溫度對(duì)復(fù)合肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及其表面疏水性的影響

李清正　張順亮　羅永康　馮力更

摘 要：溫度是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能變化的主要因素。實(shí)驗(yàn)研究豬肉肌原纖維蛋白、鰱魚肉肌原纖維蛋白、復(fù)合肌原纖維蛋白（豬肉、鰱魚肉肌原纖維蛋白質(zhì)量比1∶1），在不同溫度下二級(jí)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、濁度、表面疏水性的變化，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和表面疏水性變化規(guī)律的差別與相關(guān)性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，豬肉、鰱魚肉和復(fù)合肌原纖維蛋白的濁度都會(huì)升高；α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量降低至穩(wěn)定，β-折疊含量升高至穩(wěn)定；蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化趨向穩(wěn)定以適應(yīng)新環(huán)境；表面疏水性升高后在高溫下輕微下降至穩(wěn)定，蛋白質(zhì)逐漸趨向完全變性。復(fù)合肌原纖維蛋白的熱變性規(guī)律與單一蛋白不完全相同，能夠結(jié)合豬肉、鰱魚肉肌原纖維蛋白的優(yōu)點(diǎn)，改善肌原纖維蛋白隨溫度變化的性質(zhì)。

關(guān)鍵詞：肌原纖維蛋白；豬肉；鰱魚；復(fù)合；溫度；結(jié)構(gòu)；表面疏水性

肌原纖維蛋白是肌肉中主要的蛋白質(zhì)之一，又稱鹽溶蛋白，由肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、肌鈣蛋白等組成，占肌肉總蛋白含量的50%～55%。肌原纖維蛋白具有良好的凝膠能力[1]，其凝膠性能的變化影響著肉制品的品質(zhì)，因此肌原纖維蛋白在肉制品，尤其是糜類肉制品加工中發(fā)揮著重要作用。

溫度是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的主要因素。隨著溫度升高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸變化，蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性、分解或聚集，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的水合特性、凝膠特性、分子間相互作用等功能特性發(fā)生改變。此外，不同加熱方式對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響也有差別[2-5]。蛋白質(zhì)的熱變性對(duì)肌肉品質(zhì)有很大影響，能夠改變肌肉的持水性能、色澤、質(zhì)構(gòu)等?？妆ＨA等[6]研究發(fā)現(xiàn)，豬肉肌原纖維蛋白在70～80 ℃之間保水性最好；Lin等[7]指出，新鮮草魚經(jīng)熱處理后，硬度、彈性和咀嚼性等都會(huì)優(yōu)于生鮮草魚；趙冰等[8]發(fā)現(xiàn)，100 ℃的中溫殺菌溫度能夠很好地保持乳化香腸的質(zhì)構(gòu)特性；姜啟興[9]指出，鳙魚肌原纖維蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)隨著溫度升高逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，硬度、咀嚼性呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。

近年來(lái)，有關(guān)復(fù)合蛋白凝膠、復(fù)合魚糜的研究逐漸增多。劉蕾等[10]研究發(fā)現(xiàn)，凝膠化溫度為30 ℃，鰱魚和帶魚魚糜比例為7∶3時(shí)，復(fù)合魚糜凝膠強(qiáng)度高于鰱魚魚糜和帶魚魚糜；劉蕾等[11]還發(fā)現(xiàn)小黃魚和鰱魚肌原纖維蛋白

1∶1復(fù)合后的變化規(guī)律與小黃魚相似，而不同于鰱魚；王衛(wèi)芳[12]則推測(cè)魚肉和豬肉肌原纖維蛋白復(fù)合后經(jīng)加熱可形成一種復(fù)合凝膠，蛋白質(zhì)之間發(fā)生了相互作用。但關(guān)于溫度對(duì)復(fù)合肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和表面疏水性影響及其關(guān)系的研究卻很少，因此有必要對(duì)此開展相應(yīng)研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究溫度對(duì)復(fù)合肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和表面疏水性的影響，對(duì)比分析了復(fù)合肌原纖維蛋白和單一肌原纖維蛋白在熱加工中結(jié)構(gòu)、表面疏水性的變化規(guī)律。這將為復(fù)合肉制品和中溫肉制品的開發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)也為肉制品品質(zhì)控制和加工工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（后腿精瘦肉）購(gòu)自北京美廉美超市學(xué)院路店；鰱魚購(gòu)自北京健翔橋農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

