新城疫病毒D90毒株抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的體外研究

李昆鵬，隋紅，柴政，郭佃磊，張雪云，王香玲，李曦，余麗蕓

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；4.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院）

新城疫病毒D90毒株抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的體外研究

李昆鵬1，隋紅2，柴政3，郭佃磊3，張雪云4，王香玲3，李曦3，余麗蕓1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；4.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院）

為了探究NDV-D90對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制作用，通過(guò)細(xì)胞毒性、腫瘤細(xì)胞侵襲和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定新城疫病毒D90毒株（Newcastle disease virus，NDV-D90）對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823（低分化）的抑制作用。結(jié)果顯示：NDV-D90能抑制BGC-823細(xì)胞的增殖和侵襲，病毒在BGC-823細(xì)胞中有很強(qiáng)的復(fù)制能力，并且NDV-D90對(duì)BGC-823細(xì)胞主要造成壞死并伴隨著少量的凋亡。

新城疫病毒D90毒株；胃癌BGC-823細(xì)胞系；凋亡；壞死

人胃癌細(xì)胞系有很多，根據(jù)分化程度不同[1-2]和分離地點(diǎn)不同，有以下細(xì)胞系：BGC-823細(xì)胞系，SGC-7901細(xì)胞系，MGC-803細(xì)胞系，MKN-28細(xì)胞系，MKN-1細(xì)胞系，MKN-45細(xì)胞系，MKN-74細(xì)胞系等。其中BGC-823為低分化的胃癌細(xì)胞系，惡性程度很高。很多人對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡作用做了深入研究，王旭等應(yīng)用HE染色和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：丹參酮ⅡA能誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制其增值，并且改變其凋亡形態(tài)[3]。Wei Liu等發(fā)現(xiàn)藤黃酸也具有使BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用及抗腫瘤效果[4]。徐立春等用流式細(xì)胞術(shù)法、FITC-AnnexinV與PI雙染法、AO/EB雙熒光染色及熒光顯微鏡、MTT等實(shí)驗(yàn)方法，證明莪術(shù)醇能抑制BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)并在此過(guò)程中發(fā)生凋亡[5]。也有研究報(bào)道，用熊果酸、復(fù)康辛、牡蠣天然活性肽、冬凌草甲素、奧沙利鉑聯(lián)合培美曲塞及二烯丙基二硫等均能誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞增殖且抑制其生長(zhǎng)[6-11]。

目前，具有溶瘤作用的病毒被發(fā)現(xiàn)了很多。這些病毒包括腺病毒、狂犬病病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒、呼腸孤病毒（reovirus）和新城疫病毒[12]。新型天然溶瘤病毒M1屬甲病毒屬，也具有溶瘤作用[13]。

溶瘤病毒是指能夠特異性識(shí)別并感染腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞中大量、快速?gòu)?fù)制一類病毒[14]。溶瘤病毒能特異性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞并在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，最終使腫瘤細(xì)胞破碎裂解，但是在正常組織細(xì)胞中不復(fù)制。溶瘤病毒的這個(gè)特點(diǎn)使溶瘤病毒具有成為一種理想生物治療腫瘤的安全抗腫瘤試劑。

