40種中藥材提取物對煙草黑脛病菌的抑制作用

芶*

（1.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101）

40種中藥材提取物對煙草黑脛病菌的抑制作用

芶劍渝1,2，彭玉龍1，張長華1，夏艷2，孔凡玉2，張成省2*

（1.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101）

測定了嶗山40種常見中藥材提取液對煙草黑脛病菌的抑菌活性。結(jié)果表明，10 g/L乙醇提取物濃度下，有11種植物（占27.5%）提取物對煙草黑脛病菌抑制率達(dá)100%，有28種（占70%）抑菌率達(dá)80%以上。對公丁香提取液相對含量較高的4種組分的抑菌效果進(jìn)行了進(jìn)一步測定，結(jié)果表明，丁香酚和乙酸丁香酚酯10倍稀釋液對黑脛病菌抑制率高，分別為100%和60.19%，說明丁香酚和乙酸丁香酚酯為公丁香的主要抑菌活性成分。本研究表明，公丁香提取物中活性成分丁香酚具有防治煙草黑脛病的良好應(yīng)用潛力。

中藥材；Phytophthora nicotiana；公丁香；抑菌活性

煙草黑脛病是危害我國煙草生產(chǎn)的重要病害，常年發(fā)病率為5%～12%，每年造成巨額經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前生產(chǎn)上以化學(xué)防治為主，常用藥劑主要有甲霜靈錳鋅、霜霉威、烯酰嗎啉等[2]。由于藥劑品種相對單一，且使用年限較長，生產(chǎn)上已經(jīng)出現(xiàn)了抗藥性菌株[3-5]。此外，由于成熟期發(fā)病嚴(yán)重，施藥防治易造成農(nóng)藥殘留。因此，篩選和研究新的殺菌劑是一項(xiàng)非常迫切的工作。植物源殺菌劑被認(rèn)為是化學(xué)合成殺菌劑最好的替代品，尤其是藥用植物更具有開發(fā)為植物源殺菌劑的巨大潛力[6]。與化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥具有低毒、無殘留、選擇性高及不易使病菌產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)而成為近年來研究與開發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域[7]。有關(guān)植物源殺菌素對煙草黑脛病防治研究鮮有報(bào)道。王傳吉等[8]報(bào)道了青蒿、苦參、蘄艾、廣藿香、金銀花等復(fù)配劑水提取物對黑脛病菌有良好的抑制作用，楊蘭等[9]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素500倍液對煙草黑脛病防治效果可達(dá)46.1%。本研究以青島嶗山40種常見中藥材為試驗(yàn)材料，測定其對煙草主要黑脛病菌的體外抑菌活性，并進(jìn)一步追蹤抑菌作用強(qiáng)的藥材的主要有效成分，為研發(fā)抗煙草主要病害的新型植物源殺菌劑提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：40種青島嶗山中藥材名稱見表1（購買自北京同仁堂青島分店）。供試菌株：煙草黑脛病菌（P. nicotiana）由本實(shí)驗(yàn)室從煙田采集感染病株分離純化獲得。培養(yǎng)基：燕麥培養(yǎng)基[6]。原藥：丁香酚、乙酸丁香酚酯、β-石竹烯和α-石竹烯（購買自Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥材提取液的制備 參考林勇等[10]方法。將購買的40種植物陰干，進(jìn)一步于50 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎過0.425 mm篩。稱取50.0 g植物干粉于500 mL三角瓶，加入95%乙醇300 mL微波萃取法（微波爐調(diào)至中火，90 s），過濾并收集提取液，再加入300 mL 95%乙醇冷浸5 d，過濾并收集提取液，再次加入 300 mL 95%乙醇，超聲波（功率為600 W）提取1 h，過濾并收集提取液，合并提取液，在50 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，回收溶劑，所得浸膏用甲醇定容為質(zhì)量濃度100 g/L的溶液，獲藥材提取液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 煙草黑脛病菌抑菌試驗(yàn) 采用生長速率法測定上述藥材提取物對病原菌菌絲生長的抑制作用[11]。將藥材提取液與燕麥培養(yǎng)基充分混和，配制成濃度為10 g/L的培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺(tái)中將菌餅（用經(jīng)消毒的9 mm的打孔器在培養(yǎng)好的黑脛病菌落邊緣打取帶菌培養(yǎng)基，即制成菌餅）移植到上述加入提取物的培養(yǎng)基中心處（一皿一個(gè)菌餅），將菌絲面向下接觸培養(yǎng)基。以等量甲醇作對照。每個(gè)處理3次重復(fù)。25 ℃培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量并記錄菌落直徑。菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%。