所有試劑均為分析純 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW 2000分散均質(zhì)機(jī) 上海弗魯克公司；GL-21M超速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表公司；FE20酸

度計(jì) 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；WZ-100SP水浴鍋 上海申生科技有限公司；UV-2600分光光度計(jì)

上海優(yōu)尼科儀器公司；F97PRO熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；Pistar π-180遠(yuǎn)紫外圓二色譜儀 英國(guó)

Applied Photophysics公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理

豬肉剔去脂肪和結(jié)締組織，切碎后備用。鰱魚擊暈后立即去鱗和內(nèi)臟，流動(dòng)水沖洗干凈，瀝干后取背部白肉備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考姜啟興[9]的方法，略作改動(dòng)。取5 g肉，加入20 mL pH7.0的50 mmol/L磷酸緩沖液（含0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、2 mmol/L MgCl2），均質(zhì)后于4℃、8 000 r/min離心15 min，傾去上清液，沉淀重復(fù)上述步驟1次。所得沉淀加入20 mL冷的0.1 mol/L NaCl溶液，4℃、8 000 r/min離心15 min，傾去上清液，沉淀重復(fù)洗滌1次。最后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.3 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

參照楊建雄[13]的方法，采用雙縮脲法測(cè)定。

1.3.4 肌原纖維蛋白加熱處理

將所得肌原纖維蛋白沉淀用0.6 mol/L KCl溶液調(diào)至所需質(zhì)量濃度，分別置于30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴中加熱10 min，結(jié)束后立即放入冰水浴中降溫備用。對(duì)照組不經(jīng)加熱處理（20 ℃）。

1.3.5 濁度的測(cè)定

調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，加熱后于350 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以0.6 mol/L KCl做空白。

1.3.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考Zhang等[14]的方法略作修改，采用圓二色譜法測(cè)定。將肌原纖維蛋白用0.4 mol/L NaCl溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，以0.4 mol/L NaCl溶液作為空白掃描，掃描范圍190～260 nm，比色皿長(zhǎng)度0.1 cm。二級(jí)結(jié)構(gòu)含量使用Dichroweb分析，在線網(wǎng)址http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk[15]。

1.3.7 蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的測(cè)定

采用熒光光度法。將肌原纖維蛋白用0.6 mol/L KCl溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL，激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，波長(zhǎng)掃描范圍310～400 nm，掃描速率3 000 nm/min。

1.3.8 表面疏水性的測(cè)定

以1-苯奈氨-8-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作為熒光探針，用pH 7.0的0.6 mol/L NaCl-10 mmol/L磷酸鹽緩沖液將肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度分別調(diào)至0.2、0.3、0.5、1.0 mg/mL。4種質(zhì)量濃度的蛋白溶液各取2 mL，加入10 μL pH 7.0含8 mmol/L ANS的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，混勻后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定，條件為：激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為390 nm和470（468） nm，λEX和λEM縫寬均為5 nm。用熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度的斜率表示蛋白質(zhì)表面疏水性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007，作圖采用Origin 8.5，顯著性分析采用SPSS 21。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)復(fù)合肌原纖維蛋白濁度的影響

由圖1可知，隨著溫度升高，豬肉、魚肉、復(fù)合肌原纖維蛋白濁度都顯著增加（P<0.05），蛋白質(zhì)逐漸交聯(lián)、聚集、沉淀，變性程度加劇。復(fù)合蛋白濁度變化與魚肉無(wú)明顯差異（P>0.05），與豬肉顯著不同（P<0.05）。

根據(jù)劉茹[16]的報(bào)道，鰱魚肉肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的變性峰分別為44.7 ℃和71.7 ℃，豬肉蛋白質(zhì)的變性峰分別是59.7 ℃和76.8 ℃，濁度變化率變化點(diǎn)基本出現(xiàn)在蛋白變性溫度附近，在50℃之后，3 種蛋白濁度的變化程度逐漸減小，60～70 ℃后濁度基本趨同，肌原纖維蛋白趨向完全變性。

2.2 溫度對(duì)復(fù)合肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

天然蛋白質(zhì)中不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)在圓二色譜中會(huì)表現(xiàn)出不同的特征吸收[17]：α-螺旋在190 nm波長(zhǎng)處有1 個(gè)正峰，在204 nm和221 nm波長(zhǎng)處有2 個(gè)負(fù)峰；β-折疊在195 nm有正峰，在215～217 nm出現(xiàn)負(fù)峰；β-轉(zhuǎn)角在180～190 nm會(huì)出現(xiàn)負(fù)峰；無(wú)規(guī)則卷曲在小于200 nm波長(zhǎng)處會(huì)出現(xiàn)單負(fù)峰，在218 nm附近則有較弱譜帶。