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種重要的溶瘤病毒[15]，新城疫病毒由6種病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別是L、NP、P、HN、F、M蛋白，其中融合蛋白（F）和血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）是主要的保護(hù)性抗原，在致病過(guò)程中起到重要的作用[16]。雞新城疫病毒作為一種溶瘤試劑具有悠久的歷史。NDV可有選擇性地在腫瘤細(xì)胞中增殖并起到特異殺傷作用[17]，NDV在人類癌細(xì)胞中的復(fù)制效率是在正常細(xì)胞中的10 000倍[18-20]。目前研究可用于治療人類腫瘤的NDV包括溶瘤型毒株MTH68/H、PV-701和73-T，非溶瘤型病毒株Ulster，弱毒株HUJ（OV001）[21]。新城疫病毒的毒株和毒力不同，對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生的殺傷作用也有很大的區(qū)別。幾個(gè)臨床試驗(yàn)證明雞新城疫病毒是一種高效、安全的治療腫瘤的試劑。對(duì)人基本無(wú)致病性，除了輕微的流感樣癥狀和結(jié)膜炎。NDV與胃癌的研究可以追溯到上世紀(jì)，尤其在1950～1960年之間，應(yīng)用溶瘤病毒的抗腫瘤的作用得到了更深入的研究。1912年，DePace[22]發(fā)現(xiàn)了狂犬病病毒具有使抑制子宮頸癌的能力，科學(xué)家們從此開(kāi)始研究溶瘤病毒，并挖掘出了多種溶瘤病毒。1950年，Sinkovics研究證明新城疫病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[22]，之后科學(xué)家認(rèn)識(shí)到可以利用溶瘤病毒來(lái)攻克癌癥疾病的困擾。

2006年，符芳等證明NDV-D90對(duì)肺癌A549細(xì)胞有很好的抑制能力[24-25]。2014年，張春曉等證明了NDV-D90具有抑制口腔鱗癌細(xì)胞系遷移和侵襲的能力[26]。2014年，張?jiān)鰩X等證明NDV-D90對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有抑制作用[27]。NDV-D90對(duì)多種細(xì)胞具有抑制作用，為了進(jìn)一步探究NDV-D90是否對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞也具有抑制作用，研究NDV-D90對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞系體內(nèi)外的抑制能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞

病毒：NDV-D90毒株來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

細(xì)胞：BGC-823細(xì)胞采購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞系資源庫(kù)上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要儀器及試劑

流式細(xì)胞儀：FACS Aria BD公司，美國(guó)；青、鏈霉素（10 000 U·mL-1），PBS緩沖液，0.25%含EDTA胰蛋白酶，0.25%無(wú)EDTA胰蛋白酶國(guó)產(chǎn)。RPMI1640，胎牛血清：Hyclone公司，美國(guó)。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑購(gòu)買于KeyGEN公司，Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)自DOJINDO。BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber購(gòu)自BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞胚擴(kuò)繁NDV-D90病毒

采用9～11日齡的無(wú)特定病原（Specific pathogen free，SPF）雞胚5個(gè)，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。在超凈工作臺(tái)中，將NDV-D90病毒連續(xù)10倍稀釋6次，取10-6倍稀釋的NDV-D90病毒稀釋液100 μL，注射雞胚的尿囊腔內(nèi)。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，無(wú)菌操作吸取尿囊液（如果有沉淀，則10 000 rpm·min-1離心5 min），測(cè)定病毒液的TCID50，-70℃保存，備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在液氮罐中取出凍存的BGC-823細(xì)胞，放入含有37℃水的燒杯中，細(xì)胞凍存液融化后，將細(xì)胞吸入無(wú)菌Ep管中。在離心機(jī)中瞬離，去掉細(xì)胞凍存液。將BGC-823細(xì)胞接種于含有1%青-鏈霉素10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。在含有5%CO2，溫度為37℃，飽和水分的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁率為80%～90%時(shí)傳代一次（約2 d）。

1.2.3 NDV-D90致BGC-823細(xì)胞病變

首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌細(xì)胞。將胃癌細(xì)胞以105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿加入MOI為0.01的NDV-D90，在37℃，飽和水分的5%CO2培養(yǎng)箱感作1 h。棄去病毒液，加入2 mL的2%FBS的RPMI-1640細(xì)胞維持液。隨時(shí)觀察細(xì)胞病變的情況。

