史氏鱘魚軟骨提取物提取工藝及促創(chuàng)面愈合的研究

饒秋華，羅土炎，曹治云，羅 欽，李弈君，王少珍，張志燈

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 350003； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院；3.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心)

鱘魚是世界上唯一生活在水中的活化石，是所有魚類中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的一種魚類。目前，中國(guó)是鱘魚養(yǎng)殖最多、分布最廣、總產(chǎn)量最高的國(guó)家，鱘魚全身遍布軟骨，鱘魚頭、脊索及鰭中含有的軟骨約占體重的10%。軟骨又稱明骨、魚腦，是軟骨魚類鱘魚、鯊魚特有的組織，除供食用外，還具有獨(dú)特的保健藥用功效。本草拾遺記載：鯊魚翅、鱘魚骨，食之明目壯陽(yáng)、延年益壽。軟骨組織中含豐富的硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，以下稱“CS”)，它是一種酸性黏多糖(糖胺多糖)，具有降血脂、抗動(dòng)脈硬化、消炎鎮(zhèn)痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動(dòng)能力、增強(qiáng)人體軟骨彈性、抗衰老、耐疲勞等功效，因此軟骨提取物是一種很好的藥用來源[1-2]。

創(chuàng)面是正常皮膚(組織)在外界致傷因子， 如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫，以及機(jī)體內(nèi)在因素，如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性破壞、一定量正常組織丟失和皮膚正常功能受損。每年全國(guó)受交通事故、意外跌落、動(dòng)物咬傷、外科手術(shù)、戰(zhàn)爭(zhēng)等因素導(dǎo)致的創(chuàng)傷人群多達(dá)數(shù)百萬人，創(chuàng)傷成為不可忽視的疾病。因此，促進(jìn)創(chuàng)面愈合就成為創(chuàng)傷防治的重要手段[3]。目前，用于創(chuàng)面愈合的藥物主要有維生素類，如維生素C、維生素B12、維生素B2、維生素B6、泛酸等；微量元素類，如鋅制劑類；中藥等有效成分，如七葉皂苷鈉、殼聚糖等。然而上述產(chǎn)品獲得過程復(fù)雜，需要不斷地提取和純化，生產(chǎn)成本高[4]。本研究從飼養(yǎng)史氏鱘魚(主要產(chǎn)品為魚子醬)的副產(chǎn)物——軟骨提取物具有消炎鎮(zhèn)痛功效的角度出發(fā)，探討鱘魚軟骨提取物對(duì)促創(chuàng)面愈合的功效，對(duì)進(jìn)一步研究其生理功能和開拓鱘魚軟骨素應(yīng)用市場(chǎng)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1鱘魚 取自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院福清漁溪養(yǎng)殖基地的鱘魚，體重8.5 kg、體長(zhǎng)91 cm。

1.1.2主要試劑 無水乙醇,天津市北辰方正試劑廠產(chǎn)品；氫氧化鈉，西隴化工股份有限公司產(chǎn)品；氯化鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；硼砂，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司產(chǎn)品；咔唑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；D-葡萄糖醛酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；硫酸，天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.1.3儀器與設(shè)備 電熱恒溫水浴鍋：DK-S16型，上海森信實(shí)驗(yàn)有限公司產(chǎn)品；酸度計(jì)：pHS-25型，上海理達(dá)儀器廠產(chǎn)品；電動(dòng)攪拌器：SG-3040型，上海碩光電子科技有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)：LXJ-II型，上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品；電子天平：JA2002型，上海精天電子儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DH9-9075A型，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)：TU-1800PC型，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.4SPF級(jí)昆明小白鼠 6只，雄雌各3只，體重(20±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試品溶液制備 精確稱取用不同方法所提取的CS樣品0.002 g于10 mL容量瓶中，水溶解定容。

1.2.2對(duì)照品溶液制備 精確稱取D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品0.002 g于10 mL容量瓶中，水溶解定容。

1.2.3咔唑試劑 精確稱取0.0125 g咔唑于10 mL棕色容量瓶中，無水乙醇溶解定容，置于4℃冰箱保存。

1.2.4硼砂-濃硫酸試劑 精確稱取0.477 g四硼酸鈉，置于50 mL棕色容量瓶中，用濃硫酸溶解并定容，置于4℃冰箱保存。

1.2.5試品溶液的測(cè)定 精確量取5.0 mL硼砂-濃硫酸試劑于試管中，加入1.0 mL試品溶液，于沸水浴中加熱10 min，取出迅速冷卻至室溫。向水解液中加入咔唑試劑0.2 mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.6前處理 將鱘魚置于電磁爐中加水煮熟，剔除鱘魚上的魚肉等雜質(zhì)，置于烘箱中烘干，用高速中藥粉碎機(jī)將軟骨進(jìn)行粉碎，粉碎后轉(zhuǎn)至1000 mL燒杯中，加 95%乙醇浸泡24 h，移出乙醇，重復(fù)浸泡1次。于50℃鼓風(fēng)干燥脫脂、備用[5]。

