藤茶總黃酮和二氫楊梅素含量研究

楊志堅(jiān)，溫杭凱，陳選陽(yáng)，徐惠龍，劉江洪，吳仁燁，許 明，廖素鳳，鄭金貴*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)研究所 350002； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院)

藤茶學(xué)名為顯齒蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz) W.T.Wang],俗稱(chēng)莓茶、端午茶、藤婆茶等，為葡萄科蛇葡萄屬植物[1]，主要分布于我國(guó)廣東、云南、江西、福建等地[2]。藤茶為我國(guó)特有的藥食兩用植物[3]。藤茶中二氫楊梅素含量約為3.8 mg/g[4]；藤茶水浸物中含有豐富的多糖和氨基酸[6]，包含8種人體必需氨基酸，具有營(yíng)養(yǎng)保健、提高免疫力等功效；藤茶含有大量的多酚和黃酮類(lèi)化合物，科學(xué)研究表明，黃酮具有殺菌消炎、止咳鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)肝、降糖降脂等功效[7]。因此，藤茶具有一定的醫(yī)療保健功效。目前關(guān)于藤茶的研究主要集中在藤茶活性成分的分離鑒定及黃酮的抗菌、抗氧化、降血糖等方面[5]。

總黃酮是一類(lèi)在植物界中分布廣泛，具有多種生物活性的多酚類(lèi)化合物。國(guó)內(nèi)主要以紫外分光光度法檢測(cè)藤茶總黃酮，此外還有ZrOCl2·8H2O顯色法、AlCl3顯色法、熒光檢測(cè)法和直接檢測(cè)法[12]。

二氫楊梅素是一種多酚羥基雙氫黃酮醇，又稱(chēng)蛇葡萄素，屬于黃酮類(lèi)化合物。高效液相色譜法具有分離速度快、效率高、精密度和準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)廣泛運(yùn)用于二氫楊梅素的檢測(cè)，此外藤茶二氫楊梅素的檢測(cè)方法還有薄層掃描法、紫外分光光度法[12]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與材料

KQ-700E型超聲波清洗器、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、waters高效液相色譜儀。

甲醇為色譜純(Fisher公司)，5%NaNO2溶液、10%AlCl3溶液、4% NaOH溶液，蒸餾水為娃哈哈純凈水。

3個(gè)藤茶品種分別來(lái)自湖南郴州的AG1、湖南湘潭的AG2、福建武夷山的AG3，樣品取自2014年7月采摘的藤茶，除不同加工方式中采用曬干及熱風(fēng)干燥外，其余試驗(yàn)均采用熱風(fēng)干燥。對(duì)不同器官(藤茶根、藤茶葉片、藤茶花、藤茶葉柄、藤茶莖)研磨過(guò)20目篩，然后取樣分析。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1總黃酮含量的測(cè)定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法，利用超聲波等儀器，以亞硝酸鈉—氯化鋁—?dú)溲趸c作為顯色體系，根據(jù)分光光度計(jì)法測(cè)定植物體內(nèi)化合物的原理，提取藤茶中的總黃酮及其化合物[8]。以亞硝酸鈉—氯化鋁—?dú)溲趸c作為顯色體系對(duì)藤茶中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，使用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)500 nm，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出相應(yīng)的樣品總黃酮含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品0.05 g，加入提取劑甲醇10 mL，40℃超聲30 min充分混勻；將浸泡液避光置于室溫保存12 h，8000 r/min離心15 min，取上清液定容至10 mL；用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)500 nm處的吸光值，3次重復(fù)取平均值。準(zhǔn)確量取提取液3 mL于25 mL容量瓶，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的操作步驟，分別加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻；6 min后加入10% AlCl3溶液1 mL，搖勻；6 min后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻；以蒸餾水定容，搖勻，靜置15 min，以蒸餾水代替樣品作為對(duì)照，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)500 nm處的吸光值，3次重復(fù)取平均值。通過(guò)回歸方程計(jì)算出總黃酮含量(x)，樣品總黃酮含量以樣品干重的百分?jǐn)?shù)計(jì)：總黃酮=x×10×25/3×0.001×100/w

