胃癌熒光分子成像診斷研究進(jìn)展

賀 玲 綜述 劉海峰 審校

胃癌熒光分子成像診斷研究進(jìn)展

賀 玲 綜述 劉海峰 審校

熒光分子成像；胃癌；探針

早期胃癌及癌前病變的篩查與檢測(cè)主要依賴白光內(nèi)鏡觀察病變及活檢后的病理定性，而多數(shù)早癌形態(tài)變化不明顯，且病變活檢定位又缺乏準(zhǔn)確性，漏診率很高[1]。隨著消化內(nèi)鏡新技術(shù)的不斷發(fā)展,各種特殊內(nèi)鏡，如窄譜成像內(nèi)鏡(narrow band imaging，NBI)、智能分光比色技術(shù)(fuji intelligent chromo endoscopy，F(xiàn)ICE)、放大內(nèi)鏡、超聲內(nèi)鏡等應(yīng)用于臨床。這些技術(shù)通過(guò)強(qiáng)化病變部位黏膜表面構(gòu)造、增強(qiáng)光學(xué)對(duì)比度，使病灶與正常黏膜的對(duì)比更加明顯。但目前仍缺乏大數(shù)據(jù)證明這些成像方式對(duì)病變檢出率優(yōu)于高分辨率白光內(nèi)鏡[2,3]。因此，我們亟需創(chuàng)新性的診斷篩查方式，熒光分子成像為我們提供了新的思路。

1 熒光分子成像的優(yōu)勢(shì)

將熒光分子成像與消化內(nèi)鏡融合形成的熒光內(nèi)窺成像技術(shù)，利用熒光標(biāo)記的探針在分子信號(hào)基礎(chǔ)上特異性使腫瘤病變發(fā)光，能在分子水平而非形態(tài)學(xué)水平識(shí)別和描述病變?cè)隗w的黏膜特征[4,5]。在白光內(nèi)鏡還未發(fā)現(xiàn)早期腫瘤病變時(shí)，分子標(biāo)志物就能幫助區(qū)分正常黏膜和早期腫瘤病變，實(shí)現(xiàn)可疑病變的靶向性活檢,從而提高內(nèi)鏡下病變的檢出率[6]，有望成為消化道早癌檢測(cè)技術(shù)的新突破。為什么選擇熒光分子成像與消化內(nèi)鏡結(jié)合？首先，該成像方式具有快捷簡(jiǎn)便、無(wú)輻射、可短期重復(fù)檢查、對(duì)腫瘤的成像靈敏度可達(dá)毫米級(jí)等優(yōu)點(diǎn)[7]；其次，消化道為一天然暗箱，為熒光內(nèi)窺成像提供了絕佳條件；另外，消化道腫瘤絕大部分起源于黏膜層，內(nèi)窺成像模式完美地避開了熒光穿透性弱及空間分辨率低的缺點(diǎn)。要想實(shí)現(xiàn)熒光分子內(nèi)窺成像在消化道早期癌診斷中的臨床轉(zhuǎn)化需從兩方面著手，第一，需要能夠與腫瘤病變特異性結(jié)合的探針使病變發(fā)光；第二，需要相應(yīng)的熒光內(nèi)窺設(shè)備來(lái)激發(fā)和捕捉病變部位發(fā)出的熒光。目前，胃癌的熒光分子成像依舊處于臨床前研究階段。本文主要圍繞胃癌熒光分子成像中的設(shè)備和靶向性熒光分子探針兩個(gè)方面進(jìn)行綜述。

