1，25-二羥維生素D3對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)性T細胞的作用研究〔1〕

王建吳，羅靜，郭琿

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

1，25-二羥維生素D3對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)性T細胞的作用研究〔1〕

王建吳，羅靜，郭琿*

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

目的：探討1，25-二羥維生素D3[1，25(OH)2D3]對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的作用。方法：54 只健康雄性wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組(A組)、UUO組(B組)、1，25(OH)2D3治療組(C組)。每組于術(shù)后第1天、第3天、第7天分批處死6 只，留取腎臟組織。用HE染色觀察腎臟病理變化，采用免疫組織化學染色法測定腎臟人叉頭框蛋白P3(FOXP3)、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，UUO組FOXP3表達水平顯著降低，α-SMA表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與UUO組相比，1，25(OH)2D3治療組FOXP3表達水平顯著升高，α-SMA表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：調(diào)節(jié)性T細胞可能參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生及發(fā)展；1，25(OH)2D3作為免疫調(diào)節(jié)劑可通過上調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞減緩腎臟纖維化的進展。

1，25-二羥維生素D3；腎臟間質(zhì)纖維化；調(diào)節(jié)性T細胞

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟病(CKD)，包括原發(fā)性、繼發(fā)性腎小球疾病，腎小管間質(zhì)和血管疾病以及腎移植慢性排斥性病變發(fā)展至終末期腎臟病(ESRD)共同的最終結(jié)局，病理特點包括細胞外基質(zhì)增多、炎癥細胞在間質(zhì)沉積、腎小管擴張或萎縮、細胞凋亡等，其確切的發(fā)病機制尚未完全清楚，目前治療效果不理想。炎癥是慢性腎臟疾病的基本病理改變，也是腎纖維化的啟動因素，主要表現(xiàn)為免疫細胞浸潤和分泌炎性介質(zhì)。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是一種免疫細胞，胞質(zhì)內(nèi)特異性的表達人叉頭框蛋白P3(FOXP3)轉(zhuǎn)錄因子[1]，因此FOXP3在一定程度上可反映Treg細胞的水平和活性。多項研究證實，Treg細胞紊亂參與了肝臟及肺臟纖維化的進展[2-4]。Treg細胞是否參與腎臟間質(zhì)纖維化的發(fā)生及發(fā)展，國內(nèi)外研究較少。

1，25-二羥維生素D3是維生素D3的活性形式，通過與特異性維生素D受體(VDR)結(jié)合而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。維生素D受體主要存在于T細胞、B細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞中[6]，1，25-二羥維生素D3主要參與耐受性樹突狀細胞成熟、Treg細胞的分化及促進免疫抑制反應(yīng)的細胞因子的分泌進而抑制反應(yīng)性T細胞的免疫應(yīng)答[7]。1，25-二羥維生素D3是否通過上調(diào)Treg細胞減緩腎間質(zhì)纖維化的進展，國內(nèi)外研究較少。本研究主要探討單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型中Treg細胞的變化及1，25-二羥維生素D3對其的影響，從而闡述1，25-二羥維生素D3是否可通過上調(diào)Treg細胞減緩腎間質(zhì)纖維化的進展。

1 材料與方法

1.1 研究的主要試劑和儀器

叉頭蛋白P3抗體(北京博奧森公司)、抗α-SMA抗體(Abcam公司)、羊抗兔IgG抗體(北京博奧森公司)、辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(北京博奧森公司)、DAB顯色液(北京中杉金橋公司)、1，25(OH)2D3(羅蓋全，上海羅氏公司)、熒光顯微鏡(Nikon公司)。

1.2 研究對象及分組

健康清潔級wistar大鼠54 只，由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，體重為190～210 g，平均(200±10) g。將所有wistar大鼠隨機分成3 組，分別為假手術(shù)組(A組)、UUO組(B組)、1，25(OH)2D3治療組(C組)，每組各18 只，三組均于術(shù)后第1天、第3天、第7天分批處死6 只，留取手術(shù)側(cè)的腎組織。

