流速/溶劑雙梯度反相高效液相色譜法快速同時測定復(fù)方丹參片中7種有效成分

蘇草茵，余諾君，吳宏星，鄭艾妮，李 寧

( 廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511400)

流速/溶劑雙梯度反相高效液相色譜法快速同時測定復(fù)方丹參片中7種有效成分

蘇草茵，余諾君，吳宏星，鄭艾妮，李 寧*

( 廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511400)

采用整體柱建立了流速/溶劑雙梯度反相高效液相色譜法快速同時測定復(fù)方丹參片中三七皂苷 R1，人參皂苷 Rg1，Re，Rb1，Rd，Rb2及丹參酮ⅡA 7種有效成分。通過對溶劑和流速雙梯度體系的逐步優(yōu)化，并應(yīng)用色譜模擬軟件 DryLab，得到分離7種成分的最佳色譜條件。采用色譜柱Merck Chromolith Performance RP-18e(100 mm×4.6 mm)，以乙腈-水為流動相體系，流速/溶劑雙梯度洗脫，柱溫30 ℃；片劑中的7種成分在 21 min 內(nèi)達(dá)到基線分離；Rg1在 60.60～242.40 mg/L(r=0.999 0)、丹參酮ⅡA在16.52～66.08 mg/L(r=0.999 9)，其余皂苷在 30.70～142.66 mg/L(r≥0.999 4)范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；定量下限(S/N=10)為 21～124 μg/kg，回收率為 96.7%～100.1%。該方法能在短時間內(nèi)同時分離不同極性的化合物，提高被測物的柱效，減少半峰寬和拖尾，可應(yīng)用于復(fù)方丹參片中7種成分的含量分析。

流速/溶劑雙梯度；整體柱；高效液相色譜法；復(fù)方丹參片；DryLab

復(fù)方丹參片由丹參、三七以及冰片組成，主要用于治療冠心病、心絞痛，是目前我國心血管病臨床應(yīng)用最為廣泛的復(fù)方丹參制劑之一。研究表明，丹參的活性成分主要為二萜醌類脂溶性成分，具有抗氧化抗動脈粥樣硬化、降低心肌耗氧量等心血管作用及抗腫瘤作用[1]。三七皂苷具有擴張血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板凝集、延長凝血時間、降血脂、清除自由基、抗炎抗氧化等藥理作用[2]。因此，建立一種對復(fù)方丹參片中丹參和三七中多種活性成分的定量分析方法，有助于有效地控制復(fù)方丹參的質(zhì)量。

我國現(xiàn)行的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[3]采用高效液相色譜法(HPLC)對復(fù)方丹參片中的三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，以及丹參酮ⅡA 5種成分的含量進行測定，但方法繁瑣費時。另有文獻(xiàn)報道采用HPLC同時測定其中4種組分或1種組分[4-8]，亦有同時測定丹參及三七有效成分的報道[9-11]，但分析時間長、效率低。由于三七皂苷R1,人參皂苷Rg1,Re的極性很強，人參皂苷Rb1,Rd,Rb2為中等極性，而丹參酮ⅡA具有強疏水性，因此，很難在短時間內(nèi)采用HPLC進行有機溶劑/水等度或梯度洗脫。本文采用整體柱快速液相色譜法對上述7種組分進行了同時測定，在21 min內(nèi)達(dá)到基線分離。

整體柱在藥物分析中的應(yīng)用日漸廣泛，尤其在多組分藥物的分離測定方面顯示出巨大的優(yōu)勢[12-13]。整體柱擁有平均孔徑為2 μm的三維大孔網(wǎng)絡(luò)以及13 nm的中孔，孔隙率>80%，具有極佳的通透性，同時為待測組分在色譜分離過程中提供充足的比表面積。特殊的結(jié)構(gòu)使整體柱在高流速下仍保持較高柱效和較低柱壓[14]，因此，整體柱在用于溶劑梯度的同時還能實現(xiàn)流速梯度。流速/溶劑雙梯度法已在多組分樣品測定中得到應(yīng)用[15-16]，該方法的特點是改變流動相中有機相的比例，以達(dá)到調(diào)整被測物的分離選擇性；同時調(diào)節(jié)流速，使其保留時間大大縮短，并且得到較窄的峰形，以提高柱效。本文嘗試將有機相比例與流速雙變量應(yīng)用到等度與線性混合梯度中，并結(jié)合應(yīng)用色譜模擬軟件DryLab，逐步優(yōu)化分離參數(shù)，經(jīng)過色譜優(yōu)化參數(shù)(COF)評價，得到最佳的流速/溶劑雙梯度色譜的優(yōu)化模型，從而建立了一種能夠快速、可靠、準(zhǔn)確地檢測復(fù)方丹參片中7種有效成分的質(zhì)量控制方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品與試劑

