三七皂苷對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響

繆吉，雷濤，楊光顯，金麗

運(yùn)動(dòng)性貧血導(dǎo)致機(jī)體缺血缺氧，各項(xiàng)機(jī)能尤其是神經(jīng)系統(tǒng)均會(huì)受到不同程度的影響，三七皂苷作為三七提取物，已經(jīng)被證實(shí)在耐缺氧、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等方面的藥理作用顯著。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NTFs家族中的重要一員，1982年由德國(guó)學(xué)者Barde等[1]首次從豬腦中純化并獲得，主要表達(dá)部位在皮層和海馬，是一種對(duì)神經(jīng)有廣泛性營(yíng)養(yǎng)作用的堿性蛋白。BDNF 能夠維持多類(lèi)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)，促進(jìn)樹(shù)突和軸突的長(zhǎng)出，改變腦內(nèi)神經(jīng)元的形態(tài)及功能可塑性，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元生存中起重要作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鼠海馬BDNF mRNA及對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)情況來(lái)研究運(yùn)動(dòng)性貧血對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響以及三七皂苷在運(yùn)動(dòng)性貧血發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物造模 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為24只SPF級(jí)健康雄性4周齡SD大鼠，購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量155～197g。將24只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)組和灌藥組各8只。動(dòng)物飼料為全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由飲食，每天自然光照12h、黑暗12h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度45%～65%。對(duì)運(yùn)動(dòng)組和灌藥組大鼠進(jìn)行為期10周，每周6天的遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練，跑臺(tái)坡度為0°，速度為30m/min。前2周每天訓(xùn)練1次，后8周每天訓(xùn)練2次，早上、下午各1次，第1次訓(xùn)練的時(shí)間為1min，之后每次訓(xùn)練增加2min，到第6周開(kāi)始時(shí)，訓(xùn)練時(shí)間為每次97min，保持此速度3周，從第9周開(kāi)始每次訓(xùn)練增加2min，直至10周訓(xùn)練結(jié)束。如果訓(xùn)練過(guò)程中大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重力竭癥狀，即連續(xù)施加機(jī)械刺激大鼠不能繼續(xù)跑動(dòng)、下跑臺(tái)后腹部觸底嚴(yán)重呈“甲魚(yú)狀”，則允許其休息2～5min，再繼續(xù)訓(xùn)練。從第5周開(kāi)始對(duì)灌藥組大鼠每天進(jìn)行1次灌藥。對(duì)大鼠每周進(jìn)行稱(chēng)重，按每10g體重0.1ml的三七皂苷藥物混合液進(jìn)行灌胃。為消除灌藥對(duì)大鼠行為及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從第五周開(kāi)始對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組的大鼠每天進(jìn)行一次生理鹽水的灌胃，劑量同樣為每10g體重0.1ml。本實(shí)驗(yàn)所用藥物為三七皂苷膠囊，由云南紅云生物工程有限公司提供，每粒含三七皂苷330mg。人體推薦量為每人每天兩粒，假設(shè)成人體重為60kg，折算后為每千克體重每天11mg。根據(jù)趙偉等[3]進(jìn)行的不同種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間用藥量換算的研究，我們將大鼠給藥量設(shè)定為人體推薦量的10倍，即每千克體重每天110mg。采用灌胃法準(zhǔn)確控制三七皂苷用量，溶劑為0.5%的生理鹽水。

1.2 標(biāo)本采集 10周訓(xùn)練結(jié)束后將大鼠腹腔麻醉后開(kāi)胸，取心尖血4～5ml，測(cè)量血液中血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)濃度和 紅細(xì)胞數(shù)目(Red Blood Cell Number,RBC)，然后斷頭取腦在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，于冰上剝離海馬，分裝入冷凍管中，將海馬迅速放入液氮中長(zhǎng)期保存。