1.3 實驗方法

1.3.1 UUO模型制備

將B組及C組健康雄性wistar大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，剪毛并消毒腹部皮膚，行左側(cè)恥骨上切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側(cè)輸尿管，沿左腎下極尋找到左輸尿管，于中上1/3處用4號線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管。A組大鼠輸尿管不予結(jié)扎，麻醉及其余手術(shù)步驟同UUO模型組。

1.3.2 給藥劑量

C組給予1，25(OH)2D33 ng/100 g，A組及B組給予花生油0.5 mL，均于每日上午灌胃，實驗期間各組正常飲食生活。

1.3.3 組織標本灌注及取材

用濃度為10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后，打開胸腔，將灌注用針經(jīng)心尖部進入左心室，然后剪開右心耳，迅速推入生理鹽水，心耳處流出無色澄清液體后停止灌注。剪開腹腔，取出手術(shù)側(cè)腎臟組織。

1.3.4 腎組織形態(tài)學觀察

常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察腎臟組織改變。

1.3.5 腎臟組織FOXP3蛋白、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的檢測

取腎組織標本，采用免疫組織化學方法檢測。4 μm厚石蠟切片脫蠟水化后，用體積分數(shù)3%過氧化氫溶液處理內(nèi)源性過氧化氫酶，微波修復(EDTA緩沖液)，3%BSA封閉液封閉40 min，分別滴加FOXP3抗體(稀釋300倍)、抗α-SMA抗體(稀釋200倍)，37 ℃孵化2 h。PBS緩沖液清洗3次，每次5 min，加入二抗(稀釋200倍)，37 ℃孵化30 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。以FOXP3蛋白在腎小管上皮細胞染成黃色或棕黃色為陽性。采用熒光顯微鏡(200倍)觀察采集圖像。每個切片隨機測定5個視野，應(yīng)用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測量每一視野中陽性染色區(qū)域的積分光密度值(IOD)與測量區(qū)域的面積(Area)，計算平均光密度，平均光密度=IOD/Area，對免疫組織化學染色進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 腎組織形態(tài)學表現(xiàn)

光鏡下觀察，HE染色A組未見明顯異常。B組術(shù)后第1天和第3天腎小管輕度擴張，上皮細胞空泡變性，腎間質(zhì)寬度增加，間質(zhì)中少量炎癥細胞浸潤；第7天腎小管擴張明顯，上皮細胞出現(xiàn)變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)可見大量炎性細胞浸潤，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見萎縮腎小管，纖維化較明顯，表明UUO模型造模成功。

2.2 各組大鼠腎組織α-SMA、FOXP3表達情況比較

與A組比較，B組腎組織α-SMA表達水平顯著升高，F(xiàn)OXP3表達水平顯著降低，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。B組隨著梗阻時間延長，F(xiàn)OXP3表達水平顯著降低，α-SMA表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與B組比較，C組腎組織α-SMA表達水平顯著降低，F(xiàn)OXP3表達水平顯著升高，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1、表2)。

表1 各組大鼠腎組織中α-SMA表達量

表2 各組大鼠腎組織中FOXP3表達量

3 討 論

慢性腎臟病是各種原因引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙，近年來慢性腎臟病的患病率有明顯上升趨勢，每年達7%以上[8]。腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進展為終末期腎衰竭的最終共同通路，且腎間質(zhì)纖維化程度與腎功能減退關(guān)系較密切。單側(cè)輸尿管梗阻模型是以進行性腎小管間質(zhì)纖維化為特征的實驗性腎臟病模型，是公認的腎小管間質(zhì)纖維化模型。在多種細胞因子作用下，腎間質(zhì)成纖維細胞大量增殖并活化為肌成纖維細胞，表達平滑肌肌動蛋白和細胞外基質(zhì)(如FN、各型膠原)，導致腎間質(zhì)纖維化。α-SMA是肌成纖維細胞標志性蛋白[9]。尚無有效方法抑制腎間質(zhì)纖維化的進展。

