SFPQ在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其對BEL-7402細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

莊雄標(biāo)， 陳淑珍， 黎豐華， 劉獻(xiàn)棠， 吳印愛, 王志偉

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是我國常見的惡性腫瘤，其中85%～90%為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1-2]。雖然目前HCC的治療方法較多，但5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)75%～100%[3]。研究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的可用于預(yù)測HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和靶向治療的標(biāo)志物，具有重要意義。

脯氨酸、谷氨酰胺剪接因子(splicing factor proline and glutamine rich, SFPQ)，又名多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein，PTB)相關(guān)剪接因子(PTB-associated splicing factor，PSF)，是果蠅行為/人類剪切(drosophila behavior human splicing，DBHS)蛋白家族的一員，它與剪接調(diào)控蛋白PTB一起，參與前體mRNA的剪接過程，并因此得名[4]。然而，SFPQ蛋白的功能不盡于此。研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分SFPQ蛋白定位于細(xì)胞核漿，不與PTB結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA鏈的解旋和配對中發(fā)揮重要作用[5]。同時(shí)，SFPQ蛋白參與構(gòu)成一種目前功能未知的結(jié)構(gòu)Paraspeckles[6-7]。此外，SFPQ還參與了腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[8-9]。在增殖期細(xì)胞，SFPQ的表達(dá)較靜止期細(xì)胞提高兩倍[8]。在前列腺癌組織中，SFPQ蛋白的表達(dá)較癌旁組織下調(diào)，其低表達(dá)與前列腺癌的進(jìn)展顯著相關(guān)[10]。而在結(jié)直腸癌中，雖然SFPQ參與結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移進(jìn)程，但與癌旁組織相比，其在癌組織中的表達(dá)并無顯著改變[11]。

本研究擬通過免疫組織化學(xué)染色檢測SFPQ蛋白在HCC患者癌與癌旁組織中的表達(dá)，并利用Oncolnc數(shù)據(jù)庫分析SFPQ在HCC患者預(yù)后判斷中的價(jià)值。同時(shí)通過小干擾RNA技術(shù)體外敲低SFPQ在肝癌細(xì)胞株BEL-7402中的表達(dá)，探討SFPQ對肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲、EMT等生物學(xué)特性的影響及其在HCC發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本 組織標(biāo)本來自2013—2016年筆者醫(yī)院普通外科行HCC根治性切除術(shù)的30名患者，所有患者術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。癌組織為距病灶邊緣<1 cm的組織，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為HCC;癌旁組織為腫瘤邊緣>2 cm的組織。

1.1.2試劑 SFPQ兔多克隆抗體(貨號(hào)：15585-1-AP，美國 Proteintech 公司)；檸檬酸抗原修復(fù)液(貨號(hào)：ZLI-9065，北京中杉金橋公司)、免疫組織化學(xué)一步法檢測系統(tǒng)(貨號(hào)：PV-6000，北京中杉金橋公司)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(貨號(hào)：ZLI-9018，北京中杉金橋公司)；RNAiso試劑(貨號(hào)：9180)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A)和熒光定量PCR試劑盒(RR420A)(日本Takara公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào)：11668-019，美國Invitrogen公司)；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：12100046，美國Gibco公司)、胎牛血清(貨號(hào)：10270160，美國Gibco公司)；CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(貨號(hào)：BB4202，南京貝博公司)；Matrigel基質(zhì)膠(貨號(hào)：356234，美國Cornirng公司)、Transwell培養(yǎng)板(貨號(hào)：3415，美國Cornirng公司)；結(jié)晶紫粉末(C6158，美國 Sigma 公司)；E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail和GAPDH 兔多克隆抗體(貨號(hào)：A3044，A3045，A5544，A2666，AC001，美國Abclonal公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(貨號(hào)：D110058，上海生工公司)。

1.1.3儀器 LightCycler 480 II System(5015278001型，瑞士Roche公司)；Western-blot蛋白檢測系統(tǒng)(1645050型，美國Bio-rad公司)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測SFPQ蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá) 石蠟標(biāo)本制作成4 μm厚度切片，常規(guī)烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，微波修復(fù)10 min，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶15 min，4 ℃過夜孵育一抗(1∶200)，次日經(jīng)PBS充分洗滌，孵育二抗30 min，DAB鏡下顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，氨水返藍(lán)后常規(guī)封片。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：按著色強(qiáng)度將無著色、輕度著色、中度著色及深度著色記為0，1，2和3分；按陽性肝癌細(xì)胞占總肝癌細(xì)胞比例，將0%，1%～25%，26%～50%，51%～75%%及≥76%記為0，1，2，3及4分；兩者的乘積代表組織SFPQ蛋白的表達(dá)水平，總分為0～12分[12]。