2 光學(xué)設(shè)備

在臨床應(yīng)用中，熒光內(nèi)鏡診斷病變的理想模式分宏觀和微觀兩步，黏膜表面噴灑或靜脈注射熒光探針后，先采用寬視場(chǎng)熒光內(nèi)窺鏡快速篩選大片黏膜確定發(fā)光的可疑病變區(qū)域，接著利用熒光顯微內(nèi)鏡進(jìn)一步對(duì)發(fā)光病變放大定性，并在亞細(xì)胞水平可視化結(jié)合到各自靶點(diǎn)的分子探針[8]。目前，寬視場(chǎng)熒光內(nèi)窺設(shè)備均是自制的實(shí)驗(yàn)室原理樣機(jī)，還未實(shí)現(xiàn)商品化[9,10]。熒光顯微成像中有共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)實(shí)現(xiàn)了商品化且已應(yīng)用于臨床，CLE將熒光顯微成像整合到內(nèi)鏡檢查中，利用熒光探針可獲得組織放大1000倍的光學(xué)顯微圖像，可在胃鏡操作中對(duì)黏膜進(jìn)行細(xì)胞及亞細(xì)胞水平觀察，成像效果與病理HE染色(haematoxylin and eosin staining)有良好相關(guān)性[8]，有“光學(xué)活檢”的美譽(yù)。臨床所用CLE有兩種，一種是日本賓得(Pentax)公司的內(nèi)鏡整合式CLE(endoscopeintegrated CLE，eCLE)，將微型共聚焦顯微鏡內(nèi)置在白光內(nèi)鏡頭端，可調(diào)節(jié)組織成像平面深度(表層至250 μm)，分辨率為7μm，拍攝速度1幀/s。另一種是法國(guó)莫納克亞公司(Mauna Kea Technologies)的探頭式CLE(probe based CLE，pCLE)，能夠通過(guò)消化內(nèi)鏡的工作通道抵達(dá)黏膜，操作靈活，實(shí)用性好，成像速度較快(12幀/s)，實(shí)現(xiàn)了視頻記錄，但成像深度固定且成像視野較eCLE小。pCLE的迷你探頭有不同的外徑和分辨率，可與各種內(nèi)鏡匹配，除了在腔體結(jié)構(gòu)(食管、胃、結(jié)腸)，另在導(dǎo)管結(jié)構(gòu)(膽管、胰管)、呼吸系統(tǒng)(肺、支氣管)、泌尿系統(tǒng)(尿道、膀胱)均有涉獵，更有細(xì)針型CLE(needle based CLE，nCLE)能通過(guò)19 G(0.91 mm)的穿刺針，可謂是無(wú)孔不入。兩種設(shè)備的激發(fā)光均為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)505～585nm[8,11,12]。

3 靶向熒光分子探針

靶向熒光分子探針通常由信號(hào)組件和親和組件組成。信號(hào)組件指能產(chǎn)生熒光信號(hào)的標(biāo)記部分(如有機(jī)熒光染料、量子點(diǎn)等)，親和組件也可稱為靶標(biāo)，是與生物靶點(diǎn)特異性結(jié)合的部分(如抗體、短肽、核酸適體等)。生物靶點(diǎn)在病變細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)過(guò)表達(dá)，比如胃癌特異性抗原(MG7、MGb2)[13,14]，細(xì)胞表面的一些特異性受體(如表皮生長(zhǎng)因子受體[15]、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體[16])等。分子靶點(diǎn)與光學(xué)活性探針作用后發(fā)出熒光信號(hào)，凸顯出腫瘤病變。根據(jù)靶標(biāo)的不同，可將熒光分子探針劃分為抗體探針、短肽探針、適體探針、可激活探針[8]。

3.1 抗體探針 抗體提供了廣泛的靶標(biāo)多樣性，與靶點(diǎn)有較高的親和力，是細(xì)胞外靶點(diǎn)或細(xì)胞表面受體的理想成像探針，其標(biāo)記很好構(gòu)建。另外，腫瘤分子靶向藥中治療性單克隆抗體更是一類有吸引力的靶標(biāo)，在分子診斷成像同時(shí)還能指導(dǎo)腫瘤的靶向治療[17]。西妥昔單抗是臨床用于治療高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)結(jié)直腸癌患者的分子靶向藥。2012年，Hoetker等[18]用熒光染料AlexaFlour488標(biāo)記西妥昔單抗構(gòu)建了靶向EGFR的熒光探針，經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠胃癌皮下移植瘤模型體內(nèi),利用CLE在荷瘤鼠瘤體上觀察到西妥昔單抗組熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(P=0.047)，并在亞細(xì)胞水平定位了EGFR的分布。MG7抗原是解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)課題組發(fā)現(xiàn)的一種特異性較高的胃癌相關(guān)抗原，在胃癌組織中表達(dá)率高達(dá)94%，在胃癌患者血清中的檢出率為83.6%，主要位于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和腺體，是極具早期診斷價(jià)值的胃癌分子標(biāo)志物[13]。2013年，Li Z等[13]將AlexaFlour488標(biāo)記的抗MG7單克隆抗體與新鮮人胃癌組織及正常胃組織體外共孵育后利用CLE檢測(cè)，結(jié)果顯示23例胃癌組織標(biāo)本中22例有特異性熒光信號(hào)，而非癌組織標(biāo)本則無(wú)或僅有弱熒光信號(hào)(P<0.001)?？贵w作為探針仍有不足之處：分子量較大，擴(kuò)散緩慢，到達(dá)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的時(shí)間較長(zhǎng)；有潛在的免疫原性；血清半衰期長(zhǎng)，全身應(yīng)用后易在體內(nèi)積累，增加了背景噪音，降低了信噪比[17]。

