蛋白質(zhì)相互作用技術在分子水平的應用

【摘要】基于蛋白復合物在鈉離子通道相關疾病中的調(diào)控作用，本文綜述了蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)建蛋白質(zhì)關系的網(wǎng)絡和生物學通路中涉及的體內(nèi)和體外相關檢測方法，如酵母雙雜交系統(tǒng)、雙分子熒光互補、免疫共沉淀技術、融合蛋白Pull-Down技術、單分子下拉、高通量蛋白質(zhì)芯片、微生物質(zhì)譜、串聯(lián)親和蛋白純化，以及以生物信息學為主的研究方法，并通過相關檢測技術在大分子蛋白復合物中的應用獲得新的靶點。

【關鍵詞】蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；酵母雙雜交系統(tǒng)；雙分子熒光互補；免疫共沉淀技術；串聯(lián)親和蛋白純化

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.055

The Application of Protein Interaction Technology at the Molecular Level

HAN Juanzhu1*， YANG Wenyao2，3， GAO Duo1

（1.Liaoning Inspection， Examination&Certification〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Liaoning Key Laboratory of Livestock Product Safety， Shenyang 110036， China； 2.Liaoning Chengda Biotechnology Co.， Ltd.，Shenyang 110179， China； 3.Shenyang Pharmaceutical University School of Life Sciences and Biopharmaceuticals， Shenyang 110016，China）

Abstract： Based on the regulatory role of protein complexes in sodium ion channel related diseases， this article reviews the in vivo and in vitro detection methods involved in the construction of protein relationship networks and biological pathways through protein interactions： yeast two hybrid system， bimolecular fluorescence complementarity， immune coprecipitation technology， fusion protein Pull-Down technology， single-molecule pull-down， high-throughput protein chip， microbial mass spectrometry， tandem affinity protein purification， and bioinformatics based research methods. Through the application of relevant detection technologies in large molecule protein complexes， new targets are obtained.

Keywords： protein protein interaction； Y2H； BiFC； Co-IP； TAP

蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）技術是一種隨著生物技術進步而發(fā)展的新型研究方法，它是新型靶點藥物研發(fā)的關鍵技術，同時也是研究藥物副反應的基礎方法，為藥物治療開辟了新的道路。通過建立蛋白質(zhì)關系的化學網(wǎng)絡和生物學通道，可以鑒定由功能失調(diào)或病變引起的異常表達蛋白，從而發(fā)現(xiàn)與病毒的小分子相互作用機制，并明確治療干預的靶點。

蛋白質(zhì)之間的動態(tài)相互作用幾乎指導了細胞功能的各個方面。了解活細胞中大分子的相互作用是破解它們在細胞功能和調(diào)節(jié)中作用的關鍵。單個蛋白質(zhì)也是多種蛋白質(zhì)網(wǎng)絡的一部分，這使得分離出發(fā)生在細胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的各種排列具有挑戰(zhàn)性。PPI檢測技術主要包括體內(nèi)檢測和體外檢測兩個方面。

1體內(nèi)技術研究

1.1酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast-hybrid system，Y2H）是1989年Fields和Song提出并創(chuàng)立的一種直接在酵母細胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用的遺傳學新方法。這一技術在細胞分裂調(diào)節(jié)和凋亡、信號通路轉(zhuǎn)導、癌癥相關基因表達產(chǎn)物作用、基因表達調(diào)控元件及蛋白特異性等方向帶來很多熱點研究。其主要用于互作蛋白的篩選，適用方向由蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間擴展到蛋白質(zhì)與DNA、RNA及其他小分子相互作用，對新作用蛋白的發(fā)現(xiàn)起到巨大的推動作用。

Y2H的建立是基于真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識，起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄因子，如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4，其在結(jié)構(gòu)上包含兩個主要部分：一是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD），二是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）。待測蛋白與AD、BD融合表達形成Prey-AD和bait-BD，只有通過誘餌蛋白與目標蛋白在細胞內(nèi)的相互作用，AD和BD之間會相互吸引，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，形成完整的轉(zhuǎn)錄因子，并激活酵母基因組中的報告基因進行轉(zhuǎn)錄。在實驗時只要通過觀察報告基因的表達水平就能判斷蛋白質(zhì)復合物之間是否存在相互作用。Y2H系統(tǒng)能夠真實反映體內(nèi)蛋白質(zhì)復合物之間的相互作用，蛋白表型和基因型聯(lián)系緊密，聯(lián)用簡便高效的Gateway表達載體構(gòu)建方法，因而在大規(guī)模PPI研究中的應用前景具有普遍性。然而，盡管傳統(tǒng)二代Y2H系統(tǒng)在分析PPI及小分子藥物蛋白靶標探索中的應用認可度高，但無法提供PPI的密切程度且易出現(xiàn)假陽性，故可結(jié)合免疫共沉淀或GST-pull down試驗進行驗證，但高通量篩選方面仍具有局限性。