1.3 指標(biāo)測(cè)試 ①血常規(guī)測(cè)試：利用BC-3000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)斷尾取血采集到的血液進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，測(cè)定Hb和 RBC。②大鼠海馬BDNF mRNA表達(dá)的測(cè)定：采用Real-time PCR法檢測(cè)BDNF mRNA基因表達(dá)。操作步驟如下：a.mRNA的提??；b.逆轉(zhuǎn)錄：將提取好的總mRNA在當(dāng)天逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；c.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，引物由Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)，并由英俊公司合成，上游引物TGCATACAGCCAGATACTAGAGC，下游引物：AAGTACCATTCCCCACCTCC，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為162bp。β-actin上游引物：CGTTGACATCCGTAAAGACCTC，下游引物TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為110bp；d.Real-time PCR數(shù)據(jù)處理。Real-time PCR數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以前，先驗(yàn)證目標(biāo)基因和參照基因β-actin擴(kuò)增效率都接近100%之后就可以運(yùn)用2-ΔΔCT法分析不同樣本中目標(biāo)基因表達(dá)水平的相對(duì)差異，數(shù)據(jù)由stepone plus自動(dòng)分析得出。③大鼠海馬BDNF蛋白含量的測(cè)定：采用ELISA法測(cè)定海馬組織BDNF的蛋白含量。BDNF蛋白的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的ELISA試劑盒，采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠海馬組織勻漿中蛋白含量。操作步驟如下：a.勻漿，用微量電子天平稱(chēng)量海馬組織，在錫箔紙上用剪刀剪碎放入勻漿管中，按照1mg組織加10 μl預(yù)冷生理鹽水的比例加入生理鹽水，用勻漿器充分勻漿，2500rpm離心10min，取上清液即為10%的組織勻漿液；b.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)籧.加樣：空白孔，空白對(duì)照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗BDNF抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A、顯色劑B和終止液，其余各步操作相同，標(biāo)準(zhǔn)品孔，加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl，鏈霉親和素-HR 50μl，待測(cè)樣品孔，加入樣本(已經(jīng)勻漿、離心后取出的上清液)40μl，然后各加入抗BDNF抗體10μl、鏈霉親和素-HRP 50μl，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60min，配液，將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用，洗滌，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干，顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min，終止，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)，測(cè)定，以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后10min內(nèi)進(jìn)行，計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Hb濃度、 RBC計(jì)數(shù)結(jié)果 訓(xùn)練10周后，運(yùn)動(dòng)組大鼠Hb濃度及RBC計(jì)數(shù)均較對(duì)照組及灌藥組低(P<0.05)，灌藥組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

組別nHb(g/dl)RBC(106/μl)對(duì)照組816.49±1.05a9.10±0.98a運(yùn)動(dòng)組812.19±0.577.08±0.96灌藥組813.24±1.16a7.77±0.68a

與運(yùn)動(dòng)組比較，aP<0.05

2.2 大鼠海馬BDNF mRNA含量、BDNF蛋白含量測(cè)定結(jié)果 10周訓(xùn)練后，運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬BDNF mRNA含量及BDNF蛋白含量測(cè)定均較對(duì)照組及灌藥組低(P<0.05)，灌藥組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

組別nBDNFmRNA(ng/ml)BDNF(ng/ml)對(duì)照組80.96±0.09a4.26±0.48a運(yùn)動(dòng)組80.77±0.033.49±0.21灌藥組80.86±0.12a3.83±0.42a