1.2.4 病毒含量的測(cè)定

首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌細(xì)胞。將胃癌細(xì)胞以105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿加入MOI為0.01的NDV-D90，在37℃，飽和水分的5%CO2培養(yǎng)箱感作1 h。棄去病毒液，加入2 mL的2%1 640細(xì)胞維持液。每12 h收取一孔細(xì)胞（共6次）及上清。1 000 rpm·min-1離心5 min，留上清。則病毒感染細(xì)胞的時(shí)間分別為12、24、36、48、60和72 h。測(cè)病毒感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，上清液中病毒的含量。用TCID50·0.1 mL-1表示病毒的含量。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 病毒在BGC-823細(xì)胞中的增殖能力分析

首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌細(xì)胞。將胃癌細(xì)胞以105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿加入MOI為0.01的NDV-D90，在37℃，飽和水分的5%CO2培養(yǎng)箱感作1 h。棄去病毒液，加入2 mL的2%FBS的RPMI-1640細(xì)胞維持液。每12 h收取一孔細(xì)胞（共6次）及上清。1 000 rpm·min-1離心5 min，留上清。則病毒感染細(xì)胞的時(shí)間分別為12、24、36、48、60和72 h。測(cè)病毒感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，上清液中病毒的含量。用TCID50·0.1-1mL表示病毒的含量。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 NDV-D90對(duì)BGC-823細(xì)胞的毒性檢測(cè)

用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒檢測(cè)NDV-D90對(duì)BGC-823細(xì)胞的細(xì)胞毒性，具體步驟如下：

（1）用100 μL排槍吸取細(xì)胞懸液放入96孔板中，使加入細(xì)胞的量為5×104個(gè)。將96板放在37℃，飽和水分的5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。

（2）待細(xì)胞長(zhǎng)滿加入病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI=病毒顆粒/腫瘤細(xì)胞）分別為0.001，0.01，0.1，1和10的NDV-D90，在含有5% CO2，溫度為37℃，飽和水分的培養(yǎng)箱中感作1 h，對(duì)照組不加病毒感作。換2%RPMI-1640細(xì)胞維持液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)孵育12、24、36、48、60和72 h。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

（3）待孵育時(shí)間完成后向待測(cè)孔中加入10 μL CCK-8溶液，加入的過(guò)程中不要產(chǎn)生氣泡（若有氣泡，用棉簽去除），否則會(huì)影響OD值的讀數(shù)。

（4）將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃，飽和水分的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。

（5）用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)板在450 nm處的吸光度值，并計(jì)算分析。

（6）細(xì)胞存活率（%）=[A（加病毒）-A（空白）]/[A（未加病毒）-A（空白）]×100

A（加病毒）：含有病毒溶液、CCK溶液和細(xì)胞的孔的吸光度值

A（空白）：只含有CCK溶液和培養(yǎng)基而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度值

A（未加病毒）：只含有細(xì)胞、CCK溶液孔的吸光度值。

1.2.7 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用0.25%含EDTA胰酶消化收集胃癌細(xì)胞。胃癌細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后加入NDV-D90（MOI=0和0.1）在37℃，飽和水分的5% CO2培養(yǎng)箱感作1 h。應(yīng)用BD公司的的24孔板侵襲小室，該小室包被一層薄的細(xì)胞外基質(zhì)并由8 μm聚乙烯膜封閉。消化法從6孔板中獲取經(jīng)NDV-D90處理的胃癌細(xì)胞和未經(jīng)病毒處理的胃癌細(xì)胞，用含1% FBS培養(yǎng)基洗滌3次（1 000 rpm·min-1，5min）。用含有1%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞調(diào)整至5× 104個(gè)·mL-1。上室加200 μL細(xì)胞懸液，下室加入750 μL細(xì)胞RPMI-1640培養(yǎng)基，含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，10%的FBS作為化學(xué)吸引物，37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱孵育14 h。吸掉上室中的培養(yǎng)基，將侵襲小室移到無(wú)培養(yǎng)基的24孔板中，用無(wú)菌的PBS緩沖液清洗2～3次。上室中加入250 μL的50 μM的Calcein-AM溶液，下室中加入750 μL的50 μM的Calcein-AM溶液。在37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱中避光孵育15～30 min。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次。在綠光為激發(fā)光的熒光倒置顯微鏡上觀察細(xì)胞。隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并保存圖片。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)