日本Shimadzu高效液相色譜儀系統(tǒng)：包括LC-20 AB泵，SPD-20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站；ELGA超純水儀(威立雅水處理技術(shù)(上海)有限公司)；HS6150超聲波清洗器(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；FA1104A分析天平。

三七皂苷R1(純度99.9%)、人參皂苷Rg1(純度97.7%)、人參皂苷Re(純度99.9%)、人參皂苷Rb1(純度99.9%)、丹參酮ⅡA(純度99.9%)購于中國藥品生物制品檢定所；人參皂苷Rd(純度94.2%)、人參皂苷Rb2(純度93.8%)購于中國食品藥品檢定研究院；復(fù)方丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，規(guī)格：0.32 g/片)；實驗用水為色譜用超純水；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的制備 分別取真空干燥至恒重的三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd，Rb2，以及丹參酮ⅡA各10 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇超聲溶解，定容，搖勻，作為對照品儲備液。

混合對照溶液：分別精密吸取不同體積上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。

1.2.2 供試品溶液的制備 取復(fù)方丹參片15片，去除包衣后研細(xì)，精密稱取細(xì)粉1.0 g，置于100 mL具塞棕色瓶中，加入85%甲醇50 mL，密塞，精密稱定，超聲處理60 min，放冷，補足重量，搖勻后靜置10 min，過濾，取續(xù)濾液為供試品溶液。

陰性對照品溶液：按處方分別稱取除丹參以外的其余藥材及輔料，取除三七以外的其它藥材及輔料，按供試品溶液的制備方法，分別制成不含丹參、三七的陰性對照溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Merck Chromolith?Performance RP-18e(100 mm×4.6 mm)；流動相：A為乙腈，B為水；檢測波長：0～17 min，203 nm；17～21 min，270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速/有機溶劑雙梯度程序見表1。

表1 HPLC分離7種組分的流速/乙腈濃度雙梯度模式Table 1 Programs of the flow rate/acetonitrile content double-gradient modes for separation of seven test-compounds by HPLC

1.4 柱外體積的測定

死體積V0：在所用色譜系統(tǒng)條件下采用硝酸鉀水溶液進樣后測定保留時間,測得V0為1.69 mL；滯留體積VD：以二通管替代色譜柱，使用水流動相體系，以 0.3%的丙酮作為示蹤劑，以實際到達(dá)梯度1/2高度所運行的時間與設(shè)定梯度達(dá)到相應(yīng)位置的時間之差來計算[17],測得VD為 2.82 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 第一梯度流速/溶劑的優(yōu)化

2.1.1 第一梯度溶劑濃度的優(yōu)化 選擇初始流速為 1 mL·min-1，分別測定流動相乙腈濃度為 16%，17%，18%，19%，20%，21%時,Rg1和Re的保留時間(t)和保留因子(k)(見表2)。從表2可以得出，乙腈濃度不宜超過 20%，否則Rg1與Re的分離度小于 1.5，無法達(dá)到基線分離。而乙腈濃度為18%～19%時，Rg1和Re的保留因子k在 0.5～15范圍內(nèi)，且Rg1和Re可達(dá)到基線分離，因此實驗選擇乙腈濃度分別為18%，19%進行下一步流速優(yōu)化。

表2 不同乙腈濃度中測定Rg1與Re的保留時間和保留因子Table 2 Retention times and retention factors of Rg1 and Re obtained in different acetonitrile content

2.1.2 第一梯度洗脫流速的優(yōu)化 在溶劑濃度優(yōu)化的基礎(chǔ)上,選擇18%乙腈濃度為模式1，19%乙腈濃度為模式 2,考察流速分別為1.3，1.5，1.8，2.0，2.5，3.0，3.2 mL·min-1時，R1，Rg1及Re的保留因子的變化規(guī)律，結(jié)果見表3。

表3 不同模式下R1，Rg1，Re 的保留因子與流速的相關(guān)性Table 3 Calibration curve of R1，Rg1，Re in the different modes

在反相液相色譜中，待測組分的極性越強，保留越弱；極性越弱，保留越強。3種待測成分的極性大小分別為R1>Rg1>Re。從表 3 線性斜率結(jié)果可知，極性最強的R1隨著流速增大，保留因子變化較??；對于極性稍弱的Rg1和Re，流速增大，保留因子的變化也隨之增大。因此，可通過調(diào)整流速來改變被分離組分的峰間距，從而改變選擇性。模式1在所有考察的流速下，Rg1與Re的分離度均大于1.6，但隨著流速的增加，柱壓隨之增大，為保護色譜柱，選擇流速 3.2 mL·min-1作為模式1第一梯度流速。模式2考察的流速為2.0 mL· min-1時,Rg1與Re的分離度為1.47，無法達(dá)到基線分離；而當(dāng)流速為1.8 mL·min-1時，Rg1與Re的分離度為1.65。因此選擇2.0～1.8 mL·min-1之間的1.9 mL·min-1作為模式2第一梯度流速。