1.2.3 藥材提取液化學(xué)組分抑菌試驗(yàn) 參考本實(shí)驗(yàn)室對公丁香提取物組分的分析結(jié)果[10]，選取丁香提取物中相對含量較高的化學(xué)組分，購買其單品的原藥，以甲醇稀釋10倍，參照1.2.2中方法，分別測定不同化學(xué)組分對黑脛病菌的抑菌效果，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，對照加入等量甲醇。

表1 供試藥材Table 1 Chinese herbal medicines tested in this study

2 結(jié) 果

2.1 煙草黑脛病抑菌試驗(yàn)

所測定的40種藥材中有11種藥材對黑脛病菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌效果，菌絲生長抑制率均為100%，分別為貫眾、海州常山、白頭翁、金銀花、香附、丹參、虎杖、蒼術(shù)、東北龍膽、徐長卿和公丁香（表2）。除板藍(lán)根外，其他28種藥材抑菌率均在80%以上，抑菌作用十分明顯（表2）。

表2 40種藥材提取液對煙草黑脛病菌的抑菌作用Table 2 Inhibition of the extracts of 40 kinds of Chinese herbal medicines againstP.nicotiana

2.2 公丁香提取液化學(xué)組分抑菌試驗(yàn)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[10]，公丁香提取液中相對含量較高的化學(xué)組分，分別為丁香酚、乙酸丁香酚酯、β-石竹烯、α-石竹烯。選取以上4種組分的原藥進(jìn)行黑脛病菌抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，4種組分中丁香酚含量最高，抑菌效果也最明顯，對黑脛病菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，10倍稀釋液對黑脛病菌的菌絲生長抑制率均為100%；乙酸丁香酚酯10倍稀釋液對黑脛病菌的菌絲生長抑制率分別為60.19%；而β-石竹烯和α-石竹烯均無抑菌效果（表3）。

表3 公丁香4種化學(xué)組分對煙草黑脛病菌抑菌作用Table 3 Inhibition of four chemical components againstP. nicotiana

3 討 論

本文選取 40種嶗山中藥材[12]測定其乙醇提取物對煙草黑脛病菌的抑制作用，結(jié)果表明，嶗山具有豐富的殺菌植物資源。在10 g/L濃度下，對煙草黑脛病菌抑制率達(dá) 100%的植物有 11種（占比27.5%），抑菌率80%以上的植物有28種（占比70%），說明上述植物具有良好的防治煙草黑脛病的潛力。上述植物中，苦參、金銀花和藿香曾被報(bào)道對煙草黑脛病菌有抑制活性[8]，其余植物對煙草黑脛病菌的抑制作用均為本研究首次報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)公丁香提取液對煙草青枯病菌具有良好的抑制作用，并采用GC-MS鑒定了其提取液中含有12個(gè)組分[10]。本研究測定的40種植物中公丁香提取液對煙草黑脛病菌的抑制率達(dá)到 100%，具有潛在的應(yīng)用潛力。對公丁香提取液中含量較高的4種組分的抑菌作用測定表明，含量最高的丁香酚對煙草黑脛病菌的抑菌效果最好，說明公丁香為抑制黑脛病菌的主要活性成分。丁香酚在醫(yī)學(xué)上主要用于解熱鎮(zhèn)痛、抗炎麻醉等[13]，近年來有關(guān)丁香酚應(yīng)用于植物病害防治的報(bào)道越來越多。Bai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚對煙草青枯病菌具有較強(qiáng)的抑制活性，能破壞菌體結(jié)構(gòu)，降低病原菌代謝活性。丁香酚還用于植物病毒病的防治，比如煙草花葉病毒病[15]、番茄病毒病[16]等。本文研究表明，丁香酚對煙草黑脛病菌同樣具有強(qiáng)烈的抑制作用。由于丁香酚在自然界中來源豐富，生產(chǎn)成本低，將其作為新型殺菌劑原料進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用，前景十分光明。下一步應(yīng)深入研究丁香酚抑菌作用機(jī)理，并開展田間試驗(yàn)，驗(yàn)證防病效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 孫元華，謝剛，石勇，等. 煙草黑脛病生物防治研究進(jìn)展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009（S1）：26-29.