用不含EDTA的胰酶（EDTA對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響，容易造成假陽(yáng)性）消化收集胃癌細(xì)胞。將胃癌細(xì)胞以4× 105個(gè)每孔接種于12孔板，放入37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸去培養(yǎng)基分別加入不同MOI值的NDV-D90（MOI=0，0.01，0.1和1）在37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱中感作1 h，棄去病毒稀釋液，加入2%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基，放入37℃飽和水分的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24、48和72 h收取細(xì)胞。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用不含EDTA胰酶消化收集一孔細(xì)胞，重懸于PBS緩沖液中，收集細(xì)胞大于等于1×104個(gè)。

流式上機(jī)具體操作步驟如下：

（1）用無(wú)菌預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次（1 000 rpm，5 min）。

（2）加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。

（3）加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，輕輕混勻。避光、室溫反應(yīng)10 min。

（4）加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，冰上備用。

陰性對(duì)照及Annexin V和PI的補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

（1）陰性對(duì)照：取正常（未經(jīng)病毒處理）細(xì)胞約105個(gè)，用無(wú)菌預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次（1 000 rpm，5min）。加入500 μL 1×Binding Buffer。冰上備用。

（2）Annexin V補(bǔ)償：取正常（未經(jīng)病毒處理）細(xì)胞約105個(gè)，在60℃水浴鍋水浴6 min（不同的細(xì)胞水浴的時(shí)間不同）。取出細(xì)胞用無(wú)菌預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次（1 000 rpm，5 min）。加入100 μL 1× Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5 μL·Annexin VFITC Staining Solution，避光、室溫反應(yīng)10 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻。冰上備用。

（3）PI補(bǔ)償：取正常（未經(jīng)病毒處理）細(xì)胞約105個(gè)，在60℃水浴鍋水浴6 min（不同的細(xì)胞水浴的時(shí)間不同）。取出細(xì)胞用無(wú)菌預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次（1 000 rpm，5min）。加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5 μL·PI Staining Solution，避光、室溫反應(yīng)10 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻。冰上備用。

以上操作皆盡量在冰上操作。利用FACS can流式細(xì)胞儀（USA）分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。以碘化丙啶（PI）染色陰性，膜連蛋白（Annexin V）染色陽(yáng)性為早期凋亡細(xì)胞。以碘化丙啶（PI）染色陽(yáng)性性，膜連蛋白（Annexin V）染色陽(yáng)性為晚期凋亡細(xì)胞。以碘化丙啶（PI）染色陽(yáng)性，膜連蛋白（Annexin V）染色陰性為死細(xì)胞。以碘化丙啶（PI）染色陰性，膜連蛋白（Annexin V）染色陰性為正常的活細(xì)胞。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 BGC-823細(xì)胞病變

BGC-823細(xì)胞對(duì)NDV-D90病毒敏感，接入MOI=0.01的病毒24 h后，細(xì)胞出現(xiàn)合胞體結(jié)構(gòu)，如圖1所示，有明顯的CPE產(chǎn)生。

圖1 BGC-823細(xì)胞病變Fig.1BGC-823 cell’s CPE

2.2 病毒含量測(cè)定

圖2 NDV-D90病毒在BGC-823細(xì)胞中增殖曲線Fig.2 NDV-D90 virus multiplication in BGC-823 cell

用MOI為0.01的NDV-D90感染BGC-823細(xì)胞，將96孔板放置于酶標(biāo)儀上，在OD450nm掃描分析存活細(xì)胞數(shù)，分析處理得到的數(shù)據(jù)繪制如圖2所示。用TCID50·0.1-1mL表示病毒的滴度。如圖2中，NDV-D90在BGC-823細(xì)胞中，12 h開(kāi)始增殖。12～60 h持續(xù)增殖，并且在60 h時(shí)增殖到最大，達(dá)到1010個(gè)TCID50·0.1-1mL。因此，NDV-D90病毒可在BGC-823細(xì)胞中大量復(fù)制。

