氫化可的松致腎虛證小鼠模型的建立及相關指標的評價

戴冰，張嘉妮，楊夢琳，李玉星，肖子曾*，楊磊，韋強

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007； 2. 湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208)

氫化可的松致腎虛證小鼠模型的建立及相關指標的評價

戴冰1，張嘉妮2，楊夢琳2，李玉星2，肖子曾2*，楊磊1，韋強1

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007； 2. 湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208)

目的 建立氫化可的松致腎陽虛、腎陰虛小鼠模型，并探討其相關評價指標。方法 采用氫化可的松灌胃建立腎陽虛及腎陰虛小鼠模型；觀察腎陽虛、腎陰虛模型小鼠生存狀態(tài)，測定各組模型小鼠體重變化；采用放射免疫法檢測HPA軸中促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質醇(Cor.)、HPT軸中甲狀腺激素 (TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、HPG軸中促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)含量。結果 腎陽虛、腎陰虛模型小鼠體重均下降，腎陽虛模型小鼠血清ACTH、Cor.、TSH、T3、T4水平降低，血清FSH、E2、T水平升高，且差異均有顯著性(P<0.01)；而腎陰虛模型則反之。結論 腎虛小鼠內分泌系統(tǒng)中ACTH、Cor.、TSH、T3、T4、FSH、E2、T各激素水平均發(fā)生了改變，其中Cor.可作為評價糖皮質激素法建立腎虛模型的重要指標。

腎陽虛；腎陰虛；評價指標

腎虛模型是具有代表性的中醫(yī)動物模型， 是中醫(yī)根本臟器的虛損、 證候模型。隨著現(xiàn)代醫(yī)學對于中醫(yī)腎虛理論的不斷深入研究，目前已積累了大量腎虛動物模型的建立方法[1]，其常用的糖皮質激素類藥物有氫化可的松、醋酸可的松、醋酸氫化可的松、地塞米松磷酸鈉、地塞米松等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用氫化可的松連續(xù)灌胃4 d，可使小鼠血漿cAMP含量升高，能成功復制出良好的腎陰虛小鼠模型[2]。雖然現(xiàn)已對腎虛模型有較深入的研究，但由于臨床上對腎虛病癥尚無標準可控的生化診斷指標，使模型在模擬腎虛證候的研究中僅能反映某一方面的病理變化特征，并不能完全體現(xiàn)臨床上疾病發(fā)生的復雜性和中醫(yī)單一病因的復雜性[3]，因此建立規(guī)范、 標準、可重復的理想腎虛動物模型具有一定的困難；目前用于評價腎虛模型的指標還尚無統(tǒng)一的標準，其大多僅以造模動物的一般體征變化作為觀察指標，或少有以生化指標如動物體內cAMP、cGMP含量對腎虛模型進行評價，使實驗結果發(fā)生偏差，缺乏一定的科學性，故腎虛模型的建立方法及評價相關指標的選擇仍值得探討研究。

中醫(yī)認為腎為先天之本，藏精氣，主骨、生髓、化血，主持人體生長發(fā)育、生殖和調節(jié)機體代謝，為正氣之根?，F(xiàn)代研究進展表明，腎虛者往往表現(xiàn)為NIM中的內分泌系統(tǒng)功能障礙即下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能失調，性腺軸(HPG)和甲狀腺軸(HPT)功能紊亂[4-6]。因此，本研究根據(jù)《中藥藥理研究方法學》[7]中腎陽虛、腎陰虛模型的造模方法，結合前期研究基礎，采用氫化可的松灌胃建立腎陽虛、腎陰虛小鼠模型，通過觀察各組小鼠精神狀態(tài)等情況，測定體重，并采用放免法測定各靶腺軸中激素的含量對腎虛(腎陽虛、腎陰虛)證小鼠模型進行評價，為腎陽虛、腎陰虛的模型評判標準提供實驗依據(jù)，使該模型的建立及評價方法更加完善、嚴謹，也為提高臨床治療腎虛證的可靠性和適用性提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

清潔級健康KM小鼠90只，雌雄各半，體重(20±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK(湘)2011-0003】；飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心【SYXK(湘)2013-0005】。采用完全隨機法將小鼠分為3組，即空白對照組、腎陰虛模型組、腎陽虛模型組，每組30只。

1.1.2 試劑及藥物

氫化可的松注射液(10 mg/2 mL)，安陽九州藥業(yè)有限責任公司，批號：140820001A。促腎上腺皮質激素、皮質醇、促甲狀腺激素、三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素、促卵泡激素、雌二醇、睪酮放射免疫分析試劑盒，以上試劑盒均由北京北方生物技術研究所提供(批號：150820)。

1.1.3 儀器

小型冷凍離心機(centrifuge 5415R型，德國 Eppendorf公司)；Haier冰箱(bcd-268tn型，青島海爾股份有限公司)；電子天平(Y3002型，上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立方法