式中：x-從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出的總黃酮含量(mg/mL)；10-提取劑的體積(mL)；25/3-提取劑的稀釋倍數(shù)；0.001-毫克換算為克；w-所稱(chēng)取藤茶樣品粉末的質(zhì)量(g)。

1.2.2二氫楊梅素含量的測(cè)定 取樣并研磨，用100%甲醇(AR)溶液在60℃水浴超聲提取，測(cè)定用C18，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm、HPLC分析，用二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外標(biāo)法直接測(cè)定[9]。液相色譜流動(dòng)相(AB相相同)水∶甲醇∶磷酸為75∶25∶0.1，定容后溶液需過(guò)0.45 μm膜，超聲脫氣。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用色譜甲醇配制(標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為0.01 g/mL)。稱(chēng)取0.1000 g(精確到0.0001 g)均勻研磨的試樣于50 mL錐形瓶中，加入100%甲醇溶液50 mL，立即移入60℃的超聲儀中，超聲30 min，浸提后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中用100%甲醇定容、搖勻。取10 mL至離心管，在3500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min(20℃或15℃)；取上清液1 mL至10 mL容量瓶中用100%甲醇定容、搖勻，取1.5 mL過(guò)0.45 μm膜，待測(cè)。在色譜條件流動(dòng)相流速為0.7 mL/min，柱溫為30℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)290 nm，洗脫條件為100%A 或100%B相保持20 min。待流速和柱溫穩(wěn)定后，進(jìn)行空白運(yùn)行(進(jìn)空針)。準(zhǔn)確吸取10 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液注射入HPLC。在相同的色譜條件下注射10 μL測(cè)定液，測(cè)試液以峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶不同器官總黃酮含量

藤茶不同器官總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1看出，3個(gè)藤茶品種不同器官的總黃酮含量存在差異，總黃酮含量由高到低順序?yàn)楦⑷~、花、葉柄、莖，3個(gè)藤茶品種根的總黃酮平均含量為235.03 mg/g；藤茶總黃酮含量最高的品種是AG 1，除葉柄外的其他器官總黃酮含量均高于其他2個(gè)品種。

表1 藤茶不同器官總黃酮含量 (單位： mg/g)

2.2 不同加工方式對(duì)藤茶葉片總黃酮含量的影響

由表2看出，3個(gè)藤茶品種葉片總黃酮含量均是曬干方式高于熱風(fēng)烘干方式，采用曬干方式的總黃酮平均含量為212.74 mg/g，是采用熱風(fēng)烘干方式(192.82 mg/g)的1.1倍。

表2 不同加工方式藤茶葉片總黃酮含量 (單位： mg/g)

2.3 不同存放時(shí)間藤茶葉片總黃酮含量變化

由表3看出，3個(gè)藤茶品種葉片總黃酮含量存在一定差異，且均隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量降低，3個(gè)品種葉片平均總黃酮含量存放1年為192.82 mg/g，存放3年為128.31 mg/g，降低了33.5%。

表3 不同存放時(shí)間藤茶葉片總黃酮含量 (單位： mg/g)

2.4 藤茶不同器官二氫楊梅素含量

由表4看出，3個(gè)品種的藤茶不同器官二氫楊梅素含量由高到低的順序均是花、葉柄、根、莖，其中以AG 3品種的藤茶葉片二氫楊梅素含量最高，達(dá)到3.99 mg/g；3個(gè)藤茶品種的莖均未檢測(cè)到二氫楊梅素。

表4 藤茶不同器官二氫楊梅含量 (單位：mg/g)