1.2雙分子熒光互補

蛋白質(zhì)相互作用是產(chǎn)生生物調(diào)節(jié)特異性的基本機制，活細胞中蛋白質(zhì)相互作用的研究具有特別重要的意義，因為發(fā)生在特定細胞中的相互作用取決于細胞中存在的蛋白質(zhì)的完整補充以及影響細胞的外部刺激。雙分子熒光互補（BiFC）分析可以直接可視化活細胞中的蛋白質(zhì)相互作用。Hu等[3]在2002年提出了BiFC技術，以最短的時間、最易于理解的方式說明蛋白在細胞中的位置跟蹤和蛋白與蛋白之間的作用關系。

BiFC測定基于熒光蛋白的兩個非熒光片段之間的關聯(lián)，它們通過融合片段的蛋白質(zhì)之間的相互作用而彼此接近。在許多不同的細胞類型和生物體中，使用BiFC測定法可以觀察到許多蛋白質(zhì)相互作用。按照規(guī)則，標記分子主要采用熒光報告蛋白中沒用熒光的片段，通過細胞內(nèi)融合技術共表達攜帶標記分子的誘餌蛋白和捕獲蛋白。

Paul等[4]為了尋找FGF14∶Nav1.6復合物上游的關鍵細胞途徑，通過使用分裂螢光素酶互補測定法穩(wěn)定地重建了FGF14∶Nav1.6復合物，并對267種FDA批準的化合物進行了高通量篩選（HTS），這些化合物能夠靶向細胞信號轉(zhuǎn)導途徑中的已知介體。在篩選過程中，5種化合物被驗證并確認具有活性，其中，酪氨酸激酶抑制劑來舒替尼排名最高，表現(xiàn)出對FGF14∶Nav1.6裝配的亞微摩爾抑制作用。BiFC技術已被國際上眾多實驗室采用，在熒光顯微鏡下，通過顯示器可以看到在生理狀態(tài)下目標蛋白的作用情況，包括具體的作用部位、作用的時間、作用的程度、所形成蛋白質(zhì)復合物的穩(wěn)定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等。在活細胞內(nèi)證明蛋白質(zhì)的相互作用對研究蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。

2體外技術研究

2.1免疫共沉淀技術

目前，體外研究確定蛋白質(zhì)之間相互作用的黃金標準之一是Co-IP測定，它依賴于相互作用蛋白質(zhì)的親和基礎上的共同純化，然后通過western blot或質(zhì)譜法進行鑒定。它利用特異性抗體與抗原的結(jié)合來確定蛋白質(zhì)之間的互動。誘餌蛋白抗體加入后，將獵物蛋白在免疫沉淀反應的作用下被共沉淀下來，然后使用SDS-PAGE或二維電泳并結(jié)合微生物質(zhì)譜鑒定，得到獵物蛋白的具體信息。Jia J等[5]使用共免疫沉淀與質(zhì)譜聯(lián)用（Co-IP/MS）技術鑒定出23種與母羊卵巢提取物中的FecB特異性相互作用的蛋白質(zhì)。所選PPI的生物信息學分析表明，F(xiàn)ecB主要通過卵巢中的信號傳導與其他幾種BMP相關。

2.2融合蛋白Pull-Down技術（GST pull-down）

用傳統(tǒng)的免疫沉淀法很難確定哪些蛋白質(zhì)在生理復合體中有多少拷貝。此外，在樣品制備和測量之間往往消耗大量時間并且經(jīng)過多個操作步驟，因而在分析之前體內(nèi)相互作用的保存程度存在不確定性。通過了解蛋白之間的相互作用能夠掌握細胞功能和調(diào)控的機制，揭示生命最基本的作用方式。GST Pull-Down技術采用誘餌蛋白（Bait protein）和標簽蛋白（生物素-、His-或GST-），通過谷胱甘肽和GST之間的特異性關系在細菌、細胞體系中進行表達，在色譜柱上固定誘餌蛋白，從而特異性結(jié)合捕獲細胞中互相作用的靶蛋白。Kordiukova MIu等[6]通過GST融合的蛋白，即人GST-SURF6和與C末端有85%同源性的小鼠Surf6的保守C末端結(jié)構(gòu)域、人SURF6保守域（GST-Surf6-dom）的鑒定，以鑒定人HeLa細胞中與SURF6相互作用的蛋白質(zhì)。