1.2.7CS的提取純化 準(zhǔn)確稱取脫脂處理后鱘魚軟骨粉2.0000 g于50 mL燒杯中，加入12 mL 6%氫氧化鈉溶液，40℃水浴降解3 h。取出水解液，將其pH值調(diào)至中性后于 3000 r/min離心 10 min。離心后的堿提取液加入4%(W/V)氯化鈉，待氯化鈉完全溶解后于90℃水浴降解20 min，反應(yīng)后冷卻，3000 r/min離心10 min。取離心上清液調(diào)節(jié)pH值至8.2，加入0.5%胰蛋白酶，于40℃水浴中酶解3 h。然后，于90℃水浴15 min，使胰蛋白酶失活，冷卻后3000 r/min離心10 min。取離心后的上清液，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，攪勻，沉淀CS；回收乙醇后，以3%氯化鈉溶液(增加離子強(qiáng)度)溶解得到的CS沉淀，再緩慢加入3倍體積的無水乙醇，攪勻，沉淀CS，回收乙醇。將經(jīng)過乙醇二次沉淀的CS置于50℃真空干燥箱干燥，最后將干燥好的CS研碎成小顆粒[6-10]，供促創(chuàng)面愈合試驗(yàn)之用。試驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)3個(gè)單因素試驗(yàn)(酶解溫度、酶用量、酶解pH值)，每個(gè)因素篩選3個(gè)高CS純度的水平值，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，探索最優(yōu)的酶解提取工藝組合。

公式說明：CS中葡萄糖醛酸占45.12%。

1.2.8促創(chuàng)面愈合 鱘魚軟骨提取物用雙蒸餾水溶解，配制成80 mg/mL的鱘魚軟骨素提取物水溶液；空白對(duì)照組用生理鹽水。小白鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，剪毛處理，碘伏消毒，在小白鼠頸背部中央制造4個(gè)縱行長(zhǎng)1 cm的皮膚全層切口，左側(cè)和右側(cè)各2個(gè)創(chuàng)口，單只分籠飼養(yǎng)，建立損傷模型。模型建立后，小白鼠右側(cè)創(chuàng)口用鱘魚軟骨提取物水溶液，按每只0.1 mL的劑量涂抹于相應(yīng)組小白鼠的創(chuàng)口(外延至2.0～3.0 mm，厚度約0.5 mm)，左側(cè)創(chuàng)口涂生理鹽水，然后兩側(cè)創(chuàng)口均涂抹紅霉素軟膏，共持續(xù)觀察21 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1酶解溫度 為了探討不同酶解溫度對(duì)CS純度的影響，按照CS提取純化的步驟(1.2.7)，酶解的溫度分別設(shè)為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 酶解溫度對(duì)CS純度的影響

由表1可以看出，酶解溫度在40℃時(shí)提取的CS純度最高，CS純度較高的3個(gè)酶解溫度為40℃、50℃、60℃。

2.1.2酶解pH值 為了探討不同酶解pH值對(duì)CS純度的影響，按照CS提取純化的步驟1.2.7，酶解的pH值分別設(shè)為6.7、7.2、7.7、8.2、8.7、9.2、9.7進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，酶解pH值在8.2時(shí)CS純度最高，CS純度較高的3個(gè)酶解pH值為7.7、8.2、8.7。

表2 酶解pH值對(duì)CS純度的影響

2.1.3酶的用量 為了探討不同酶的使用量對(duì)CS純度的影響，按照提取純化的步驟1.2.7，酶的用量分別設(shè)為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 酶的用量對(duì)CS純度的影響

由表3可以看出，酶的用量在0.5%時(shí)CS純度最高,CS純度較高的3個(gè)酶量為0.3%、0.5%、0.7%。

2.2 正交試驗(yàn)

為了篩選出最優(yōu)的酶解提取CS工藝組合，采用正交試驗(yàn)法篩選最佳提取工藝。根據(jù)單因素試驗(yàn)的酶解溫度取40℃、50℃、60℃ 三個(gè)水平，酶量取0.3%、0.5%、0.7% 三個(gè)水平，酶解pH值取7.7、8.2、8.7 三個(gè)水平。以CS純度為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)(表4)。

表4 正交試驗(yàn)各處理的酶解溫度、酶量及酶解pH值

將樣品1～9進(jìn)行CS純度測(cè)定，其純度計(jì)算結(jié)果見表5。

將正交試驗(yàn)結(jié)果通過DPS軟件進(jìn)行方差分析，可得影響CS純度的最重要因素是酶解溫度，次要因素是酶量與酶解pH值。再通過均值的比較發(fā)現(xiàn)，酶解溫度40℃、酶量0.5%、酶解pH值在8.2時(shí)，CS的純度最高，為59.07%。