1.2.2OncoLnc數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線生存分析 利用OncoLnc數(shù)據(jù)庫(http://www.oncolnc.org/)中的HCC數(shù)據(jù)集，按照推薦設(shè)置(Top33%：Bottom33%)進(jìn)行不同SFPQ表達(dá)水平患者間的生存分析[13]。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞BEL-7402使用含10% 胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基，置于含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的CO2、37 ℃飽和濕度環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。siRNA轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞委托上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成siRNA序列，分別為：

siRNA-1 sense：GCAAAGGATTCGGATTTAT

antisense：GCAGGATTCGGATTAATAT

siRNA-2 sense：CCTTTCTGTTCGTAATCTT

antisense：CCTCTGTTCGTAATTTCTT

陰性對照 sense：CCAGCAGCAAGAAAGGCAT

antisense：CCAACGAAAGAGGACGCAT

轉(zhuǎn)染前1天將對數(shù)生長期的BEL7402細(xì)胞按照每孔4×105接種至6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至融合度達(dá)60%～70%，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)設(shè)置分為：空白組(Blank)，陰性對照組(negative control，NC)，siRNA-1組(KD1)及siRNA-2組(KD2)。

1.2.4熒光定量PCR法驗(yàn)證SFPQ低表達(dá)細(xì)胞模型 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，按照RNAiso試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，以所提取的總RNA為模板按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用 SYBR Green I 法進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，30 s→變性95 ℃，5 s→退火60 ℃，30 s，變性和退火共45個(gè)循環(huán)，溶解曲線和降溫條件按照說明書進(jìn)行設(shè)置。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成，SFPQ序列為：

forward：5′-TGGCTGAAATTGCCAAAGCC-3′

reverse：5′-GGCGCAAAAGATTTGCCTGA-3′

以GAPDH為內(nèi)參，序列為：

forward：5′- CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′

reverse：5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′

1.2.5CCK8法檢測SFPQ表達(dá)敲低后BEL-7402細(xì)胞增殖能力的變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，按每孔1×103接種于96孔板，分別在0，24，48，72，96 h加入10 μL CCK8試劑，37 ℃孵育2 h，選擇450 nm波長測定吸光度，繪制生長曲線。

1.2.6Transwell法檢測SFPQ表達(dá)敲低后BEL-7402細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化

1.2.6.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集并以無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照每孔5×104接種于Transwell 上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫染色著色25 min，取出小室，用棉簽輕柔拭去小室內(nèi)側(cè)膜細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照記錄。

1.2.6.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 提前以50 μL 10% Matrigel基質(zhì)膠包被小室，余方法同上。

1.2.7Western-blot檢測SFPQ表達(dá)敲低后BEL-7402細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，RIPA法提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白經(jīng)變性后，取30 μg進(jìn)行10% SDS-PAGE 蛋白電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉非特異性抗原，加入SFPQ(1∶500)，E-Cadherin(1∶1 000)，N-Cadherin(1∶1 000)，Vimentin(1∶1 000)，Snail(1∶1 000)和 GAPDH(1∶2 000)等抗體工作液，置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日，PBST洗滌3遍，分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。PBST洗滌3遍后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯像并拍照記錄。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用Student’st檢驗(yàn)比較癌組織和癌旁組織SFPQ蛋白的染色評(píng)分；多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05，采用雙側(cè)性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HCC組織 SFPQ蛋白的表達(dá)特點(diǎn) SFPQ蛋白表達(dá)主要定位于肝細(xì)胞細(xì)胞核，表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕褐色染色(圖1)。根據(jù)組織化學(xué)染色評(píng)分方法，癌組織評(píng)分(5.37±0.64)明顯高于癌旁組織[(3.27±0.43)，P<0.01，圖2]，說明SFPQ蛋白高表達(dá)于HCC組織。