(1)空白對照組：每天按0.02 mL/g灌胃蒸餾水，自由飲水、飲食，連續(xù)10 d。

(2)腎陽虛模型組：每天按25 mg/kg給予灌胃氫化可的松，自由飲水、飲食，連續(xù)10 d。

(3)腎陰虛模型組：每天按0.02 mL/g灌胃蒸餾水，連續(xù)6 d，第7～10 天，按50 mg/kg給予灌胃氫化可的松，自由飲水、飲食，連續(xù)4 d。

1.2.2 標本采集及指標檢測

(1)觀察指標

從實驗開始，每日觀察小鼠活動力、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、進食、排便及有無死亡情況等。

(2)測量指標

于造模前、造模后(取材前)分別對各組小鼠進行稱重，并記錄。

(3)生化指標

末次給藥后禁食24 h，于試驗第11天摘眼球取血，3500 r/min離心15 min，分離血清，采用放射免疫分析法測定血清中促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質醇(Cor.)、促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)的含量。

1.2.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 對腎陽虛、腎陰虛模型小鼠生存狀態(tài)的影響

空白對照組小鼠活動自如、反應靈敏、毛發(fā)潤澤、大便黃褐色，不干不?。荒I陽虛模型組小鼠出現(xiàn)精神倦怠、活動減少、反應遲鈍、肢尾冷、蜷曲拱背、皮毛無光澤、不欲飲食、大便稀溏等癥狀；腎陰虛模型組小鼠出現(xiàn)煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁易脫落、大便干結、飲食增多等癥狀。

2.2 對腎陽虛、腎陰虛模型小鼠體重的影響

與空白對照組比較，腎陽虛模型組、腎陰虛該模型組小鼠體重差異均有顯著性(P<0.01)。提示腎陽虛模型小鼠及腎陰虛模型小鼠體重均降低。結果見圖1。

2.3 對腎陽虛、腎陰虛模型小鼠HPA軸中ACTH、Cor.含量的影響

與空白對照組比較，腎陽虛模型、腎陰虛模型組小鼠血清ACTH、Cor.含量均有顯著性差異(P<0.01)；提示腎陽虛模型小鼠血清ACTH、Cor.含量均降低，而腎陰虛模型小鼠則反之，結果見表1。

2.4 對腎陽虛、腎陰虛模型小鼠HPT軸中TSH、T3、T4含量的影響

與空白對照組比較，腎陽虛模型、腎陰虛模型組

小鼠血清TSH、T3、T4含量均有顯著性差異(P<0.01)；提示腎陽虛模型小鼠血清TSH、T3、T4含量均降低，而腎陰虛模型小鼠則反之，結果見表2。

圖1 對糖皮質激素腎陽虛模型小鼠及腎陰虛模型小鼠體重的影響±s)Fig.1 Effect of body weight of kidney-yang and kidney-yin deficiency mice induced by oral administration of hydrocortisone

表1 對小鼠血清ACTH、Cor.及TSH、T3、T4含量的影響

注：與空白組比，**P<0.01(表2同)。

Note.**P<0.01, compared with the blank group. (The same as the Tab. 2)

2.5 對腎陽虛、腎陰虛模型小鼠HPG軸中FSH、E2、T含量的影響

與空白對照組比較，腎陽虛模型、腎陰虛模型組小鼠血清FSH含量差異均有顯著性(P<0.01)；雌鼠血清E2含量差異有顯著性(P<0.01)，但雄鼠差異無顯著性；雄鼠血清T含量差異有顯著性(P<0.01)，但雌鼠差異無顯著性。提示腎陽虛模型、腎陰虛模型組小鼠均存在HPG軸功能紊亂，且不同性別的小鼠性激素也具有不同的表現(xiàn)，腎陽虛模型小鼠血清FSH含量升高，雌鼠血清E2含量及雄鼠血清T含量升高，而腎陰虛模型小鼠血清FSH含量降低，雌鼠血清E2含量及雄鼠血清T含量降低，結果見表2。

表2 對小鼠血清FSH、E2、T含量的影響

3 討論

腎虛是常見的中醫(yī)臨床體質之一，是以腎中精氣虛損，機體表現(xiàn)以腎的臟腑的功能低下為主要特征的一種生理狀態(tài)。目前主要通過藥物致內分泌、免疫等多系統(tǒng)功能紊亂的方法建立腎虛證動物模型，其中多采用糖皮質激素類藥物(氫化可的松)來造模，而氫化可的松所使用的給藥劑量、持續(xù)天數(shù)不同，可分別復制出腎陽虛和腎陰虛模型。大劑量外源性皮質激素早期能使機體呈煩躁多動等腎陰虛表現(xiàn)[8]，但由于腎上腺皮質激素可使促腎上腺皮質激素釋放受抑制，而使類固醇激素分泌減少，所以出現(xiàn)一系列“耗竭”現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)“陰損及陽”的轉變，特別是突然停用，腎上腺軸的抑制狀態(tài)立即暴露，出現(xiàn)一系列腎陽虛的表現(xiàn)[9]。