3.2 短肽探針 相對(duì)抗體而言，短肽由少數(shù)氨基酸組成，具有分子量小、組織穿透力強(qiáng)、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，是另一類常用的靶向性熒光探針[19]。在過(guò)去的幾十年，從噬菌體展示肽庫(kù)(109)中篩選特異性靶向短肽配體有了大量研究。2013年，Xin J等[20]用新合成的對(duì)稱花青染料(CyIC)標(biāo)記胃癌血管靶向肽GX1(該實(shí)驗(yàn)室前期從隨機(jī)噬菌體肽庫(kù)中篩選出了與人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的環(huán)形九肽CGNSNPKSC[21])，構(gòu)建了新型胃癌靶向熒光探針CyIC-GX1，小動(dòng)物活體成像結(jié)果證明該探針對(duì)胃癌組織具有良好的靶向性，且細(xì)胞毒性低、光穩(wěn)定性好。2015年Liu L等[22]從噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫(kù)篩選出了能特異性識(shí)別胃癌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的短肽CTKNSYLMC(GEBP11)，利用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記GEBP11，構(gòu)建探針FITC-GEBP11，經(jīng)人胃癌裸鼠皮下及原位移植瘤模型尾靜脈注射該探針后24 h進(jìn)行CLE在體成像，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比兩種小鼠模型瘤體處均有明顯的熒光信號(hào)(P<0.05)；將人胃癌組織與FITC-GEBP11孵育，離體組織CLE成像顯示28例胃癌標(biāo)本中26例表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的熒光。另有研究篩選出了靶向CD44的短肽RP-1，與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(c-Met蛋白)穩(wěn)定結(jié)合的新型大環(huán)肽aML5-FL，并用熒光染料標(biāo)記構(gòu)建相應(yīng)探針，成功完成了人胃癌細(xì)胞，人胃癌裸鼠皮下移植瘤的熒光分子成像[23,16]。雖大多數(shù)短肽探針沒有明確對(duì)應(yīng)的生物靶點(diǎn)，但通過(guò)與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的熒光檢測(cè)，完全可以進(jìn)行疾病的診斷。

3.3 核酸適體探針 核酸適體是從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)經(jīng)體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選出的能特異性結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的單鏈核苷酸片段(ssDNA或RNA)[24]。與短肽相似，因其分子量小，所以具有更加理想的藥代動(dòng)力及組織分布特性，同時(shí)體外篩選成本低、周期短、易于合成修飾，與靶分子結(jié)合條件可控，靶標(biāo)物質(zhì)范圍廣泛(如有機(jī)小分子、蛋白質(zhì)、病毒甚至細(xì)胞等)，是新一代理想探針之一[25]。對(duì)比短肽文庫(kù)，篩選適體的寡核苷酸文庫(kù)通常數(shù)目體積更大(1016)。上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)在許多固體腫瘤中過(guò)表達(dá)，在腫瘤診斷成像、預(yù)后、治療應(yīng)用中是一個(gè)較為理想的靶點(diǎn)[26]。2013年，Song Y等[27]用SELEX技術(shù)得到了一組特異性識(shí)別EpCAM及EpCAM表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的ssDNA適體SYL3C。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，SYL3C能在多種細(xì)胞混合液中特異性識(shí)別表達(dá)EpCAM的腫瘤細(xì)胞，用FITC標(biāo)記SYL3C與胃癌細(xì)胞孵育后，共聚焦熒光顯微鏡觀察到人胃癌細(xì)胞表面有較強(qiáng)的熒光。另一研究利用胃癌細(xì)胞AGS作為靶細(xì)胞，經(jīng)cell-SELEX技術(shù)，從最終富集的ssDNA池得到一個(gè)胃癌細(xì)胞特異性DNA適體(cy-apt20)，經(jīng)人胃癌荷瘤鼠模型尾靜脈注射熒光染料Cy5標(biāo)記的cy-apt20 60min后，在腫瘤位點(diǎn)探測(cè)到的熒光強(qiáng)度約為對(duì)照組5倍，證實(shí)適體cy-apt20有作為胃癌靶向分子探針的潛力[28]。此外，還有科研團(tuán)隊(duì)篩選出與HGC27細(xì)胞親和力和特異性最高的適體AGC03，將羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的AGC03與各種胃癌細(xì)胞、非胃癌細(xì)胞孵育。結(jié)果顯示AGC03同其他胃癌細(xì)胞系(BGC823, MGC803和SGC7901)也有結(jié)合能力，且親和力高，與起源于其他組織的腫瘤細(xì)胞(如肺癌、肝癌)無(wú)結(jié)合，該研究表明新興的適體探針對(duì)胃癌的臨床診斷和靶向治療有很好的促進(jìn)作用[29]。