與運(yùn)動(dòng)組比較，aP<0.05

3 討論

3.1 大鼠運(yùn)動(dòng)性貧血模型的建立 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)具有運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度容易控制、動(dòng)物死亡率低等特點(diǎn)，是建立大鼠運(yùn)動(dòng)性貧血模型常用的運(yùn)動(dòng)方式。曹建民等[4]研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)組大鼠血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)性貧血模型造模成功。趙杰修等[5]在研究血紅素代謝限速酶和珠蛋白代謝在運(yùn)動(dòng)性貧血發(fā)生機(jī)理中的功能和作用時(shí)成功建立了運(yùn)動(dòng)性貧血模型。建模采用了為期11周，每周訓(xùn)練6d的跑臺(tái)訓(xùn)練，具體訓(xùn)練安排為：第1～2周每天訓(xùn)練1次，第3～11周每天訓(xùn)練2次，跑臺(tái)速度為30m/min，坡度為0°，起始運(yùn)動(dòng)時(shí)間為1min，前5周每次訓(xùn)練遞增2min，第6周每天訓(xùn)練時(shí)間固定為80min，第7周每天訓(xùn)練時(shí)間固定為85min，第8周開(kāi)始訓(xùn)練時(shí)間從90min開(kāi)始遞增，每天增加2min，直至11周訓(xùn)練結(jié)束。綜合分析各類(lèi)模型的優(yōu)缺點(diǎn)，本次研究采用了遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方式，在曹建民、趙杰修成功建立的運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠模型基礎(chǔ)上做了適當(dāng)調(diào)整。結(jié)果顯示，10周遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組大鼠Hb濃度比對(duì)照組低，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，運(yùn)動(dòng)組大鼠RBC計(jì)數(shù)比對(duì)照組低，說(shuō)明大鼠運(yùn)動(dòng)性貧血模型造模成功。

3.2 運(yùn)動(dòng)性貧血對(duì)大鼠海馬BDNF mRNA和蛋白表達(dá)的影響 不同的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷條件對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元造成的影響是不一樣的。劉曉莉等[6]對(duì)不同組別的SD大鼠分別進(jìn)行了3、7及12d的游泳訓(xùn)練，每天訓(xùn)練60min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著運(yùn)動(dòng)天數(shù)的增加，BDNF陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)數(shù)目也在增加，徐波等[7]對(duì)6周齡SD大鼠進(jìn)行了為期8周、每周5d的跑臺(tái)訓(xùn)練。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8周運(yùn)動(dòng)后運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬BDNF mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。有研究發(fā)現(xiàn)4周的轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)可明顯增加2、15和24個(gè)月齡大鼠海馬的BDNF mRNA水平，尤以2個(gè)月齡動(dòng)物增加的幅度最大[8]。Cechetti等[9]研究卻發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(20min/d, 連續(xù)2周)并未改變2～3月齡Wistar大鼠海馬BDNF的含量。婁淑杰等[10]對(duì)5周齡雄性SD大鼠分組進(jìn)行了連續(xù)1周不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，研究不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)幼齡大鼠海馬組織BDNF表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(5m/min 5min, 8m/min 5min, 11m/min 20min, 0°傾斜角)、中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(8m/min 5min, 11m/min 5min, 14m/min 20min, 0°傾斜角)、大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(8m/min 5min, 11m/min 5min, 22m/min 20min, 0°傾斜角)均可增加5周齡SD大鼠海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生，小強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可明顯誘導(dǎo)海馬BDNF基因表達(dá)，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)BDNF表達(dá)已沒(méi)有明顯作用，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)BDNF表達(dá)基本沒(méi)有影響。在本實(shí)驗(yàn)中，10周遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬BDNF mRNA含量和BDNF蛋白含量比對(duì)照組低，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，這與大多數(shù)研究結(jié)果并不一致。原因可能是長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致了運(yùn)動(dòng)性貧血的發(fā)生，進(jìn)而造成腦缺血缺氧性損傷，且損傷程度隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的不斷增加而加重，使得翻譯水平降低，BDNF的轉(zhuǎn)錄減少，BDNF蛋白含量減少。

3.3 三七皂苷對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響 詹合琴等[11]對(duì)成年雄性SD大鼠建立了大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，并選擇其中3組進(jìn)行不同劑量的三七皂苷Rg1腹腔注射。研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷Rg1 能顯著增加腦缺血后大鼠大腦皮質(zhì)和海馬BDNF 陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量和蛋白含量。閆俊嶺等[12]建立了同樣的雄性SD大鼠腦缺血再灌注模型，研究三七皂苷Rg1 對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬BDNF mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比， 三七皂苷Rg1 均能增加腦缺血再灌注損傷后1d、3d、5d時(shí)大鼠海馬陽(yáng)性神經(jīng)元中BDNF mRNA的含量。在本實(shí)驗(yàn)中，10周遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，灌藥組大鼠海馬BDNF mRNA含量和BDNF蛋白含量比運(yùn)動(dòng)組顯著增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明三七皂苷能促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)元BDNF mRNA的表達(dá)，增加大鼠海馬BDNF蛋白含量，對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血造成的缺血性腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。這與大多數(shù)學(xué)者所做的研究結(jié)果一致。

