玳玳果降脂提取物中大孔吸附樹脂有機(jī)殘留量的頂空氣相色譜分析研究

馬國(guó)萍， 陳 丹， 黃 群， 謝 平， 朱仙慕， 黃 嬌， 查珍珍

玳玳(CitrusaurantiumL.vardaidaiTanaka)屬蕓香科柑桔亞屬植物，為酸橙的變種，藥食同源。玳玳性微寒，味苦、酸，具有疏肝和胃、理氣止痛、行氣寬中、消食化痰之功效[1-2]。課題組前期研究表明，閩產(chǎn)玳玳果中含有黃酮、生物堿、揮發(fā)油等化學(xué)成分[3-5]，采用已獲國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)的工藝制備的玳玳果黃酮有效部位玳玳果黃酮降脂提取物具有良好的降脂抗氧化作用，提取物總黃酮含量>80%；玳玳果黃酮降脂提取物的純化工藝運(yùn)用了AB-8大孔吸附樹脂分離[6-10]。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)大孔樹脂最新規(guī)定，凡在生產(chǎn)工藝中使用過(guò)大孔吸附樹脂的制劑或原料，應(yīng)對(duì)其可能引入的單體(苯乙烯)、交聯(lián)劑(二苯乙烯)及致孔劑(烴類)等控制其殘留量。因此，為確保產(chǎn)品玳玳果降脂提取物的質(zhì)量安全穩(wěn)定，本研究擬建立玳玳果降脂提取物中檢測(cè)大孔吸附樹脂6種有機(jī)殘留物苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯、苯乙烯、正己烷的頂空氣相色譜法，并在已建立的色譜條件下，檢定3批玳玳果降脂提取物大孔樹脂的有機(jī)溶劑殘留量，為完善玳玳果降脂提取物質(zhì)量控制方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 氣相色譜儀(Agilent 6890N)，氫火焰檢測(cè)器(FID，Agilent 6890N)，Agilent 6890N色譜工作站均為美國(guó)安捷倫科技公司。

1.1.2試藥 苯乙烯對(duì)照品(standard for GC，>99.5%,上海麥克林生化科技有限公司)；二乙烯苯對(duì)照品(≥99.5%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；苯對(duì)照品(≥99.5%)、甲苯對(duì)照品(≥99.5%)、二甲苯對(duì)照品(≥99.5%)，均為上海聯(lián)試化工試劑有限公司；正己烷對(duì)照品(≥98.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；雙蒸水(自制)；玳玳果降脂提取物(自制，批號(hào)20170324，20170325，20170326)。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 頂空進(jìn)樣系統(tǒng)程序升溫法；色譜柱DB-WAX石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID檢測(cè)器，溫度230 ℃，進(jìn)樣口溫度210 ℃；程序升溫：柱溫在70 ℃維持8 min，再以10 ℃/min的升溫速率升至160 ℃，再以30 ℃/min的速率，繼續(xù)升溫至220 ℃，恒溫3 min；以氮?dú)鉃檩d氣，流速為3.0 mL/min；尾吹氣50 mL/min；空氣300 mL/min；氫氣30 mL/min；進(jìn)樣量50 μL，不分流進(jìn)樣；頂空平衡溫度90 ℃，平衡時(shí)間30 min。在上述色譜條件下，檢測(cè)苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷各成分是否分離完全。

1.2.2供試品溶液的制備 精密稱取玳玳果降脂提取物粉末約0.8 g，置20 mL頂空瓶中，精密加入2.0 mL DMF溶解，密封瓶口，搖勻，即得。

1.2.3混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱定苯乙烯、二乙烯苯、苯、甲苯、二甲苯、正己烷對(duì)照品適量，分別放置于10 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(苯8.297 mg/mL,甲苯58.715 mg/mL，二甲苯66.484 mg/mL，正己烷53.665 mg/mL，苯乙烯47.077 mg/mL，二乙烯苯114.448 mg/mL)。

分別精密吸取苯乙烯對(duì)照品儲(chǔ)備液3.0 mL，二乙烯苯對(duì)照品儲(chǔ)備液8.0 mL，苯對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0 mL，甲苯對(duì)照品儲(chǔ)備液3.0 mL，二甲苯對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL，正己烷對(duì)照品儲(chǔ)備液6.5 mL，于50 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，再?gòu)闹芯芪?90 μL，于25 mL量瓶中加DMF稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液185，300，600，900，1 200，1 500，1 800 μL，放置于5 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，并分別精密量取2.0 mL置于20 mL頂空瓶中，密封瓶口，搖勻，測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X(μg/mL)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5檢測(cè)限(limit of detection, LOD)及定量限(limit of quantitation, LOQ)考察 將苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷各對(duì)照品儲(chǔ)備液分別逐步稀釋，按照對(duì)照品溶液色譜圖中的各成分峰高折算，直到檢測(cè)峰高為基線噪聲的3 倍左右為止(即S/N=3)，計(jì)算各個(gè)成分的最低檢測(cè)限。當(dāng)檢測(cè)峰高為基線噪聲的10 倍左右(即S/N=10)，計(jì)算各成分的最低定量限。

