氧化銀鈦納米管治療骨關(guān)節(jié)假體相關(guān)性感染的實驗研究

王成貴，李宣明

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)能達(dá)到緩解關(guān)節(jié)疼痛，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能的目的。生物材料相關(guān)感染是醫(yī)療植入物最嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥之一，導(dǎo)致病人痛苦，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)甚至死亡。感染可能是由于術(shù)前不完全消毒，外科手術(shù)過程中的非標(biāo)準(zhǔn)方案，或手術(shù)后細(xì)菌從感染的，鄰近的組織和血源傳遞到植入物表面。在細(xì)菌到達(dá)植入物表面后，它們將聚集在由它們自身分泌的細(xì)胞外粘性多糖中以形成生物膜。生物膜使細(xì)菌對宿主防御和抗菌劑具有高度抗性，從而導(dǎo)致持續(xù)和慢性感染。納米材料可以有效地提高生物材料的生物學(xué)性能。Ag 納米顆粒（Nanoparticle，NPS）或鹽目前用于各種醫(yī)療材料和設(shè)備中以預(yù)防感染，例如傷口敷料、燒傷軟膏、導(dǎo)管、血管移植物和骨骼固定裝置。氧化銀鈦納米管（AgO-TiO-NTS）不是將Ag加載到所形成的TiONTS中，而是采用在Ti上沉積TiAg 涂層然后進(jìn)行陽極氧化的策略來制造負(fù)載Ag 的TiONTS。AgO-TiO-NTS 具有嵌入無定形二氧化鈦納米管壁中的結(jié)晶AgO NP的獨特結(jié)構(gòu)，并且由于二氧化鈦產(chǎn)生的屏障效應(yīng)，NT-AgO陣列顯示出較慢的Ag釋放。本研究通過體內(nèi)外實驗，探討裝載了AgO-TiO-NTS 在治療骨關(guān)節(jié)假體相關(guān)性感染過程中，對表面葡萄球菌及金黃色葡萄球菌的抑菌作用。

1 材料和方法

1.1 一般材料

2018 年5 月至2019 年5 月使用健康新西蘭大白兔32只［由河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物許可證號：SYXK（冀）2017-002］，建立人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染模型，并隨機(jī)分為表-Ag釘組（使用AgO-TiO-NTS 復(fù)合涂層的螺釘，拆線后1 d，兔術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)注入表皮葡萄球菌懸液，n＝8）、表-普釘組（使用沒有涂層的普通螺釘，拆線后1 d，兔術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)注入表皮葡萄球菌懸液，n＝8）、金-Ag釘組（使用AgO-TiO-NTS 復(fù)合涂層的螺釘，拆線后1 d，兔術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)注入金黃色葡萄球菌懸液，n＝8）、金-普釘組（使用沒有涂層的普通螺釘，拆線后1 d，兔術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)注入金黃色葡萄球菌懸液，n＝8）。每組各4 只雄性和4 只雌性，以避免因性激素而產(chǎn)生的性別偏見和不同結(jié)果。所有實驗程序均經(jīng)動物保護(hù)和使用委員會批準(zhǔn)的方案下進(jìn)行，根據(jù)實驗動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行實驗。

1.2 人工膝關(guān)節(jié)置換大白兔模型

以20%烏拉坦（3 mL∕kg）進(jìn)行麻醉，在左側(cè)髕骨外側(cè)0.5 cm處作一長約6～8 cm的縱行切口，將髕骨向外翻開，切除半月板及前交叉韌帶，保留后交叉韌帶。屈膝90°，擴(kuò)髓，股骨髁和脛骨平臺各截骨2 mm。根據(jù)髓腔及骨床的大小選取合適的人工膝關(guān)節(jié)假體并復(fù)位。

