇Foxl2基因克隆、表達及其在性腺分化中作用的初步研究[D].重慶:西南大學(xué),2007.

[50] Nakamoto M,Matsuda M,Wang Deshou,et al.Molecular cloning and analysis of gonadal expression of Foxl2 in the medaka,Oryzias latipes[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,344(1):353-361.

[51] Baroiller J F,D'Cotta H.Environment and sex determination in farmed fish[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology&Pharmacology,2001,130(4):399-409.

[52] Desprez D,Mélard C.Effect of ambient water temperature on sex determinism in the blue tilapia Oreochromis aureus[J].Aquaculture,1998,162(1-2):79-84.

[53] Azaza M S,Dhra?ef M N,Kra?em M M.Effects of water temperature on growth and sex ratio of juvenile Nile tilapia Oreochromis niloticus(Linnaeus)reared in geothermal waters in southern Tunisia[J].Journal of Thermal Biology,2008,33(2):98-105.

[54] Yamamoto E.Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in hirame,Paralichthys olivaceus(Temminck et Schlegel)[J].Aquaculture,1999,173(1-4):235-246.

[55] Goto-Kazeto R,Abe Y,Masai K,et al.Temperature-dependent sex differentiation in goldfish:establishing the temperature-sensitive period and effect of constant and fluctuating water temperatures[J].Aquaculture,2006,254(1-4):617-624.

[56] Luckenbach J A,Godwin J,Daniels H V,et al.Gonadal differentiation and effects of temperature on sex determination in southern flounder(Paralichthys lethostigma)[J].Aquaculture,2003,216 (1-4):315-327.

[57] Conover D O,Fleisher M H.Temperature-sensitive period of sex determination in the Atlantic silverside,Menidia menidia[J].Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences,1986,43(3): 514-520.

[58] Pati?o R,Davis K B,Schoore J E,et al.Sex differentiation of channel catfish gonads:normal development and effects of temperature[J].Journal of Experimental Zoology,1996,276(3):209-218.

[59] 梅潔,桂建芳.魚類性別異形和性別決定的遺傳基礎(chǔ)及其生物技術(shù)操控[J].中國科學(xué):生命科學(xué),2014,44(12):1198-1212.

[60] Hou Jilun,Sun Zhaohui,Si Fei,et al.Cytological studies on induced meiogynogenesis in Japanese flounder Paralichthys olivaceus(Temminck et Schlegel)[J].Aquaculture Research,2009, 40(6):681-686.

[61] Thresher R,van de Kamp J,Campbell G,et al.Sex-ratio-biasing constructs for the control of invasive lower vertebrates[J].Nature Biotechnology,2014,32(5):424-427.

[62] 鄭堯,王在照,陳家長.調(diào)控魚類性腺分化基因的研究進展[J].水生生物學(xué)報,2015,39(4):798-810.

Effects of inheritance and temperature on sex determination and differentiation related genes and sex ratio in fish:a review

YAN Hao1,2,LIANG Li-qun1,CHANG Yu-mei1,SUN Bo1,SU Bao-feng1
(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Mechanisms of sex determination in fish are complex and changeable procedures,and usually depend on interactions between genetic and environmental factors.Great progress in identification and characterization of fish sex determination and differentiation related genes has been made with the development of molecular biotechnology. It has been shown that sex determination and differentiation are influenced by environmental factors including temperature,photoperiod,pH,hypoxia,and water pressure in most fishes.Types of sex determination and differentiation,genetic sex-determination(GSD)and temperature-dependent sex determination(TSD),are proposed.Sex determination and differentiation is largely affected by temperature.The current advances on molecular players are reviewed,including Sox9,Dmrt 1,Amh,Foxl2,and aromatase genes,which are involved in sex determination and differentiation in fish temperature-dependent sex determination and differentiation,including temperature-dependent sex determination and genetic sex-determination plus temperature effects are emphasized.The influence of temperature on sex ratio of fish is discussed to provide valuable insights for elucidation of mechanisms of sex determination and differentiation in fish and for design of better fish breeding and reproduction programs in farmed fish.

sex determination;genetic sex-determination(GSD);temperature-dependent sex determination (TSD);sex ratio;temperature effect

S917.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.019

2095-1388(2017)01-0111-08

2016-07-12

國家自然科學(xué)基金資助項目 (31461163004);中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項 (2016RC-YJ02);黑龍江省人力資源和社會保障廳 “省留學(xué)回國人員擇優(yōu)資助”項目 (黑人社函 【2015】424號)

閆浩 (1989—),男,碩士研究生。E-mail:yanhao_02@163.com

蘇寶鋒 (1982—),男,博士,助理研究員。E-mail:subaofeng@hrfri.ac.cn