3.4 “智能”探針 與以上幾種活化探針相比，“智能”探針具有可激活的特點(diǎn)，它們開始為失活狀態(tài)，只有當(dāng)特定的靶物質(zhì)存在時(shí)才能被激活產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而具有比其它探針更高的信號(hào)背景比[17]。其靶點(diǎn)多為腫瘤過(guò)表達(dá)的酶類，靶標(biāo)為對(duì)應(yīng)的底物。2012年，Ding S等[30]利用商業(yè)化的組織蛋白酶可激活探針ProSense?680和基質(zhì)金屬蛋白酶可激活探針MMPSense?750FAST，對(duì)Smad4+/-裸鼠原位胃癌移植瘤模型進(jìn)行在體熒光成像，在腫瘤感興趣區(qū)域探測(cè)到熒光強(qiáng)度分別是對(duì)照組的1.8倍和2.2倍。目前，“智能”探針文獻(xiàn)報(bào)道的種類較少，但這種具有創(chuàng)新性的“可激活”理念，能實(shí)現(xiàn)更佳的成像信噪比，相信未來(lái)科學(xué)家們定會(huì)致力于開發(fā)新型高效的熒光激活探針。

3.5 納米探針 為綜合多種分子影像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，基于納米探針的多模態(tài)成像應(yīng)運(yùn)而生,研究者對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行多重標(biāo)記后可利用不同成像方式檢測(cè)腫瘤病變。上海交大科研團(tuán)隊(duì)證實(shí)乳腺癌相關(guān)抗原1(breast cancer related antigen 1，BRCAA1)約在65%的人胃癌組織中過(guò)表達(dá)，將其作為靶點(diǎn)成功構(gòu)建了抗BRCAA1單抗耦合熒光磁性納米顆粒(FMNPs)的納米探針(抗BRCAA1-FMNPs)，完成了荷瘤鼠模型中胃癌組織(直徑約5 mm)的熒光/磁共振雙模態(tài)診斷成像[31]。另外，Wang P等[32]利用致密納米二氧化硅(dSiO2)包裹超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)形成殼-核納米顆粒，然后在殼外耦聯(lián)抗CD146單抗(YY146)和熒光染料800ZW構(gòu)建了納米探針800ZW-SPION@dSiO2-YY146，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該納米探針與胃癌細(xì)胞的結(jié)合能力是對(duì)照組的14倍，經(jīng)尾靜脈注射探針至胃癌皮下荷瘤鼠體內(nèi)，利用小動(dòng)物活體成像儀觀察，發(fā)現(xiàn)注射探針后30 min能觀察到瘤體的熒光，24 h達(dá)峰值，同時(shí)在瘤體部位能檢測(cè)強(qiáng)烈的磁共振信號(hào)。GEBP11作為靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的短肽，Su T等[33]利用其對(duì)胃癌組織的靶向特異性，構(gòu)建了熒光/磁共振雙模態(tài)納米探針Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNP(CGD-MNP)，同樣體內(nèi)熒光/磁共振成像顯示CGD-MNP在SGC-7901荷瘤鼠模型中成功可視化了腫瘤血管生成。基于雙模態(tài)的納米探針分子成像，集合了核磁共振成像高空間分辨率以及光學(xué)成像高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，彼此取長(zhǎng)補(bǔ)短，能夠更加精準(zhǔn)的對(duì)病變進(jìn)行診斷。除磁共振成像外，熒光成像還可以與正電子發(fā)射斷層掃描成像[34]、超聲成像等[35,36]其他成像方式結(jié)合應(yīng)用，多模態(tài)分子成像從多角度、多維度觀察病變的生理過(guò)程，為臨床診斷提供更全面的影像學(xué)信息，會(huì)成為未來(lái)腫瘤分子診斷成像的一個(gè)重要方向。