2.5 不同加工方式對(duì)二氫楊梅素含量的影響

不同加工方式(烘干、曬干)處理的藤茶二氫楊梅素含量的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5看出，品種間的二氫楊梅素素差異不大；不同加工方式3個(gè)藤茶品種二氫楊梅素含量存在一定的差異，均是采用曬干加工方式高于熱風(fēng)烘干方式，采用曬干方式加工藤茶的二氫楊梅素平均含量為4.72 mg/g，是采用熱風(fēng)烘干方式(3.93 mg/g)的1.2倍。

表5 不同加工方式藤茶二氫楊梅素含量 (單位： mg/g)

2.6 不同存放時(shí)間對(duì)二氫楊梅素含量的影響

不同存放時(shí)間(存放1年、存放2年、存放3年)處理的藤茶二氫楊梅素含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6看出，品種間差異不明顯，但不同存放時(shí)間對(duì)3個(gè)藤茶品種二氫楊梅素含量存在明顯的影響：不同存放時(shí)間藤茶二氫楊梅素含量由高到低均為存放2年、存放1年、存放3年，存放2年的藤茶二氫楊毒素含量最高，平均含量達(dá)到14.42 mg/g，是存放3年的13.87倍。

表6 不同存放時(shí)間藤茶二氫楊梅素含量 (單位：mg/g)

3 結(jié)論與討論

3.1 藤茶不同器官總黃酮與二氫楊梅素含量

3個(gè)藤茶品種不同器官總黃酮平均含量由高到低為根、葉片、花、葉柄、莖，二氫楊梅素平均含量由高到低為葉、花、葉柄、根、莖，二氫楊梅素在總黃酮中比例最高的部位為葉片(2.04%)?？傸S酮為藤茶的主要活性物質(zhì)，總黃酮含量最高的根部二氫楊梅素含量未必最高。二氫楊梅素在25℃水中溶解度為4%，熱水中的溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，極微溶于醋酸乙酯[11]?？傸S酮與二氫楊梅素在藤茶器官中分布情況不一致，可能是由于總黃酮在根部合成，導(dǎo)致根部含量較高，運(yùn)輸?shù)饺~片后發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成二氫楊梅素，導(dǎo)致葉片二氫楊梅素含量較高。

3.2 不同加工方式藤茶總黃酮與二氫楊梅素含量

不同的加工方式對(duì)3個(gè)藤茶品種總黃酮和二氫楊梅素含量都有一定的影響，采用曬干加工方式總黃酮和二氫楊梅素的含量均高于烘干的加工方式。究其原因：曬干的過(guò)程中，由于溫度不高，葉片仍然可在光合作用下進(jìn)行一系列的化學(xué)反應(yīng)，造成更多的二氫楊梅素生成。

3.3 不同存放時(shí)間藤茶總黃酮與二氫楊梅素含量

不同存放時(shí)間的總黃酮與二氫楊梅素平均含量存在一定差異，不同存放時(shí)間藤茶總黃酮平均含量由高到低順序?yàn)榇娣?年、存放2年、存放3年；而二氫楊梅素平均含量由高到低順序?yàn)榇娣?年、存放1年、存放3年。究其原因：可能是因?yàn)樵谔俨枞~存放過(guò)程中總黃酮一直處于分解過(guò)程，導(dǎo)致含量逐漸降低。存放初期總黃酮向二氫楊梅素轉(zhuǎn)化分解，導(dǎo)致二氫楊梅素含量升高，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量降低，二氫楊梅素轉(zhuǎn)化量減少，同時(shí)二氫楊梅素分解量逐漸增加，導(dǎo)致二氫楊梅素含量在存放第3年明顯降低。

不同的器官、處理方式及存放時(shí)間對(duì)藤茶二氫楊梅素總黃酮含量均有影響，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)探討不同因素對(duì)藤茶品質(zhì)的影響，并加強(qiáng)調(diào)控，從而提高藤茶總黃酮和二氫楊梅素的含量，為食品、藥品的開(kāi)發(fā)提供更有效的原料。

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