鈣調(diào)激酶Ⅱ抑制劑在異動癥發(fā)生中的分子機制研究

朱忠方，丁喜晴，楊新新，崔桂云，花放，沈霞

·論著·

鈣調(diào)激酶Ⅱ抑制劑在異動癥發(fā)生中的分子機制研究

朱忠方，丁喜晴，楊新新，崔桂云，花放，沈霞

目的 探討鈣調(diào)激酶Ⅱ(CaMKⅡ)抑制劑在異動癥發(fā)生中的分子機制。方法 采用6-羥多巴胺立體定向注射至小鼠右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束制備偏側(cè)帕金森病(PD)小鼠模型，將造模成功的PD小鼠分為PD組(n=11)、KN-92組(n=11)和KN-93組(n=11)，并設(shè)假手術(shù)組(n=10)(在相同部位注射生理鹽水作為對照)。KN-92組和KN-93組給予左旋多巴(15 mg/kg) 和芐絲肼 (12 mg/kg) 腹腔注射，假手術(shù)組及PD組注射等量的生理鹽水，1次/d，持續(xù)14 d。在第11 d、12 d左旋多巴給藥前，KN-92組紋狀體給予KN-92處理，KN-93組紋狀體給予K-93處理(2 μl，濃度0.1 μg/μl)，假手術(shù)組及PD組給予等量生理鹽水處理。在給藥的第1 d、3 d、5 d、8 d、10 d、13 d行異常不自主運動(AIM)評分。在給藥的第4 d、9 d、14 d行左前肢使用率的評價。采用Western blot法檢測損傷側(cè)紋狀體區(qū)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、多巴胺和環(huán)磷腺苷調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)及其磷酸化水平變化情況。 結(jié)果 假手術(shù)組治療前后左前肢使用率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PD組給藥后左前肢使用率逐漸下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，KN-92組和KN-93組給藥后左前肢使用率逐漸升高，與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。PD組、KN-92組和KN-93組給藥前左前肢使用率兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PD組、KN-92組和KN-93組小鼠治療前及治療第4 d、9 d左前肢使用率均顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，PD組、KN-92組治療第14 d左前肢使用率均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，KN-93組治療第14 d左前肢使用率與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與PD組比較，KN-92組治療第4 d、9 d、14 d及KN-93組治療第4 d、9 d左前肢使用率顯著升高(均P<0.01)。與KN-92組比較，KN-93組第14 d左前肢使用率顯著升高(P<0.01)。KN-93組、KN-92組小鼠治療后第1 d、3 d、5 d、8 d、10 d AIM評分呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。治療后第14 d，KN-93組AIM評分明顯低于KN-92組(P<0.01)，治療后第1 d、3 d、5 d、8 d、10 d，KN-93組AIM評分與KN-92組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與假手術(shù)組比較，PD組及KN-93組p-DARPP-32及p-CREB水平顯著降低(均P<0.01)，KN-92組p-DARPP-32及p-CREB水平顯著升高(均P<0.01)。與PD組比較，KN-92組p-DARPP-32及p-CREB水平顯著升高(均P<0.01)，KN-93組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。KN-93組p-DARPP-32及p-CREB水平明顯低于KN-92組(均P<0.01)。結(jié)論 左旋多巴誘發(fā)的異動癥可能與CaMKⅡ有關(guān)，其抑制劑KN-93可能是治療PD引發(fā)的運動并發(fā)癥的一種新的治療方式。