圖1 DryLab 模擬3.2 mL·min-1，32%乙腈下Rb1，Rd，Rb2的圖譜Fig.1 Chromatogram of Rb1，Rd，Rb2 by DryLab in 3.2 mL·min-1 and 32%acetonitrile

2.2 第二梯度流速/溶劑的優(yōu)化

選擇乙腈濃度為29%，30%，31%。分別測定在流速1.5，2.0，2.5，2.8，3.0，3.2 mL·min-1下Rb1，Rd，Rb2的保留時間以及峰面積。將所測得結(jié)果輸入DryLab 軟件，并由軟件模擬出洗脫3種待測物的圖譜以及相應(yīng)的色譜條件。模擬結(jié)果表明在流速為1.5，2.0，2.5，2.8，3.0，3.2 mL·min-1時，乙腈比例分別高于33.72%，32.83%，32.11%，31.75%，31.65%，31.40%時，均能使Rb1，Rd，Rb2在4 min內(nèi)完全洗脫。

盡管在多個不同的流速/溶劑范圍內(nèi)均可實現(xiàn)4 min內(nèi)完全洗脫3種待測組分。經(jīng)實驗驗證，發(fā)現(xiàn)乙腈比例超過32%時，該階段基線起伏不平，影響待測組分含量測定。這是由于前后兩階梯度變化率過大所造成的結(jié)果。為使Rb1，Rd和Rb2能快速、平穩(wěn)地洗脫，故選擇 3.2 mL·min-1，32%乙腈作為第二梯度的色譜條件。Drylab軟件模擬該條件下的圖譜見圖1。

2.3 第三梯度流速/溶劑的優(yōu)化

按照第二梯度模式的優(yōu)化方式，選擇乙腈濃度為60%，64%，68%，分別測定在流速1.5，2.0，2.5，3.0，3.2 mL·min-1下丹參酮ⅡA的保留時間以及峰面積。并將所測得結(jié)果輸入DryLab 軟件，由軟件模擬出洗脫丹參酮ⅡA的色譜圖以及相應(yīng)的色譜條件，模擬結(jié)果表明在流速為1.5，2.0，2.5，3.0，3.2 mL·min-1時，乙腈比例分別高于92.0%，81.6%，73.9%，70.7%，69.4%均能使丹參酮ⅡA在2 min內(nèi)完全洗脫。但實驗驗證時發(fā)現(xiàn)，乙腈比例不宜超過70%，否則待測樣品丹參酮ⅡA主峰無法與相鄰雜峰達(dá)到基線分離。為達(dá)到快速洗脫并減少干擾的目的，故選擇流速3.2 mL·min-1的70%乙腈作為第三梯度的色譜條件。

2.4 滯后時間的修正

表4 滯留體積與修正時間Table 4 Dwell time and corrected time

實驗所用的液相設(shè)備滯后體積2.82 mL。梯度洗脫時，增加的VD相當(dāng)于在梯度開始時增加的等度延遲，使峰間距和樣品組分的分離度發(fā)生變化，而變化量與滯留時間有關(guān)。梯度洗脫實際起始時間應(yīng)為扣除滯留影響后的時間。滯留時間可由下式求得:tD=VD/F。因此，各階段之間的梯度起始時間應(yīng)修正提前，結(jié)果見表4。由表4可知，第一梯度若采用Mode 1進行洗脫，應(yīng)扣除滯后時間0.88 min，修正為7.39 min進行第二梯度洗脫；若采用Mode 2進行洗脫，則應(yīng)扣除滯后時間1.48 min，修正為7.35 min進行第二梯度洗脫。同理，第三梯度的實際起始洗脫時間應(yīng)修正為扣除滯后時間0.88 min后的14.03 min。

2.5 流速/乙腈濃度雙梯度優(yōu)化分離模式的確定

綜合各梯度流速/乙腈濃度的優(yōu)化，可得出兩種分離模式下的結(jié)果，相關(guān)色譜圖見圖2。

2.6 方法學(xué)研究及復(fù)方丹參片含量測定

采用最終優(yōu)化的模式 2,按 “1.3 ”色譜條件進行方法學(xué)研究及片劑的含量測定。首先注入混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，進行系統(tǒng)適用性試驗，記錄色譜圖，供試品結(jié)果見圖2 Mode 2，其余結(jié)果見圖3。理論塔板數(shù)按三七皂苷R1計算不低于4 500，7種待測物的拖尾因子不大于2，分離度均大于1.5，主峰峰面積的重復(fù)性RSD 均小于2%，陰性對照溶液未見干擾。