1.3 方法

1.3.1 AgO-TiO-NTS 將純Ti 棒切成薄片（F14 mm×2 mm）并用作基材。將樣品拋光至鏡面上，然后分別在丙酮，乙醇和去離子水中依次超聲清洗5 min，并在引入沉積室之前在空氣中干燥。通過脈沖DC 磁控濺射在室溫下用TiAg 靶將TiAg 涂層沉積在Ti 上。在沉積之前，將基板在～800 V 的偏壓，40%的占空比，60 kHz 的脈沖頻率和5.0 Pa 的工作壓力下濺射清洗30 min。然后，在300 的目標(biāo)功率下進(jìn)行TiAg 涂層的沉積，脈沖頻率為60 kHz，工作壓力為0.8 Pa，沉積時間為3 h。對沉積的Ti-Ag 涂層進(jìn)行電化學(xué)陽極氧化，以產(chǎn)生AgO-TiO-NTS，如圖1 所示。使用含有0.3%的乙二醇溶液作為電解質(zhì)。陽極氧化在室溫下以30 V 的恒定DC電勢在具有鉑（Pt）箔對電極的雙電極設(shè)置上進(jìn)行4 h。在陽極氧化之后，立即用去離子水洗滌樣品并超聲清洗以除去殘留的電解質(zhì)以及表面氧化物層。

圖1 抗菌涂層鈦納米管Ag2O-TiO2-NTS制備示意圖

1.3.2 人工膝關(guān)節(jié)制備 兔的人工膝關(guān)節(jié)是仿生關(guān)節(jié)，基于兔膝關(guān)節(jié)的解剖形態(tài)和生物動力學(xué)特點，設(shè)計并且用鈦合金（Ti6Al4V，中國有色金屬研究所，中國）制造。兔的人工膝關(guān)節(jié)由股骨髁假體和脛骨平臺假體及與其相連的髓內(nèi)延長桿組成，關(guān)節(jié)面拋光。

1.3.3 抗菌測定 通過平板計數(shù)法評估AgO-TiO-NTS對革蘭陽性表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性。將細(xì)菌在牛肉提取物-蛋白胨（BEP）培養(yǎng)基中在攪拌下培養(yǎng)18 h，（37.0±0.5）℃。用BEP 稀釋至濃度為1.0×10CFU∕mL，將50 mL 細(xì)菌懸浮液加入每個樣品表面，共分為四組：1 mmol∕L組、2 mmol∕L 組、5 mmol∕L 組和10 mmol∕L 組。并將具有細(xì)菌懸浮液的樣品在（37.0±0.5）℃下在相對濕度＞90%的黑暗中溫育12 h。在孵育期結(jié)束時，將每個樣品在PBS中沖洗并超聲攪拌以從樣品中分離細(xì)菌。PBS中的活細(xì)菌通過標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)稀釋和平板計數(shù)來定量。將樣品滅菌，超聲清洗，并在（37.0±0.5）℃下在10 mL PBS 中孵育6.5 d，每天更換PBS。使用細(xì)菌培養(yǎng)測定重新研究樣品。14 d 的抗菌活性：R＝（B-A）∕B×100%其中R是抗菌速率，B和A分別是TiONT（對照）和不同濃度AgO-TiO-NTS（樣品）上的活細(xì)菌（CFU）的平均數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖 新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用于AgO-TiO-NTS 的生物學(xué)測定。將細(xì)胞在補充有10%小牛血清（CBS），100 U∕mL青霉素和100 mg∕mL鏈霉素的α-MEM中，在37 ℃，5%二氧化碳的濕潤氣氛中培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到亞干擾時，通過溫和胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，離心，重懸于完全培養(yǎng)基中并重新接種。為了評估細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒性和形態(tài)，將膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以2×10個細(xì)胞∕cm的密度接種在樣品上。通過用于哺乳動物細(xì)胞的LIVE∕DEADO 活力∕細(xì)胞毒性試劑盒測定樣品的細(xì)胞毒性。通過MTT 方法定量評估細(xì)胞增殖和活力。在酶標(biāo)儀（In fi nite F50，TECAN）上在570 nm和600 nm下測量吸光度。