由圖2可知，3 種肌原纖維蛋白在204 nm和221 nm附近均有2 個(gè)負(fù)峰，對(duì)照組2 個(gè)負(fù)峰非常明顯，說(shuō)明未加熱的肌原纖維蛋白中含有較多的α-螺旋結(jié)構(gòu)。隨著溫度升高，2 個(gè)負(fù)峰逐漸變?nèi)酰绕湓跍囟壬叩?0～40 ℃時(shí)，負(fù)峰明顯減弱，表明α-螺旋含量明顯下降。3 種肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化如表1所示。

由表1可知，豬肉肌原纖維蛋白的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量隨溫度升高而下降，β-折疊含量則上升，在40 ℃后基本穩(wěn)定；隨溫度升高，魚肉肌原纖維蛋白的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量下降，β-折疊含量上升，但在30 ℃后即達(dá)到穩(wěn)定。這說(shuō)明豬肉肌原纖維蛋白比魚肉肌原纖維蛋白擁有更高的熱穩(wěn)定性。劉茹[16]的研究也證實(shí)了豬肉蛋白具有更高的變性溫度，因而具有更好的熱穩(wěn)定性；Wu等[18]和Arai等[19]也曾報(bào)道魚肉蛋白的熱穩(wěn)定性低于哺乳動(dòng)物蛋白。

復(fù)合肌原纖維蛋白初始時(shí)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量與魚肉肌原纖維蛋白相近。隨著溫度升高，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量下降，β-折疊含量上升，在40 ℃后達(dá)到穩(wěn)定，這與豬肉肌原纖維蛋白的變化趨勢(shì)無(wú)明顯差別（P>0.05），表明復(fù)合肌原纖維蛋白能夠結(jié)合豬肉和魚肉肌原纖維蛋白的特點(diǎn)，熱穩(wěn)定性有所改善。同時(shí)，復(fù)合肌原纖維蛋白穩(wěn)定后的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量要高于單一肌原纖維蛋白，β-折疊含量則較低，這表明豬肉和魚肉肌原纖維蛋白之間可能發(fā)生了相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量產(chǎn)生了影響，因而與單一蛋白性質(zhì)產(chǎn)生差異。Bouraoui等[20]曾報(bào)道魚肉和豬肉蛋白能夠發(fā)生相互作用形成更多的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也將對(duì)蛋白質(zhì)功能特性產(chǎn)生影響，尤其是β-折疊含量的變化，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性產(chǎn)生很大影響[21]。

2.3 溫度對(duì)復(fù)合肌原纖維蛋白構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)中含有的芳香族氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)具有吸收紫外入射光而發(fā)射熒光的特性，可利用此特點(diǎn)來(lái)研究變性過(guò)程中蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象變化。色氨酸摩爾消光系數(shù)高，對(duì)周圍微環(huán)境敏感[22]，是最常用的內(nèi)源熒光探針。隨著蛋白質(zhì)的變性，色氨酸側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露在水溶液中，其所處環(huán)境的極性變大，蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰λmax增大，發(fā)生紅移[23]。紅移程度越大，變性過(guò)程中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化程度越大。此外，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著色氨酸從內(nèi)部疏水區(qū)向外暴露而增大，能夠表征蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化程度[24]。3 種肌原纖維蛋白在不同溫度下的構(gòu)象變化如圖3所示。