雖然熒光分子成像在胃癌診斷中取得了大量臨床前研究成果，但要向臨床轉(zhuǎn)化，依舊任重道遠(yuǎn)。應(yīng)用于臨床的理想靶向探針應(yīng)該毒性低、穩(wěn)定性好、生物相容性好、特異性高、靈敏度高，并且適合大批量合成、生產(chǎn)[37]。然而，現(xiàn)階段的胃癌靶向性熒光分子探針離以上要求尚遠(yuǎn)，故日后研發(fā)靶向性胃癌熒光分子探針時(shí)，不僅需要提高其靶向性，也需要應(yīng)用多種新型材料、完善合成方法與檢測(cè)方法來(lái)合成滿足臨床需求的靶向性胃癌熒光探針。現(xiàn)今，食管和結(jié)腸病變的熒光分子成像已有人在體研究成果報(bào)道[38,39]。相信在不久的將來(lái)，胃癌熒光分子診斷技術(shù)也會(huì)有突破性進(jìn)展。

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(2016-11-08收稿 2017-01-19修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

本刊“臨床病例討論”欄目征稿通知

為了貫徹“面向部隊(duì)，服務(wù)基層”的辦刊宗旨，加強(qiáng)不同層次醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)踐交流，幫助基層醫(yī)師學(xué)習(xí)和了解先進(jìn)教學(xué)醫(yī)院和知名專家對(duì)疾病的臨床診治思路,提高基層衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的臨床業(yè)務(wù)水平。本刊于2012年開辟“臨床病例討論”欄目。報(bào)道武警部隊(duì)各級(jí)醫(yī)院及重點(diǎn)學(xué)科臨床工作中遇到的疑難和典型病例，以及基層衛(wèi)生隊(duì)經(jīng)過(guò)多學(xué)科專家遠(yuǎn)程會(huì)診得以成功治療的典型病例。

1.病例選擇： (1)選擇的病例要具有代表性且不涉及醫(yī)院敏感問(wèn)題，優(yōu)先錄取多學(xué)科交叉病例；(2) 診斷明確，但病情危重、治療棘手的病例；(3) 罕見病例。以上病例須最終獲得明確診斷或成功治療，臨床資料應(yīng)齊全，能提供實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)和病理確診依據(jù)。

2.寫作格式： 正文分“病例介紹”和“臨床討論”兩部分。病例介紹：交代清楚患者主訴、病史(包括既往史)，實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)及病理學(xué)檢查結(jié)果、臨床診斷、治療方案、治療結(jié)果等(需要提供影像學(xué)檢查的圖片)。臨床討論：為主體內(nèi)容，首先提出目前病例診斷治療的進(jìn)展和需要解決的問(wèn)題等討論要點(diǎn)；之后由參加會(huì)診的知名專家點(diǎn)評(píng)，寫清診斷和治療思路、鑒別診斷要點(diǎn)、治療上應(yīng)注意的問(wèn)題等，為今后的臨床工作提供借鑒和參考。若為罕見病，則介紹目前國(guó)內(nèi)外的最新進(jìn)展。會(huì)診專家需署名(如無(wú)外請(qǐng)專家，也可署本院科主任名)，格式如：張某某醫(yī)師(肝膽科)。具體行文格式參考本欄目已發(fā)表的論文格式。全文字?jǐn)?shù)3800或6500左右。

來(lái)稿請(qǐng)?jiān)谟疑辖菢?biāo)注“臨床病例討論”。本欄目所錄稿件為原創(chuàng)性臨床研究論文，歡迎廣大臨床醫(yī)師踴躍投稿！

武警醫(yī)學(xué)編輯部

2017年1月

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81471700)

賀 玲，碩士研究生。

100039 北京，武警總醫(yī)院消化內(nèi)科

劉海峰，E-mail:haifengliu333@163.com

R753.2