2.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)

用不同MOI的NDV和不同的感染時(shí)間處理BGC-823細(xì)胞，在OD450nm掃描分析存活細(xì)胞數(shù)。去掉背景后，用實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值表示細(xì)胞存活率。分析處理得到的數(shù)據(jù)繪制如圖3所示：BGC-823細(xì)胞經(jīng)不同MOI值的NDV-D90病毒處理，MOI分別是0.001，0.01，0.1，1和10，在12、24、36、48、60和72 h檢測(cè)細(xì)胞的存活率。NDV-D90病毒對(duì)BGC-823細(xì)胞有強(qiáng)的殺傷能力。隨著MOI值的增大，出現(xiàn)BGC-823細(xì)胞死亡的時(shí)間越快，存活率越低。在MOI為0.001，0～24 h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)了少量增殖的情況，在40 h后出現(xiàn)明顯的凋亡。當(dāng)MOI為0.01，0～24 h時(shí)，BGC-823細(xì)胞出現(xiàn)了少量增殖的情況，在40 h后出現(xiàn)明顯的凋亡。當(dāng)MOI為0.1，0～24 h時(shí)，BGC-823細(xì)胞也出現(xiàn)了少量增殖，在24～72 h出現(xiàn)明顯的凋亡，細(xì)胞的存活率下降。當(dāng)MOI為1，0～24 h時(shí)，BGC-823細(xì)胞增殖不明顯，在12～36 h時(shí)明顯快速的凋亡。當(dāng)MOI為1，0～72 h時(shí)，BGC-823細(xì)胞未出現(xiàn)增殖，在12～36 h時(shí)明顯快速的凋亡。并且無(wú)論MOI值為多少，最后的細(xì)胞存活率趨于一致。因此得到結(jié)論：病毒的MOI值越高，對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制能力越強(qiáng)。

圖3 NDV-D90對(duì)BGC-823細(xì)胞的細(xì)胞毒性分析Fig.3The BGC-823 cell viable assay

2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，侵襲指數(shù)（invasion index）=實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)。如圖4中A和B所示，經(jīng)NDV-D90處理BGC-823細(xì)胞穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)和8 μm膜的細(xì)胞數(shù)量少，未經(jīng)過(guò)NDVD90處理的BGC-823細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)多。

圖4 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Fig.4Tumor invasion assay

2.5 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)分析不同的MOI值和不同的病毒感染時(shí)間，對(duì)不同細(xì)胞凋亡發(fā)生的凋亡進(jìn)行分析。左上限（Q1區(qū)）為死細(xì)胞，左下限（Q3區(qū)）為正常的活細(xì)胞，右上限（Q2區(qū)）為晚期凋亡細(xì)胞（死亡細(xì)胞），右下限（Q4區(qū)）為早期凋亡細(xì)胞。