由圖3a可知，豬肉肌原纖維蛋白λmax從332 nm紅移至335 nm，熒光強(qiáng)度先增大后減小至穩(wěn)定，在40 ℃達(dá)到最大，70 ℃后基本穩(wěn)定。這表明隨著溫度的升高，豬肉肌原纖維蛋白內(nèi)部色氨酸側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白變性程度增加，但在達(dá)到一定溫度后，蛋白質(zhì)會(huì)趨向完全變性，構(gòu)象逐漸趨向較為穩(wěn)定的變性狀態(tài)以適應(yīng)環(huán)境變化[25]。由圖3b可知，魚肉肌原纖維蛋白隨著加熱溫度升高，λmax從333 nm紅移至335 nm，熒光強(qiáng)度先降低后升高，在50 ℃降至最低，100 ℃升至最大，這可能是因?yàn)轸~肉蛋白色氨酸側(cè)鏈基團(tuán)在加熱過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)短暫的收縮，達(dá)到一定溫度后逐漸舒展暴露，直至構(gòu)象穩(wěn)定。由圖3c可知，隨著溫度升高，復(fù)合肌原纖維蛋白λmax由332 nm紅移至336 nm，熒光強(qiáng)度出現(xiàn)2 次上升和下降，在30 ℃和70 ℃達(dá)到最高，最后達(dá)到穩(wěn)定。這表明復(fù)合肌原纖維蛋白構(gòu)象隨溫度變化的規(guī)律與豬肉和魚肉蛋白都不同，蛋白質(zhì)之間可能發(fā)生了相互作用，從而在一定程度上改變了色氨酸對(duì)環(huán)境的敏感程度，影響了蛋白構(gòu)象的變化。這種蛋白構(gòu)象變化規(guī)律的改變，可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)熱變性過(guò)程產(chǎn)生影響，進(jìn)而在一定程度上改變蛋白質(zhì)的凝膠特性，改善復(fù)合肉制品的品質(zhì)。

2.4 溫度對(duì)復(fù)合肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

由圖4可知，3 種蛋白的表面疏水性均隨溫度上升而升高，在70～80 ℃后出現(xiàn)下降并趨于平緩，但具體變化過(guò)程卻不同。豬肉肌原纖維蛋白表面疏水性從40 ℃開始急劇上升，80 ℃后下降并逐漸穩(wěn)定；魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性全程變化較平緩，在70 ℃后下降至穩(wěn)定；復(fù)合肌原纖維蛋白表面疏水性在40 ℃開始迅速上升，與豬肉蛋白相似，至70 ℃下降并趨于穩(wěn)定，與魚肉蛋白相似，且最終與魚肉蛋白持平。隨著溫度升高，維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力逐漸減弱，氫鍵、范德華力、二硫鍵等遭到破壞，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)部疏水殘基暴露，進(jìn)而引發(fā)蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)域分布的改變[26-27]。本實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)表面疏水性與α-螺旋和β-折疊含量呈負(fù)相關(guān)，與無(wú)規(guī)則卷曲含量呈正相關(guān)，相關(guān)研究也證實(shí)蛋白質(zhì)的表面疏水性與α-螺旋含量呈負(fù)相關(guān)[28]，與β-折疊含量也有密切關(guān)系[21]。但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)又會(huì)發(fā)生聚集和側(cè)鏈間的反應(yīng)，出現(xiàn)沉淀，導(dǎo)致表面疏水性出現(xiàn)下降[29-31]。因此3 種肌原纖維蛋白的表面疏水性都是隨溫度先升高，達(dá)到較高溫度后出現(xiàn)降低。相關(guān)研究也曾報(bào)道不同來(lái)源的蛋白因結(jié)構(gòu)存在差異而導(dǎo)致表面疏水性不同[32]，因而復(fù)合肌原纖維蛋白能夠結(jié)合豬肉和魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的變化特點(diǎn)，但復(fù)合肌原纖維蛋白表面疏水性的變化規(guī)律與單一豬肉和魚肉蛋白又不完全相同，豬肉和魚肉肌原纖維蛋白復(fù)合后蛋白質(zhì)之間可能發(fā)生了相互作用，改變了原有疏水區(qū)域的分布，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。

3 結(jié) 論

隨著溫度的升高，豬肉、鰱魚肉和復(fù)合肌原纖維蛋白的濁度都會(huì)升高，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量降低至穩(wěn)定，β-折疊含量升高至穩(wěn)定，蛋白質(zhì)構(gòu)象會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化以適應(yīng)新環(huán)境，表面疏水性均會(huì)先升高后在高溫下輕微下降至穩(wěn)定，蛋白質(zhì)逐漸趨向完全變性。但復(fù)合肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和表面疏水性隨溫度變化的規(guī)律與單一蛋白又不完全相同，不同蛋白之間可能發(fā)生了相互作用，影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化規(guī)律。這在結(jié)構(gòu)和機(jī)理層面說(shuō)明，復(fù)合肌原纖維蛋白在結(jié)合單一蛋白特點(diǎn)的同時(shí)，蛋白質(zhì)間也可能發(fā)生相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)的凝膠特性產(chǎn)生影響。這將為復(fù)合蛋白凝膠、復(fù)合肉制品和中低溫肉制品的研究提供理論依據(jù)和參考。

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