通過精密吸取不同體積的工作對照品溶液進行測定,以峰面積(y)對進樣質(zhì)量(x,μg)進行線性回歸,求得7種待測物的線性方程;根據(jù)樣品信號與噪音信號比(S/N)為10 計算定量下限(LOQ)為0.021～0.124 μg/kg；稱取供試品0.5 g( 精確至0.001 g)至50 mL棕色量瓶中，加入混合對照品溶液適量，配制低、中、高3個質(zhì)量濃度，按“1.2.2”方法平行制備6份樣品溶液，按“1.3”條件測定分析，分別得出7種待測組分的平均加樣回收率96.7%～100.1%(表 5)，RSD(n=6)為0.63%～1.4%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

CompoundSlopeInterceptrLinearrange(mg·L-1)LOQ(μg·kg-1)Recovery(%)Content(mg/pcs)NotoginsenosideR1-31765 75422035 540 999432 73～130 910 10197 20 429GinsenosideRg14940 33178135 420 999060 60～242 400 12499 13 925GinsenosideRe-1187 89225681 190 999631 47～125 870 02498 20 434GinsenosideRb18580 67246280 500 999935 66～142 660 115100 11 016GinsenosideRd765 3877527 20 999833 79～135 170 10498 30 185GinsenosideRb21480 86194712 850 999630 70～122 790 10897 50 315TanshinoneⅡA-1836 781 820 999916 52～66 080 02196 70 302

3 結(jié) 論

建立了一種流速/溶劑雙梯度反相高效液相色譜同時測定復(fù)方丹參片中三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd，Rb2，以及丹參酮ⅡA 7種有效成分的分析方法。通過考察不同流速/乙腈比例雙梯度模式下的分離效果，并結(jié)合應(yīng)用色譜模擬軟件 DryLab，減少了實驗次數(shù)，確定了最佳的流速/乙腈比例雙梯度模式。應(yīng)用優(yōu)化的色譜條件能同時分離復(fù)方丹參片中的7種成分，且在21 min內(nèi)能達(dá)到基線分離。該方法可以同時分離強極性、中等極性以及脂溶性化合物，并能提高被測物的柱效，減少半峰寬和拖尾，從而為復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制提供了一種準(zhǔn)確可行的方法。

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Rapid and Simultaneous Determination of Seven Active Components in Compound Salvia Miltiorrhiza Bunge Tablets by Flow Rate/Organic Solvent Double-gradient High Performance Liquid Chromatography

SU Cao-yin,YU Nuo-jun,WU Hong-xing,ZHENG Ai-ni,LI Ning*

(College of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 511400,China)

A flow rate/organic solvent double-gradient mode in reversed-phase high performance liquid chromatography(HPLC) by using monolithic column was established as a new approach for the rapid and simultaneous determination of notoginsenoide R1,ginsenosides Rg1,Re,Rb1,Rd,Rb2and tanshinone ⅡA in compound Salvia miltiorrhiza bunge tablets.Through the optimization of the flow rate/organic solvent double-gradient mode,and combination with chromatographic simulation software DryLab,the optimized double-gradient HPLC system for the seven active components was built.The determination was carried out on a Merck Chromolith Performance RP-18e(100 mm×4.6 mm) column using acetonitrile-water as mobile phase at a column temperature of 30 ℃.The separation of seven active components in the tablets was achieved in 21 min.The linear ranges were 60.60-242.40 mg/L(r=0.999 0) for Rg1,16.52-66.08 mg/L(r=0.999 9) for tanshinone ⅡA，and 30.70-142.66 mg/L(r≥0.999 4) for the other active components.The LOQs(S/N=10) were in the range of 21-124 μg/kg and the mean recoveries were 96.7%-100.1%.The method could be used for the simultaneous determination of different polarity compounds in a short time.It also could improve the column efficiency of the analytes,compress the half-peak width and reduce the trailing.Therefore,the method could be used for the rapid and simultaneous determination of the seven active components in compound Salvia miltiorrhiza bunge tablets.

flow rate/organic solvent double-gradient;monolithic column;high performance liquid chromatography(HPLC);compound Salvia miltiorrhiza bunge tablets;DryLab

2016-08-24；

2016-09-21

國家自然科學(xué)基金資助項目(81173525)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.010

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2017)02-0212-06

*通訊作者：李 寧，教授，研究方向：色譜新方法及藥物質(zhì)量控制，Tel:020-39352136，E-mail:13724117338@163.com