綜上，本研究認(rèn)為：①長(zhǎng)期遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠發(fā)生運(yùn)動(dòng)性貧血。②運(yùn)動(dòng)性貧血導(dǎo)致大鼠腦部發(fā)生缺血缺氧性損傷。③三七皂苷能促進(jìn)大鼠海馬BDNF的表達(dá)，對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血造成的腦缺血缺氧性損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

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沉痛悼念楊樹(shù)萱教授

中國(guó)共產(chǎn)黨黨員、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科教授、主任醫(yī)師楊樹(shù)萱同志因病醫(yī)治無(wú)效，于2017年9月22日凌晨1時(shí)不幸逝世，享年87歲。

楊樹(shù)萱教授，漢族，男，祖籍廣東，1930年4月20日出生于上海。1954年畢業(yè)于廣州嶺南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，分配至中南同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院工作，1956年7月來(lái)武漢醫(yī)學(xué)院附二院醫(yī)療體療科(現(xiàn)同濟(jì)醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科)工作，歷任助教、住院醫(yī)師、講師、主治醫(yī)師、副教授、副主任醫(yī)師、教授、主任醫(yī)師。一直致力于運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和康復(fù)專(zhuān)業(yè)疾病的診療和預(yù)防工作，對(duì)本學(xué)科常見(jiàn)病、多發(fā)病特別是對(duì)運(yùn)動(dòng)損傷的診治精準(zhǔn)、規(guī)范，經(jīng)驗(yàn)獨(dú)到。他醫(yī)術(shù)精湛，視病人如親人，深受患者好評(píng)；他孜孜不倦，積極探索，積多年臨床實(shí)踐工作經(jīng)驗(yàn)，撰寫(xiě)了多篇有影響的學(xué)術(shù)論文；他博聞廣識(shí)，精心帶教，授業(yè)解惑，退休后仍樂(lè)此不疲，深受廣大學(xué)生與晚輩的尊敬與愛(ài)戴。

楊樹(shù)萱教授熱心學(xué)會(huì)工作，曾任中華醫(yī)學(xué)會(huì)武漢分會(huì)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)會(huì)副主任委員、中國(guó)體育科學(xué)會(huì)湖北分會(huì)常務(wù)理事、武漢殘疾人福利基金會(huì)康復(fù)協(xié)會(huì)常務(wù)理事、中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)湖北分會(huì)常委，為學(xué)會(huì)建設(shè)與發(fā)展做出了積極貢獻(xiàn)。

楊樹(shù)萱教授一向關(guān)心和支持雜志工作，在擔(dān)任《中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志》審稿、定稿專(zhuān)家和《中國(guó)康復(fù)》雜志編委期間乃至退休以后，認(rèn)真審稿、嚴(yán)把學(xué)術(shù)關(guān)，在提高雜志學(xué)術(shù)水平和引領(lǐng)學(xué)科發(fā)展方面發(fā)揮了重要作用。

楊樹(shù)萱教授作為一名共產(chǎn)黨員，嚴(yán)于律己，寬以待人，仁愛(ài)為懷，助人為樂(lè)。不僅對(duì)工作兢兢業(yè)業(yè)、一絲不茍，對(duì)身邊同志更是關(guān)心、愛(ài)護(hù)和幫助，經(jīng)常在工作、學(xué)習(xí)和生活上對(duì)年輕同事進(jìn)行指導(dǎo)和幫助，深受同事信賴與尊敬。

楊樹(shù)萱教授的逝世，使我們失去了一位仁愛(ài)的長(zhǎng)者和良師益友。但他嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的治學(xué)精神和科學(xué)求真、精益求精的工作作風(fēng)，以為我們樹(shù)立了崇高的典范，將永遠(yuǎn)銘記在我們心中！他的學(xué)者風(fēng)范將與世長(zhǎng)存！

《中國(guó)康復(fù)》編輯部

《中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志》編輯部