1.2.6精密度試驗(yàn) 分別精密量取同一份混合對(duì)照品溶液2 mL，共6 份(每1 mL含正己烷0.598 μg，苯0.924 μg，甲苯4.904 μg，二甲苯4.627 μg，苯乙烯3.932 μg，二乙烯苯25.490 μg)，置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，密封瓶口，搖勻，按1.2.1項(xiàng)方法操作，測(cè)定，記錄各個(gè)有機(jī)殘留溶劑的峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批(批號(hào)20170324)的玳玳果降脂提取物粉末約0.8 g，6 份，按1.2.2及1.2.1項(xiàng)方法操作，檢測(cè)各有機(jī)殘留組分，計(jì)算含量及RSD值。

1.2.8加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取同一批(批號(hào)20170324)已知含量的玳玳果降脂提取物粉末約0.4 g，共6 份，加入混合對(duì)照品溶液(每1 mL含正己烷1.809 μg；苯0.732 μg；甲苯4.781 μg；二甲苯4.237 μg；苯乙烯4.926 μg；二乙烯苯58.60 μg)2.0 mL，按1.2.2及1.2.1項(xiàng)方法操作，測(cè)定，記錄各有機(jī)殘留溶劑的峰面積，計(jì)算各有機(jī)溶劑的平均回收率。

1.2.9樣品測(cè)定 取3批玳玳果降脂提取物(批號(hào)20170324，20170325，20170326)，分別精密稱取玳玳果降脂提取物粉末約0.8 g，每批3 份，按1.2.2及1.2.1項(xiàng)方法操作，測(cè)定，計(jì)算各批大孔吸附樹脂有機(jī)殘留量。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系考察 大孔吸附樹脂各殘留有機(jī)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1，圖1。結(jié)果表明，大孔吸附樹脂各殘留有機(jī)溶劑在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

A:正己烷； B:苯； C:甲苯； D:二甲苯； E:苯乙烯； F:二乙烯苯.圖1 大孔吸附樹脂各殘留有機(jī)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 1 Standard curves of residual organic solvents in macroporous adsorption resins

2.2LOD及LOQ考察 各個(gè)成分的最低LOD分別為苯6.26 ng(S/N=3.3)，甲苯14.74 ng(S/N=3.6)，二甲苯14.63 ng(S/N=2.5)，苯乙烯25.26 ng(S/N=3.8)，二乙烯苯190.61 ng(S/N=2.9)，正己烷93.44 ng(S/N=3.1)。

各成分的最低LOD分別為苯12.53 ng(S/N=11.6)，甲苯59.25 ng(S/N=12.8)，二甲苯58.37 ng(S/N=11.5)，苯乙烯50.25 ng(S/N=10.4)，二乙烯苯383.53 ng(S/N=9.4)，正己烷124.58 ng(S/N=10.2)。

2.3精密度試驗(yàn) 同一份混合對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定各有機(jī)殘留溶劑的峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4.21%～6.47%，均<10.0%，精密度符合要求(表2)。

2.4重復(fù)性試驗(yàn) 以正己烷殘留組分量為檢測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，測(cè)得其平均含量0.006 589%(RSD=2.52%，n=6)，方法重復(fù)性良好(表3)。

表1 殘留有機(jī)溶劑含量測(cè)定線性范圍及回歸方程

表2 各有機(jī)殘留組分精密度試驗(yàn)峰面積結(jié)果

表3 有機(jī)殘留組分重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5加樣回收率試驗(yàn) 建立的玳玳果降脂提取物中大孔吸附樹脂6 種有機(jī)殘留物苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯、苯乙烯、正己烷含量測(cè)定方法，準(zhǔn)確度良好。結(jié)果表明，各殘留有機(jī)溶劑加樣回收率均符合《中國(guó)藥典》(2015年版)四部對(duì)殘留溶劑測(cè)定法項(xiàng)下的規(guī)定，即RSD不大于10%的要求[11](表4)。

2.6樣品測(cè)定 3批玳玳果降脂提取物樣品中均檢測(cè)出正己烷成分，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.000 693%，0.000 671%和0.000 687%，均符合《中國(guó)藥典》(2015年版)四部殘留溶劑測(cè)定法項(xiàng)下正己烷殘留限度不得超過(guò)0.029%的規(guī)定[11]，未檢出苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等(表5，圖2)。