表5 不同因素不同水平對(duì)史氏鱘魚CS純度的影響

2.3 創(chuàng)面愈合觀察

術(shù)后于第5 d、10 d、15 d、20 d觀察記錄創(chuàng)口的出血量及局部情況，創(chuàng)口愈合時(shí)間及愈合創(chuàng)面的特征(表6、圖1、圖2、圖3)。試驗(yàn)結(jié)果表明，用鱘魚軟骨提取物水溶液涂抹的小白鼠創(chuàng)口比用生理鹽水涂抹的早愈合，生成的疤痕不明顯，再生皮膚光滑如常；給藥后15 d創(chuàng)口愈合，給藥后20 d創(chuàng)口皮膚有毛發(fā)新生；生理鹽水涂抹處理的創(chuàng)口愈合較晚，再生皮膚較粗糙，無毛發(fā)生長(zhǎng)。

表6 小白鼠創(chuàng)口愈合情況 (單位： mm)

注：*表示與CK相比差異達(dá)顯著水平，**表示與CK相比差異達(dá)極顯著水平。

3 結(jié)論與討論

鱘魚全身是寶，肉質(zhì)鮮美，尤其是鱘魚的頭、脊索、鰭中軟骨占魚體的10%左右，為硫酸軟骨素的開發(fā)提供了豐富的來源。我國(guó)已成為世界鱘魚第一養(yǎng)殖大國(guó)，故以鱘魚軟骨為原料提取硫酸軟骨素可有效緩解鯊魚資源枯竭帶來的危機(jī)，有利于保護(hù)珍稀動(dòng)物[11]。

圖1 給藥后10 d創(chuàng)口愈合情況

圖2 給藥后15 d創(chuàng)口愈合情況

圖3 給藥后20 d 創(chuàng)口愈合情況

研究表明，硫酸軟骨素在心血管疾病、關(guān)節(jié)病的防治方面具有一定療效，其保健藥品常見用于防止冠心病、心絞痛、心肌梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血等疾病的發(fā)生，能顯著降低冠心病患者的發(fā)病率和死亡率，對(duì)腫瘤也具有抑制作用；硫酸軟骨素也是國(guó)內(nèi)外流行的化妝品和醫(yī)藥品的重要原料。目前，家畜、鯊魚類的動(dòng)物是主要的軟骨來源。但家畜的軟骨產(chǎn)量很低，鯊魚多是靠天然捕獲，其來源受到資源的限制以及季節(jié)的影響[12]。

本試驗(yàn)在已有報(bào)道的堿提-酶解法的基礎(chǔ)上，借鑒前人的優(yōu)化提取工藝(堿提工藝)——倍量6%NaOH為溶劑，于40℃的水浴中攪拌提取4 h[5]，選擇還未系統(tǒng)研究的酶解工藝進(jìn)行工藝優(yōu)化研究。經(jīng)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，進(jìn)行硫酸軟骨素的酶解方法優(yōu)化試驗(yàn)，表明在酶解溫度40℃、酶量0.5%、酶解pH值8.2時(shí)，硫酸軟骨素的純度最高，為59.07%，高于前人40.65%的研究結(jié)果[6]。

本試驗(yàn)在前期提取工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化后獲得鱘魚軟骨提取物(主要成分為硫酸軟骨素)。據(jù)查詢，以鱘魚軟骨提取物進(jìn)行促創(chuàng)面愈合研究尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)提取物的促創(chuàng)面愈合效果進(jìn)行了小白鼠活體試驗(yàn)。經(jīng)過20 d 的觀察，發(fā)現(xiàn)鱘魚軟骨提取物能夠有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合，并促使小白鼠毛發(fā)再生，這可能與硫酸軟骨素具有抗炎鎮(zhèn)痛作用有關(guān)[13]。

關(guān)于硫酸軟骨素的促傷口愈合的報(bào)道僅見使用小豬皮提取的膠原與葡甘聚糖和硫酸軟骨素復(fù)合改性制成復(fù)合膜[14]，蘆薈凝膠的膠原—?dú)ぞ厶恰蛩彳浌撬厝15]對(duì)皮膚缺損及三度燒傷的創(chuàng)面治療的研究報(bào)道，認(rèn)為膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，硫酸軟骨素等多糖作為大分子基質(zhì)成分除了可促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)皮膚再生、無紅腫熱痛的作用外，也可能通過表達(dá)過氧化物歧化酶清除創(chuàng)口內(nèi)自由基，減少促炎性因子，如TNF家族、IL家族等的生成，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。本研究觀察到鱘魚軟骨提取物具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，具體的作用機(jī)制有待后續(xù)研究。

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