SFPQ:脯氨酸、谷氨酰胺剪接因子. A:評(píng)分12分；B:評(píng)分0分.圖1 SFPQ蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)( ×400)Fig 1 Expression of SFPQ protein in HCC tissues( ×400)

SFPQ:脯氨酸、谷氨酰胺剪接因子.圖2 30例肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織SFPQ蛋白免疫組織化學(xué)染色評(píng)分Fig 2 IHC score of 30 paires of HCC tissues and adjacent tissues

2.2SFPQ的表達(dá)量和HCC患者預(yù)后的關(guān)系 OncoLnc數(shù)據(jù)庫HCC數(shù)據(jù)集包含360名患者的總生存數(shù)據(jù)，在線生存分析表明，SFPQ表達(dá)水平與患者預(yù)后有顯著相關(guān)性，SFPQ高表達(dá)組(Top33%，n=118)的生存期較低表達(dá)組(Bottom33%，n=118)顯著縮短(圖2，P<0.001)，提示SFPQ可能是HCC患者的預(yù)后不良因素。

SFPQ:脯氨酸、谷氨酰胺剪接因子.圖3 SFPQ表達(dá)量和肝細(xì)胞癌患者總生存時(shí)間的關(guān)系Fig 3 Relationship between SFPQ expression and overall survival of HCC patiens

2.3SFPQ-siRNA對BEL-7402細(xì)胞中SFPQ表達(dá)水平的影響 熒光定量PCR結(jié)果顯示，與Blank組比較，KD1和KD2組SFPQ mRNA表達(dá)水平均呈明顯下調(diào)(圖3A，P<0.05)，Western-blot 進(jìn)一步證實(shí)SFPQ蛋白的表達(dá)水平也明顯下調(diào)(圖3B)，說明兩對siRNA序列均有理想的基因敲低作用，SFPQ低表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

Blank:空白組； NC：陰性對照組； KD1：siRNA1組； KD2：siRNA2組. A:mRNA水平； B:蛋白水平. △：與Blank組比較，P<0.01.圖4 siRNA對BEL-7402 細(xì)胞中SFPQ表達(dá)量的敲低效果Fig 4 Expression of SFPQ in BEL-7402 was knocked down by siRNA

2.4敲低SFPQ表達(dá)對BEL-7402細(xì)胞增殖能力的影響 生長曲線表明，KD1和KD2組細(xì)胞的生長速度均較Blank組明顯減慢(P<0.05,圖5)，提示敲低SFPQ表達(dá)抑制BEL-7402細(xì)胞的增殖能力。

2.5敲低SFPQ表達(dá)對BEL-7402細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KD1和KD2組穿膜細(xì)胞數(shù)均較Blank組顯著減少(P<0.05)，其中KD1組穿膜細(xì)胞數(shù)為(110.6±10.9)，KD2組為(104.0±10.6)，NC組為(227.4±26.6)，Blank組為(239.2±45.2)；侵襲實(shí)

Blank:空白組； NC：陰性對照組； KD1：siRNA1組； KD2：siRNA2組. 與Blank組比較，△:P<0.01.圖5 敲低SFPQ表達(dá)后BEL-7402細(xì)胞的生長曲線Fig 5 Growth curve of BEL-7402 cells after knockdown of SFPQ

驗(yàn)結(jié)果顯示，KD1和KD2組與Blank組相比較，2組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)也明顯減少(P<0.05，圖6)，其中KD1組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為(99.4±16.3)，KD2組為(86.6±9.1)，NC組為(235.2±20.0)，Blank組為(235.8±16.1)，說明敲低SFPQ表達(dá)可以同時(shí)抑制Bel-7402細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.6敲低SFPQ表達(dá)對BEL-7402細(xì)胞EMT進(jìn)程的影響 Western-blot 結(jié)果顯示，KD1和KD2組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)較Blank組明顯升高，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin及抑制上皮特性的轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)均較Blank組明顯降低(圖7)，表明敲低SFPQ表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)Bel-7402細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

Blank:空白組； NC：陰性對照組； KD1：siRNA1組； KD2：siRNA2組.圖6 敲低SFPQ后BEL-7402細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量的變化Fig 6 Migrated and invaded BEL-7402 cells after knockdown of SFPQ