3 討 論

大孔吸附樹脂技術(shù)在中藥分離純化中起著重要的作用，樹脂表面和孔隙中未聚合的單體(苯乙烯)、交聯(lián)劑(二乙烯苯)及致孔劑(烴類)，在生產(chǎn)過(guò)程中被帶入藥品中會(huì)影響藥品和食品的安全性。ICH(藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求)規(guī)定溶劑殘留限度苯為不得超過(guò)0.000 2%，甲苯0.089%，二甲苯0.217%，正己烷0.029%，對(duì)苯乙烯、二乙烯苯未明確[12]。參考國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《大孔吸附樹脂分離純化中藥提取液的技術(shù)要求(暫行)》及補(bǔ)充說(shuō)明，將殘留物的限度定為每克樣品含苯不得超過(guò)2 μg，含正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯均不得超過(guò)20 μg。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 樣品測(cè)定結(jié)果

A:對(duì)照品溶液； B:空白溶液； C:樣品溶液. 1:正已烷； 2:苯； 3:甲苯； 4:二甲苯； 5:苯乙烯； 6:二乙烯苯； 7:N,N-二甲基甲酰胺.圖2 玳玳果降脂提取物樹脂殘留物氣相色譜圖Fig 2 Resin residue gas chromatogram

頂空氣相色譜法采用氣體直接進(jìn)樣的方式，無(wú)需有機(jī)溶劑提取，從而避免了在直接液體或固體取樣時(shí)，復(fù)雜樣品基體成分一起被帶入分析系統(tǒng)的可能性，由此消除了由基體成分的帶入而對(duì)樣品中可揮發(fā)性成分分析所造成的影響和干擾，對(duì)色譜柱污染小，得到的譜圖簡(jiǎn)單。實(shí)驗(yàn)采用頂空氣相色譜法檢測(cè)玳玳果降脂提取物大孔吸附樹脂有機(jī)殘留物，結(jié)果表明，該提取物中均未檢出苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等有機(jī)溶劑，檢測(cè)出的正己烷的殘留量不超過(guò)0.029%，均符合要求。因此，采用課題組已獲國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)的方法以AB-8大孔吸附樹脂純化制備玳玳果降脂提取物工藝是安全的。

二甲苯、二乙烯苯是性質(zhì)不穩(wěn)定容易發(fā)生聚合的復(fù)雜混合物，在色譜圖中可表現(xiàn)有3,6個(gè)色譜峰，分別為其各自鄰、間、對(duì)位異構(gòu)體的色譜峰。因無(wú)法得到其單一成分的對(duì)照品，所以在實(shí)驗(yàn)中以其相應(yīng)峰面積和定量，并以其中含量最大組分的LOD作為各自的LOD。大孔吸附樹脂殘留溶劑允許限度較低，實(shí)驗(yàn)中配制的對(duì)照品溶液濃度較低，建立的玳玳果降脂提取物大孔吸附樹脂有機(jī)殘留量檢測(cè)方法在精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及加樣回收率試驗(yàn)等方法學(xué)考察結(jié)果，均符合《中國(guó)藥典》(2015年版)四部對(duì)殘留溶劑測(cè)定法項(xiàng)下的規(guī)定，即RSD不大于10%的要求。

[1] 冉先德．中華藥海[M]．哈爾濱：哈爾濱出版社,1993：964．

[2] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)．中華本草(第4卷)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999：884.

[3] 陳 丹,劉永靜,黃劍鈞,等．閩產(chǎn)代代果中化學(xué)成分的分離分析[J]．福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,17(1)：18-20．

[4] Zeng L J,Chen D,Huang Q D,etal. Isolation of a new flavanone from Daidai fruit and hypolipidemic activity of total flavonoids extracts[J].NaturalProductResearch, 2015,29(16):1521-1528.

[5] 曾令軍,陳 丹,鄭 利,等．玳玳黃酮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]．中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2013,14(5)：337-341．

[6] 陳 丹,劉永靜．一種玳玳果總黃酮有效部位的制備方法:中國(guó),CN201010556341[P].2011-5-18.

[7] 曾華平,陳 丹,林伊莉,等．玳玳果總黃酮提取物純化工藝的再優(yōu)化[J]．中國(guó)中醫(yī)藥科技,2015,22(5)：517-519．

[8] 邱紅鑫,陳 丹,劉永靜,等．玳玳果黃酮滴丸對(duì)高脂血癥大鼠的降血脂作用研究[J]．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2011,28(7)：597-601．

[9] 劉永靜,陳 丹,邱紅鑫,等．玳玳黃酮有效部位提取物降血脂作用的研究[J]．中國(guó)中醫(yī)藥科技,2013,20(6)：622-623．

[10] 劉永靜,陳 丹,邱紅鑫,等．玳玳果總黃酮體外抗氧化作用的研究(英文)[J]．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2012,29(2)：97-101．

[11] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(四部)殘留溶劑測(cè)定法[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015：105-109．

[12] 周海鈞．藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求安全性部分[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社,2010：343．