1.3.5 白細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白（CRP）水平、降鈣素原（PCT）水平和紅細(xì)胞沉降率（ESR） 假體周圍感染通常會導(dǎo)致感染典型的實驗室檢查發(fā)生變化。指南建議確定CRP、PCT 水平和ESR。使用市售試劑盒細(xì)胞內(nèi)PCT 和CRP 活性。THME-ESR2040 動態(tài)血沉分析儀檢測ESR，所有檢測均按儀器及試劑說明書規(guī)范操作。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的AgO-TiO-NTS 溶液菌落數(shù)及抗菌率比較

僅1 mmol∕L 和2 mmol∕L 兩組P＞0.05，其余5 mmol∕L 組和10 mmol∕L 組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著AgO-TiO-NTS溶液濃度的增加，抗菌率逐漸增加，10 mmol∕L AgO-TiO-NTS 溶液抗菌效果最強(qiáng)（32.34±1.75）CFU，故以10 mmol∕L Ag2O-TiO2-NTS 溶液制作表-Ag 釘組及金-Ag釘組的復(fù)合涂層并用于實驗（表1）。

表1 Ag2O-TiO2-NTS不同處理的新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)菌落數(shù)和抗菌率統(tǒng)計

2.2 細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖

使用LIVE ∕DEADO 活力∕細(xì)胞毒性試劑盒定性測定Ag 釘?shù)募?xì)胞毒性，結(jié)果顯示，表-Ag釘組、表-普釘組及金-Ag釘組和金-普釘組細(xì)胞死亡數(shù)目和細(xì)胞增殖數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明AgO-TiO-NTS 沒有毒性且不影響細(xì)胞增殖，安全可靠。見表2。

表2 不同方法處理人工膝關(guān)節(jié)置換模型兔32只膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖∕（CFU，）

表3 不同方法處理人工膝關(guān)節(jié)置換模型兔32只肛溫水平比較∕（℃，）

表4 不同方法處理人工膝關(guān)節(jié)置換模型兔32只C反應(yīng)蛋白（CPR）水平比較∕（mg∕L，）

表5 不同方法處理人工膝關(guān)節(jié)置換模型兔32只紅細(xì)胞沉降率（ESR）水平比較∕（mm∕h，）

表6 不同方法處理人工膝關(guān)節(jié)置換模型兔32只降鈣素原（PCT）水平比較∕（μg∕L，）

2.3 各組肛溫、CRP、ESR、PCT 水平比較

金-普釘組肛溫注射后10 d 最高（41.94±0.87）℃；金-普釘組CRP 注射后14 d 最高（91.95±6.47）mg∕L；金-普釘組ESR 注射后14 d 最高（70.13±4.47）mg∕L；金-普釘組PCT 注射后14 d 最高（2.58±0.54）μg∕L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3～6。

2.4 不同處理組并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率

表-Ag釘組與表-普釘組比較及金-Ag釘組與金-普釘組比較，并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），如表7所示。