3 討 論

本研究通過免疫組織化學(xué)染色法證實(shí)，SFPQ蛋白在HCC患者癌組織的表達(dá)顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織。此外，利用Oncolnc數(shù)據(jù)庫對不同SFPQ mRNA表達(dá)水平的患者進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SFPQ mRNA的患者術(shù)后總生存時(shí)間更短。體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低SFPQ表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力均顯著下調(diào)，EMT進(jìn)程受到阻滯，說明SFPQ在HCC中參與了肝癌細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移的調(diào)控。

OncoLnc數(shù)據(jù)庫包含了TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫的21種癌癥、8 647例患者的生存資料和mRNA、miRNA測序數(shù)據(jù)及MiTranscriptome beta數(shù)據(jù)庫的lncRNA測序數(shù)據(jù)。通過對基因的表達(dá)水平進(jìn)行分組，可以直接得到不同基因表達(dá)水平的患者Kaplan-Meier生存分析結(jié)果[13]。數(shù)據(jù)庫共有360名HCC患者的生存資料，按照推薦的設(shè)置進(jìn)行生存分析，每組樣本量仍達(dá)118例，因此所得的生存分析結(jié)果可靠性強(qiáng)，提示SFPQ可能是HCC患者的預(yù)后不良因素。

SFPQ眾多的結(jié)構(gòu)域賦予了它多種多樣的功能，而目前關(guān)于SFPQ在腫瘤中表達(dá)及功能的研究還很有限。研究發(fā)現(xiàn)，SFPQ在前列腺癌中較癌旁組織低表達(dá)，且低表達(dá)SFPQ與前列腺癌進(jìn)展顯著相關(guān)，但預(yù)后分析結(jié)果顯示，不同表達(dá)水平的患者術(shù)后無瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間均無顯著差異[10]。在結(jié)直腸癌組織中，SFPQ的表達(dá)較非癌組織無顯著改變[11]。而本研究結(jié)果顯示，SFPQ蛋白在HCC組織中較非癌組織明顯上調(diào)，并且高表達(dá)SFPQ的患者術(shù)后預(yù)后不良的可能性更高。這與在前列腺癌和結(jié)直腸癌中的研究結(jié)果截然不同，提示在HCC中，SFPQ可能通過其特有的分子機(jī)制影響著HCC的發(fā)生發(fā)展。

Blank:空白組； NC：陰性對照組； KD1：siRNA1組； KD2：siRNA2組.圖7 敲低SFPQ表達(dá)后BEL-7402細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化Fig 7 Expression of EMT related proteins in BEL-7402 cells after knockdown of SFPQ

SFPQ蛋白氨基酸序列中存在兩個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA-binding domain, RBD)，SFPQ蛋白與RNA結(jié)合后，對PTBP2蛋白的調(diào)控作用可能受到影響[14-15]。Ji等在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，已在多種腫瘤中均被證實(shí)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的長鏈非編碼RNA MALAT1可與SFPQ相結(jié)合，導(dǎo)致癌基因PTBP2從SFPQ/PTBP2復(fù)合物中游離出來，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[11]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，SFPQ可與長鏈非編碼RNA GAPLINC結(jié)合，在一定程度上削弱GAPLINC對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用[16]。EMT是指上皮細(xì)胞失去其上皮表型，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強(qiáng)遷移和侵襲能力的間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程[17-19]，是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)鍵步驟。EMT在分子水平的重要標(biāo)志性事件是相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(如snail1/2，ZEB1/2等)上調(diào)，上皮表型E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)表型N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA敲低SFPQ的表達(dá)后，HCC細(xì)胞株的增殖、遷移侵襲能力均有所下降，EMT進(jìn)程也受到阻滯，說明不同于結(jié)直腸癌，SFPQ在HCC中可能主要作為癌基因發(fā)揮作用，其中存在著未知的分子機(jī)制，有待進(jìn)一步探究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，SFPQ在HCC中呈高表達(dá)，并且高表達(dá)的SFPQ參與調(diào)控了HCC的增殖、遷移侵襲以及EMT進(jìn)程，SFPQ有望成為肝癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。但本研究也存在眾多的不足之處，如在免疫組織化學(xué)染色階段納入的樣本量不足，無法分析SFPQ蛋白的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系；此外，SFPQ通過何種分子機(jī)制調(diào)控HCC的進(jìn)展，也需要深入研究。

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