如圖5中所示，Annexin-V單染出現(xiàn)在Q3區(qū)和Q4區(qū)，Annexin-V單染的半數(shù)細(xì)胞凋亡可以用。PI單染出現(xiàn)在Q2和Q4區(qū)，PI單染的半數(shù)細(xì)胞凋亡可以用。在不同的MOI感染組中，隨著病毒感染BGC-823細(xì)胞的時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞發(fā)生死亡越來(lái)越多。細(xì)胞死亡率等于細(xì)胞凋亡率加上細(xì)胞壞死率。如圖6、7、8所示，Control組中，24 h，48 h，72 h對(duì)應(yīng)的死亡率分別是5.8±0.2%，6.3±3.1%，8.4±0.7%。死亡率增加的不明顯，幾乎沒(méi)有變化。在MOI=0.01組中，24 h，48 h，72 h對(duì)應(yīng)的死亡率分別是5.3±1.1%，26.3± 1.3%，50.1±3.1%。隨著病毒感染細(xì)胞時(shí)間的增長(zhǎng)，BGC-823細(xì)胞的死亡率明顯增加。在72 h死亡率達(dá)到最高，為50.1±3.1%。在MOI=0.1組中，24 h，48 h，72 h對(duì)應(yīng)的死亡率分別是14.9±0.3%，58.4±3.9%，74±3.5%。隨著病毒感染細(xì)胞時(shí)間的增長(zhǎng)，BGC-823細(xì)胞的死亡率明顯增加，在72 h時(shí)，細(xì)胞的死亡率已經(jīng)達(dá)到74±3.5%。在MOI=1組中，24 h，48 h，72 h對(duì)應(yīng)的死亡率分別是18.1±1.5%，74±2.6%，79±8.2%。隨著病毒感染細(xì)胞時(shí)間的增長(zhǎng)，BGC-823細(xì)胞的死亡率明顯增加，在72 h時(shí)，細(xì)胞死亡率已經(jīng)達(dá)到79± 8.2%。如圖9所示，在24 h組中，隨著MOI值的增加，細(xì)胞的死亡率也增加。在48 h組中，細(xì)胞的死亡率也隨著MOI值的增大而增加。在72 h組中，細(xì)胞的死亡率也隨著MOI值的增大而增加。MOI值越大，細(xì)胞發(fā)生死亡越快，越多。

圖5 流式未染色組、Annexin V-FITC單染和PI單染組Fig.5The control group，the Annexin V-FITC single staining and PI single staining

圖6 BGC-823細(xì)胞流式圖Fig.6The BGC-823 cell flow chart

NDV-D90處理BGC-823細(xì)胞以不同的MOI值感染時(shí)間為24 h，PI和Annexin-V雙染法FACS檢測(cè)細(xì)胞死亡率。

NDV-D90處理BGC-823細(xì)胞以不同的MOI值感染時(shí)間為48 h，PI和Annexin-V雙染法FACS檢測(cè)細(xì)胞死亡率。

NDV-D90處理BGC-823細(xì)胞以不同的MOI值感染時(shí)間為72 h，PI和Annexin-V雙染法FACS檢測(cè)細(xì)胞死亡率。

圖7 BGC-823細(xì)胞流式圖Fig.7The BGC-823 cell flow chart

圖8 BGC-823細(xì)胞流式圖Fig.8The BGC-823 cell flow chart

3 討論

新城疫病毒是溶瘤病毒的成員之一，新城疫病毒具有抑瘤效果首次報(bào)道于1955年。從此，對(duì)新城疫病毒抑制腫瘤的研究越來(lái)越多。新城疫病毒有多種不同的毒株，不同的新城疫毒株具有不同的溶瘤效果。溶瘤型的新城疫毒株有MTH68/H、PV-701和73-T，非溶瘤型的新城疫毒株有Ulster，弱毒株HUJ[28]。其中MTH68/H和PV-701已經(jīng)應(yīng)用到了臨床Ⅰ期。

圖9 BGC-823細(xì)胞死亡率與感染時(shí)間的關(guān)系Fig.9Relationship of BGC-823 cell death rate and infection time