研究表明，Treg細胞具有介導自身免疫耐受與維持免疫平衡，對自身反應(yīng)T淋巴細胞活化和增值起負調(diào)控作用。Treg細胞的功能失調(diào)與自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)、急性及慢性傳染性疾病、腫瘤免疫耐受、移植排斥以及過敏性疾病密切相關(guān)[10-11]。Claassen等[2]研究揭示，在丙型肝炎病毒造成的肝纖維化中，Treg細胞的數(shù)量越多，肝纖維化的程度越輕，提示Treg細胞可抑制肝纖維化的發(fā)展。Kotsianidis等[3-4]研究表明，通過上調(diào)大鼠Treg細胞，可抑制肺纖維化的進展。我們的研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，UUO組腎組織FOXP3表達減少，α-SMA表達增加；隨著梗阻時間延長，UUO組內(nèi)腎組織FOXP3表達減少，α-SMA表達增加，提示腎間質(zhì)纖維化中存在Treg細胞的紊亂，其減少可能加重腎間質(zhì)纖維化的進展。

1，25-二羥維生素D3是維生素D3的活性形式，通過與單核細胞，活化的T、B細胞上的維生素D受體特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。Jeffery等[12]研究證實，1，25-二羥維生素D3可誘導Foxp3高表達。Taal和Brenner[13]證實慢性腎臟病中1，25-二羥維生素D3水平下降，誘導RAS系統(tǒng)激活，進而加重腎臟纖維化。本研究結(jié)果顯示：與UUO組相比，1，25-二羥維生素D3治療組腎組織FOXP3表達增加，α-SMA表達減少，提示1，25-二羥維生素D3可通過上調(diào)Treg細胞減緩腎間質(zhì)纖維化的進展，可能機制：誘導樹突狀細胞吲哚胺2，3二氧酶(IDO)的表達來上調(diào)Treg細胞的數(shù)量增加[14]；誘導Treg細胞表達CTLA-4、IL-10、TGF-β、Foxp3及CTLA-4[15]；促進樹突狀細胞表達趨化因子CCL17和CCL20而抑制歸巢因子CCL22的表達，使Treg細胞招募至病變部位[16]。

綜上所述，在UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化中存在Treg細胞的紊亂，且Treg細胞可能參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生及發(fā)展，1，25-二羥維生素D3可能通過上調(diào)Treg細胞減緩腎間質(zhì)纖維化的進展，但對于1，25-二羥維生素D3通過何種途徑發(fā)揮上述作用，還有待進一步研究。

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Effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3on Treg cells in UUO rats with renal interstitial fibrosis

WANG Jianwu，LUO Jing，GUO Hui

(The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective：To explore the effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3on regulatory T cells in unilateral ureteral obstruction(UUO) rats with renal interstitial fibrosis.Methods：Fifty-four Wistar rats were assigned to healthy control group(A group)，UUO group(B group)，and 1，25-dihydroxyvitamin D3treatment group(C group).After surgery for 1 day，3 days and 7 days，6 rats were selected from every group randomly，and killed to get the renal.Renal pathological changes were observed by HE staining.The level of Forkhead Box ProteinP3(Foxp3) protein and alpha smooth muscle-actin (a-SMA) were assayed by immunohistochemistry.Results：Compared with healthy control group，the level of Foxp3 protein was significantly lower，and the expression of a-SMA protein was significantly higher in UUO group (P<0.05).Compared with UUO group，the level of Foxp3 protein was significantly higher，and the expression of a-SMA protein was significantly lower in 1，25-dihydroxyvitamin D3treatment group group (P<0.05).Conclusion：Treg cells may involve in the progress of the renal interstitial fibrosis.As an immunomodulator，1，25-dihydroxyvitamin D3might inhibit the progress of renal interstitial fibrosis through increasing the level of Treg cells.

1，25-dihydroxyvitamin D3；renal interstitial fibrosis；regulatory T cells

1671-8631(2017)03-0213-04

〔1〕本課題為山西省留學人員管理委員會辦公室科研資助項目(課題編號：2013-117)；山西省國際科技合作項目(課題編號：2013081056)

*本文通訊作者：郭琿

R692.2

A

2016-12-17

(本文編輯：張榮梅)

王建吳(1991— )，男，山東省臨清市人，在讀碩士。研究方向：腎臟病學。