目前報道的腎虛模型多采用肌肉或皮下注射氫化可的松造模，而筆者前期實驗中發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)肌肉或皮下注射后死亡率過高，故本實驗改用灌胃給藥造模，該方法操作簡便，成功率高。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，采用不同劑量的氫化可的松灌胃不同時間造模后，腎陽虛模型小鼠出現(xiàn)體重下降，活動遲緩、反應遲鈍、肢尾冷，卷曲拱背，皮毛無光澤、不欲飲食等癥狀；腎陰虛模型小鼠出現(xiàn)體重下降，煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁易脫落、大便干結、飲食增多等癥狀，這與過去報道的腎陽虛、腎陰虛模型的癥狀體征基本一致[10]。

也有許多學者發(fā)現(xiàn)腎虛者內分泌系統(tǒng)各激素水平發(fā)生了一定程度的紊亂，并通過觀察HPA軸中的ACTH、Cor.含量，HPG軸中的FSH、E2、T含量或HPT軸中TSH、T3、T4的含量的變化來判斷腎陽虛和腎陰虛[11-13]。本實驗研究結果發(fā)現(xiàn)，腎陽虛模型小鼠血清ACTH、Cor.、TSH、T3、T4水平降低，血清FSH、E2、T水平升高，而腎陰虛模型則反之，這進一步證明腎虛小鼠內分泌系統(tǒng)中各激素水平均發(fā)生紊亂。而糖皮質激素(皮質醇、皮質酮)是由腎上腺皮質產生和分泌的激素，在體內主要發(fā)揮調節(jié)糖代謝的作用。皮質醇(Cor.)的分泌依賴于HPA軸的分泌規(guī)律，受垂體前葉促腎上腺皮質激素的控制，Cor.的合成量不足或分泌過多均會導致體內糖代謝紊亂，故血清中Cor.的水平高低是反映腎上腺皮質功能的重要指標[14-15]。腎陽虛者大多表現(xiàn)為腎上腺皮質功能抑制，腎陰虛者反之，因此Cor.可用于評價腎虛模型的成功與否，尤其是對于采用糖皮質激素法建立的腎虛模型，這為中醫(yī)腎陽虛、腎陰虛模型的成功建立及相關評價指標的標準化提供一定的實驗依據(jù)。

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Establishment of a mouse model of kidney deficiency induced by oral administration of hydrocortisone and evaluation of related factors

DAI Bing1, ZHANG Jia-ni2, YANG Meng-lin2, LI Yu-xing2, XIAO Zi-zeng2*, YANG Lei1, WEI Qiang1

(1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China；2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208)

Objective To establish a mouse model of kidney-yin and kidney-yang deficiency after oral administration of hydrocortisone, and to explore the related evaluation factors.Methods The model was established by oral administration of hydrocortisone to induce kidney-yin and kidney-yang deficiency in mice. The survival and body weight of the mice were observed. The serum content of adrenal cortical hormone (ACTH), cortisol (Cor.) in the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, and thyroid stimulating hormone (TSH), triiodothyronine (T3), thyrox (T4) in the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis, follicle-stimulating hormone (FSH), estradiol (E2), testosterone (T) in the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis were determined by radioimmunoassay.Results The body weight of kidney-yin and kidney-yang mice were decreased, the serum ACTH, Cor, TSH, T3, T4 contents were decreased, the serum FSH, E2, T contents were increased in the kidney-yang deficiency model mce (P<0.01), and those parameters in the kidney-yin deficiency model mice were changed in opposite direction. Conclusions It is found that the hormone levels of ACTH, Cor, TSH, T3, T4, FSH, E2 and T in kidney deficiency mice are changed, and cortisol can be used as an important index to evaluate the model of kidney deficiency induced by glucocorticoid.

Kidney-yang deficiency; Kidney-yin deficiency; Evaluating factors; Mouse models

XIAO Zi-zeng， E-mail: 1092341361@qq.com

湖南省教育廳重點項目(編號：15A140);湖南中醫(yī)藥大學研究生科研創(chuàng)新課題(編號：2016CX16)。

戴冰(1965-)，女，主任藥師，教授，博士研究生導師，研究方向：中藥炮制、藥理學及藥效物質基礎研究。E-mail: db0223@163.com

肖子曾(1959-)，男，教授，碩士研究生導師，研究方向：方劑的應用及療效機理研究。E-mail: 1092341361@qq.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0070-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.013

2016-06-13