2.3單分子下拉

通常，為了研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，常采用的技術是傳統(tǒng)的共免疫沉淀（Co-IP/pulldown）進行蛋白質(zhì)印跡。然而，該技術沒有提供關于PPI動力學和化學計量的精確信息。另外，傳統(tǒng)Co-IP的敏感性不適合檢查稀有細胞中的PPI。鑒于Co-IP方面存在的不足，Jain A等[7]建立了單分子下拉（SiMPull）方法，該方法能夠分析出一種蛋白的多種關聯(lián)蛋白，以單個分子的分辨率來證明蛋白質(zhì)復合體的特性和特征，以及化學計量特性和特征，同時通過分層次的光漂白來分析確定化學計量特性和特征。該方法將熒光顯微方法與pulldown方法結(jié)合在一起，直觀獲得蛋白復合體的圖像，特別擅長組織內(nèi)、細胞器和膜蛋白的內(nèi)源性蛋白分析。目前，SiMPull分析用于研究稀有細胞，為研究細胞途徑中的蛋白復合物提供了一種用時少、檢測限低、準確率高的方法。

2.4串聯(lián)親和純化

在研究蛋白質(zhì)相互作用的新技術革命中，Rigaut等[10]提出了串聯(lián)親和純化技術（TAP），主要應用在生理狀態(tài)下。該方法的特點是采用了兩個相連的標簽，提高了特異性，排除了更多干擾。該方法通過讓目標蛋白融合TAP特異性標簽，再經(jīng)過串聯(lián)親和層析獲得目標蛋白質(zhì)復合物，經(jīng)過二維電泳和微生物質(zhì)譜鑒定等技術，得到更多的蛋白信息。該方法耗時短，結(jié)果準確性高，能夠應用在細菌、真菌、病毒、昆蟲等實驗載體。

2.5質(zhì)譜技術在蛋白質(zhì)互動分析過程中的運用

質(zhì)譜技術（MS）被廣泛應用于包括人類蛋白質(zhì)組在內(nèi)的各種細胞、組織和生物體的綜合分析。Petricoin等[12]將低分子量蛋白質(zhì)譜引入癌癥蛋白質(zhì)組學。穩(wěn)定同位素標記是一種標記定量技術，在相同的質(zhì)譜運行條件下對肽的譜特征分別定量。目前，常用的同位素標記分別為2H、13C、15N和18O。加入同位素標記的方法主要有：化學標記法（ICAT）和代謝標記法（SILAC）?；瘜W標記法是在提取細胞內(nèi)總蛋白、經(jīng)親和層析后加入同位素標記（體外標記），主要包括酶標記和化學標記兩大類。由于同位素“輕”“重”之間存在差異性，采用質(zhì)譜技術能夠方便、簡單及快速地區(qū)分并鑒定實驗組中特異的蛋白質(zhì)。

2.6其他方法

在mRNA水平的層面進行研究，側(cè)面說明蛋白作用情況。研究基因產(chǎn)物的作用關系是通過刺激細胞檢測表達量的變化。Stuart等[13]對人、果蠅及線蟲的基因共表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)了2萬多種具有保守性的共表達關系。多維蛋白鑒定技術通過定位蛋白質(zhì)的亞細胞來研究蛋白質(zhì)相互作用機制。GST pull-down、Far-western、免疫共沉淀、化學交聯(lián)等可用于小規(guī)模的分析驗證試驗。

3結(jié)束語

高等動物基因組研究人員指出，真正調(diào)節(jié)生物體復雜性的因素并非基因總量的增長，而是通過更為復雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間所發(fā)生的作用，及其相互影響后形成的生物學作用機制，構(gòu)建起這些分子間的互動和調(diào)控網(wǎng)絡，是后基因組時代的首要任務。今后，隨著蛋白相互作用的深入研究，以及對蛋白相關靶點的廣泛研究，與蛋白相互作用相關的檢測技術具有更加廣泛的應用前景。

【參考文獻】

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【作者簡介】

通信作者：韓鐫竹，女，1985年出生，高級畜牧師，碩士，研究方向為動物源細菌耐藥性，261131312@qq.com。

（編輯：于淼）