表7 不同方法處理人工膝關(guān)節(jié)置換模型兔32只并發(fā)癥發(fā)生率和病死率比較∕%

3 討論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的并發(fā)癥對病人和治療它們的醫(yī)生構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。例如，原發(fā)性膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的并發(fā)癥發(fā)生率為2%～10%。其中圍手術(shù)期關(guān)節(jié)假體周圍感染是第三大常見并發(fā)癥。根據(jù)最近的研究，初次全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的假體周圍感染的平均發(fā)生率為0.2%～2%。對于二次手術(shù)，它可以高達(dá)5%。關(guān)于感染發(fā)生率的數(shù)據(jù)根據(jù)人工關(guān)節(jié)的位置和類型（臀部＜1%，膝關(guān)節(jié)＜2%，肘＜9%，肩關(guān)節(jié)＜1%，巨型內(nèi)置假體∕腫瘤內(nèi)假體15%）和病人依賴因素而變化。假體周圍關(guān)節(jié)感染是人工關(guān)節(jié)二次手術(shù)的最常見原因之一（髖部15%，膝關(guān)節(jié)25%）。危險因素可分為以下幾組：病人依賴因素（如體質(zhì)量過重，糖尿病，尼古丁∕酒精∕藥物濫用，營養(yǎng)不良），手術(shù)依賴因素（如手術(shù)時間延長），植入依賴因素（如巨型-假體），所有這些都增加了假體周圍關(guān)節(jié)感染的風(fēng)險。引起假體周圍關(guān)節(jié)感染的最常見病原體是表皮葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，鏈球菌，腸球菌和革蘭陰性菌。病原體可能在手術(shù)期間或之后進(jìn)入關(guān)節(jié)，或者它們可以從相鄰的感染部位連續(xù)擴(kuò)散到關(guān)節(jié)。

感染預(yù)防除了術(shù)前風(fēng)險評估和風(fēng)險最小化之外，感染預(yù)防包括快速，適當(dāng)?shù)氖中g(shù)，最大限度地減少手術(shù)風(fēng)險，以及具有足夠經(jīng)驗的手術(shù)團(tuán)隊。治療優(yōu)化可以降低長期成本并降低病人的風(fēng)險。本研究中，AgO-TiO-NTS材料顯示較慢的Ag釋放，因為被TiO屏障包圍，從而減少Ag釋放引起的細(xì)胞毒性。我們的工藝沿著NT 的整個長度產(chǎn)生均勻分布的Ag NP，并且可以在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)摻入的Ag的量。AgO-TiO-NTS顯示出良好的抗菌特性和細(xì)胞相容性，并且在預(yù)防植入物相關(guān)感染方面具有良好效果。而且，NT-AgO陣列的制造工藝簡單，經(jīng)濟(jì)且通用。盡管與其他的研究報道相比，AgO-TiO-NTS 中的Ag釋放顯著減少，但是AgO-TiO-NTS的長期抗菌能力仍能得到很好的維持。有人提出Ag的抗菌活性主要是釋放的Agb，它誘導(dǎo)細(xì)菌蛋白的失活，DNA的縮合和細(xì)菌細(xì)胞膜的降解。此外，據(jù)報道，Ag NPS與細(xì)菌之間的直接接觸會誘導(dǎo)質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)變化和功能損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)滲漏和細(xì)菌溶解。因此，AgO-TiO-NTS的抗菌活性源于釋放的Ag與Ag NP 直接接觸的協(xié)同作用。鑒于兩種抗菌機(jī)制，AgO-TiO-NTS可在植入物表面上產(chǎn)生持續(xù)的抗菌環(huán)境。應(yīng)該注意的是，與其他研究相比，盡管在我們的抗菌測定中樣品表面引入的細(xì)菌較少，但實驗條件仍然比體內(nèi)正常情況更為嚴(yán)酷。預(yù)計AgO-TiO-NTS 可以防止感染發(fā)生的有效時間比本研究證明的14 d更長。

確定AgO-TiO-NTS 是否具有良好的細(xì)胞相容性是有意義的。在我們的實驗中，從所有AgO-TiO-NTS 釋放的Ag的量遠(yuǎn)低于所有普遍接受的人體細(xì)胞毒性濃度閾值。正如細(xì)胞實驗所證明的，AgOTiO-NTS對細(xì)胞的增殖和活力沒有明顯的有害影響。

綜上所述，AgO-TiO-NTS 通過TiAg 涂層的磁控濺射和陽極氧化產(chǎn)生。該材料由嵌入無定形TiO納米管壁中的結(jié)晶AgO NP 組成。AgO-TiO-NTS在體內(nèi)外均對表面葡萄球菌及金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌作用，在治療骨關(guān)節(jié)假體相關(guān)性感染有良好前景。該技術(shù)可以擴(kuò)展到其他功能性涂層和生物材料。