NDV-D90毒株是新分離出來(lái)的溶瘤病毒，符芳等證明NDV-D90對(duì)肺癌A549細(xì)胞有很好的抑制能力[24-25]。NDV-D90能使BGC-823細(xì)胞產(chǎn)生合胞體結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)明顯的CPE。NDV-D90可在BGC-823細(xì)胞中大量增殖，病毒的最高滴度達(dá)到1010TCID50/0.1 mL。NDV-D90對(duì)BGC-823細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，病毒感染時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率越低。細(xì)胞的最低存活率達(dá)到18.5%。MOI越大，細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的越快，細(xì)胞的存活率越低。在MOI為10時(shí)，BGC-823細(xì)胞一直處于抑制生長(zhǎng)狀態(tài)，逐漸開(kāi)始凋亡。MOI為0.01時(shí)，細(xì)胞剛開(kāi)始出現(xiàn)了少量增長(zhǎng)，然后出現(xiàn)了凋亡，并且與MOI為10時(shí)的細(xì)胞存活率相等，說(shuō)明MOI值低的時(shí)候，病毒出現(xiàn)了大量復(fù)制，導(dǎo)致了低的MOI值也和高M(jìn)OI值有相似的殺傷力。這也間接地說(shuō)明了NDV-D90在BGC-823細(xì)胞復(fù)制能力很強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得細(xì)胞的最大凋亡率為80%左右，且細(xì)胞的凋亡率隨著MOI的增大和感染時(shí)間的增長(zhǎng)而變高，此結(jié)果與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。一般惡性腫瘤細(xì)胞具有侵襲轉(zhuǎn)移和遷移的能力。在侵襲轉(zhuǎn)移和遷移的過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶類（matrix metalloproteinases，MMPs）具有重要作用。MMPs能分解細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM），使細(xì)胞更容易從組織中轉(zhuǎn)移其他臟器及對(duì)周圍組織發(fā)生侵襲[29]。惡性腫瘤細(xì)胞能大量表達(dá)MMP-2和MMP-9，使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。在腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，在侵襲小室中加入人工的ECM，觀察BGC-823細(xì)胞能穿過(guò)侵襲小室8 μm孔的細(xì)胞數(shù)，來(lái)說(shuō)明NDV-D90對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制作用。經(jīng)NDV-D90處理的腫瘤與對(duì)照組相比，侵襲過(guò)8 μm孔的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。以上數(shù)據(jù)都說(shuō)明NDV-D90對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞具有高效的殺傷能力且能抑制BGC-823發(fā)生侵襲。

隨著科學(xué)的進(jìn)步，應(yīng)用新城疫治療腫瘤的方法主要分為三類：一是單獨(dú)使用NDV作為抗腫瘤試劑，如MTH68/H和PV-701。此種方法已經(jīng)應(yīng)用到了臨床Ⅰ期，初見(jiàn)成效。二是應(yīng)用NDV與化學(xué)藥物聯(lián)合治療，如紫杉醇等。這樣可以減少副作用和用藥成本[30]。三是以NDV為基因載體，表達(dá)外源基因。如IL-2，IL-6，IFN-β，TNF-α等。

4 結(jié)論

NDV-D90對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞系具有高效殺傷和抑制其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的能力。在未來(lái)，NDV-D90可能成為一種重要的溶瘤制劑，用于解除胃癌患者的困擾。

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The Inhibition Effect of Newcastle Disease Virus D90 Strain on Human Gastric Cancer Cell BGC-823 in Vivo

Li Kunpeng1，Sui Hong2，Chai Zheng3，Guo Dianlei3，Zhang Xueyun4，Wang Xiangling3，Li Xi3，Yu Liyun1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319；
2.Harbin Medical University Cancer Hospital；3.Harbin Veterinary Research Insitute，Chinese Academy of Agricultural Sciences；4.College of Life Science and Technology，Harbin Normal University）

In order to research the inhibition effect of the NDV-D90 on the cell BGC-823，the cytotoxicity test，tumor invasion assay and flow cytometry were performed.These studies showed that the strain NDV-D90 cells inhibited the replication and proliferation of BGC-823.The virus could replicate in the cell BGC-823.The NDV-90 mainly caused the BCG-823 necrosis and a small amount of apoptosis.

NDV D90 strain；Gastric cancer BGC-823 cell line；apoptosis；necrosis

S482

A

1002-2090（2017）01-0074-09

2015-11-16

黑龍江省自然科學(xué)基金（QC2012C011）。

李昆鵬（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

余麗蕓，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：xly_hou@yahoo.com.cn。