[2] 汪漢成，李文紅，馮勇剛，等. 煙草黑脛病化學(xué)防治的歷史與現(xiàn)狀[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2011（5）：96-102.

[3] 孟建玉，汪漢成，賈蒙驁，等. 貴州省煙草黑脛病菌對甲霜靈的抗藥性[J]. 植物保護(hù)，2014（5）：168-171.

[4] 李梅云，祝明亮. 煙草黑脛病菌對甲霜靈的抗性測定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006（9）：377-379.

[5] 戶艷霞，裴衛(wèi)華，曹繼芬，等. 大理州煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的敏感性測定[J]. 中國煙草科學(xué)，2015，36（1）：102-106.

[6] AL-REZA S M, RAHMAN A, AHMED Y, et al. Inhibition of plant pathogens in vitro and in vivo with essential oil and organic extracts ofCestrum nocturnumL[J]. Pesticide biochemistry and physiology, 2010, 96(2): 86-92.

[7] 張興卿，馮俊濤，等. 植物源農(nóng)藥研究進(jìn)展[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2015（5）：685-698.

[8] 王傳吉，王樹聲，趙陽，等. 一種植物源復(fù)配劑對煙草黑脛病的抑制及土壤特性的影響[J]. 中國煙草科學(xué)，2015，36（6）：83-87.

[9] 楊蘭，袁謀志，田茂成，等. 大蒜素對煙草黑脛病防治效果的田間試驗(yàn)[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（8）：24-25.

[10] 林勇，夏艷，徐茜，等. 嶗山常見中藥材提取物對煙草青枯病菌的抑制作用[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2016，32（2）：270-276.

[11] 黃建，馮超，張成省，等. 三種藥劑對煙草黑脛病防治效果研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（6）：1681-1682，1685.

[12] 王宏韜，田萍，周三，等. 青島嶗山藥用植物資源多樣性調(diào)查[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009（2）：305-308.

[13] 孔曉軍，劉希望，李劍勇，等. 丁香酚的藥理學(xué)作用研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（3）：508-511.

[14] BAI W M, KONG F Y, LIN Y, et al. Extract of Syringa oblata: A new biocontrol agent against tobacco bacterial wilt caused byRalstonia solanacearum[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2016, 134: 79-83.

[15] 蘇杭，王春梅，陳浩，等. 丁香酚對煙草抗煙草花葉病毒的誘導(dǎo)作用初探[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012（1）：24-29.

[16] 王春梅，潘曉芬. 植物源抗病毒劑 20%丁香酚水乳劑防治番茄病毒病田間藥效試驗(yàn)[J]. 農(nóng)藥，2013（6）：442-443.

Inhibitory Activity of Forty Kinds of Chinese Herbal Medicines against Phytophthora nicotiana

GOU Jianyu1,2, PENG Yulong1, ZHANG Changhua1, XIA Yan2, KONG Fanyu2, ZHANG Chengsheng2*
(1. Zunyi Branch, Guizhou Tobacco Company, Zunyi, Guizhou 563000, China; 2. China Tobacco Integrated Pest Management of China Tobacco, Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China)

In this study, antifungal activities of ethanol extracts of 40 species of Chinese herbal medicines againstP. nicotianain vitrowere determined. The results showed that antifungal plant resources in Laoshan Mountain were rich. The inhibitive rates of eleven species (27.5%) reached 100% at the concentration of 10 g/L. 28 species had good inhibitive effects over 80% againstP. nicotiana. Determination of the antifungal activities of four fractions with relatively high content in the extracts of clove showed that 10-fold dilution of eugenol possesses the highest inhibitive rate (100%) againstP. nicotiana, while the inhibitive rate of eugenyl acetate was 60.19%. This study suggests that a big variety of plant species in Laoshan Mountain have antifungal activities, and the active ingredient eugenol of clove extracts has good potential as a biocontrol agent to control tobacco black shank disease.

Chinese herbal medicine;Phytophthora nicotiana; clove; antifungal activity

S435.72

1007-5119（2017）01-0064-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.011

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程“灘涂生物資源保護(hù)利用”（ASTIP-TRIC07）；貴州省煙草公司遵義市公司“煙草真菌病害植物源殺菌素篩選與應(yīng)用”（2016-09）

芶劍渝（1976-），男，碩士，研究方向：煙草生產(chǎn)技術(shù)。E-mail：goujianyuzy@126.com。*通信作者，E-mail：zhangchengsheng@caas.cn

2016-06-15

2016-09-12