帕金森??；運動并發(fā)癥；磷酸化；鈣調(diào)激酶Ⅱ；KN-93

帕金森病(PD)又名震顫麻痹，是一種常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病[1]。PD的病因尚未完全明確，可能與年齡老化、環(huán)境因素、遺傳因素、氧化應(yīng)激、自由基生成、興奮性氨基酸毒性、免疫異常、細(xì)胞凋亡等因素相關(guān)[2]。左旋多巴替代療法是PD治療發(fā)展史上一重要的里程碑[3]。然而左旋多巴治療PD的“蜜月期”是短暫的，一般是2～5年，之后會出現(xiàn)左旋多巴誘導(dǎo)的異動癥(LID)。新近的研究[4]發(fā)現(xiàn)，由鈣調(diào)激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)引起的磷酸化后的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)，它引發(fā)的基因表達可加強長時程記憶的形成。LID的發(fā)生與左旋多巴長期治療誘發(fā)的皮質(zhì)紋狀體病理性長時程增強(LTP)形成密切相關(guān)[5]。同時一些研究[6]也發(fā)現(xiàn)，紋狀體環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴性蛋白激酶A(PKA)通路和其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白多巴胺和環(huán)磷腺苷調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)的活化參與了LID的發(fā)生。KN-93是其特異性抑制劑，KN-92是KN-93的無功能結(jié)構(gòu)類似物。本實驗通過檢測CaMK Ⅱ抑制劑對LID小鼠模型紋狀體中CREB、DARPP-32及其磷酸化表達的變化情況，進一步探討CaMK Ⅱ在LID發(fā)生中的作用機制。

1 材料與方法

1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量約25 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。將10只小鼠分為假手術(shù)組，其余小鼠進行PD造模。

1.1.2 主要試劑及儀器 6-羥基多巴、左旋多巴、芐絲肼(Sigma公司)，維生素C、KN-93、KN-92(Cayman Chemical Company)；兔源性單克隆抗體磷酸化多巴胺和環(huán)磷腺苷調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白-32(p-DARPP-32)、DARPP-32、磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)、CREB(CST公司，美國)；抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(Vicmed公司)、山羊抗兔二抗(美國LI-COR公司)；SDS-凝膠快速配置試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)；KOPF 腦立體定向儀(徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)實驗室，購于美國 KOPF 公司)；電泳儀與電轉(zhuǎn)膜儀(徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)實驗室，購于Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組 10%的水合氯醛(0.004 ml/g)腹腔注射將小鼠麻醉后，嚴(yán)格平顱位固定于小鼠腦立體定向儀上，確定紋狀體坐標(biāo)[7]：(1)前囟前1.0 mm，矢狀縫左側(cè)2.1 mm，顱骨骨膜下2.9 mm；(2)前囟前0.3 mm，矢狀縫左側(cè)2.3 mm，顱骨骨膜下2.9 mm。注射器針頭鉆孔，造模小鼠用10 μl的微量注射器抽取6-羥基多巴4 μl(0.2%維生素C配置，濃度3 μg/μl)[8]，每點注射2 μl。為減少組織損傷，進針?biāo)俣葹?.5 μl/min，留針10 min后退針縫合創(chuàng)口。假手術(shù)組在相同坐標(biāo)注射等量的無菌生理鹽水。注射4周后，行圓柱體實驗評分，具體如下：小鼠被放在一個直徑10 cm，高14 cm的圓柱體玻璃瓶中觀察5 min，記錄每只小鼠右爪或左爪及兩爪同時碰壁的次數(shù)，只有完全碰壁時才可以被計數(shù)。最后以損傷側(cè)(即左側(cè))前爪碰壁次數(shù)與總兩爪同時碰壁次數(shù)的比值作為對損傷功能的測定來篩選PD小鼠。損傷對側(cè)爪貼壁與共同使用兩爪貼壁的次數(shù)比值小于40%的小鼠即為成功PD模型。將造模成功的PD小鼠隨機分為PD組(n=11)、KN-92組(n=11)和KN-93組(n=11)。

1.2.2 給藥方法 KN-93組及KN-92組小鼠于每天上午9點將左旋多巴(15 mg/kg)和芐絲肼(12 mg/kg)溶于含0.2%維生素C的消毒生理鹽水中進行腹腔注射，每日1次，持續(xù)14 d；假手術(shù)組及PD組腹腔注射等量生理鹽水。于第11 d、12 d給予腹腔注射左旋多巴后，KN-93組小鼠通過立體定向?qū)p傷側(cè)紋狀體注射KN-93(溶于生理鹽水，濃度0.1 μg/μl，注射2 μl),KN-92組小鼠同時注射同體積KN-92(溶于生理鹽水，濃度0.1 μg/μl，注射2 μl)，坐標(biāo)為前囟前0.5 mm，矢狀縫左側(cè)2.0 mm，顱骨骨膜下2.5 mm[7]。假手術(shù)組及PD組小鼠腹腔及紋狀體給予同體積生理鹽水。

1.2.3 行為學(xué)觀察

1.2.3.1 左前肢使用率的評價 采用圓柱體實驗，于給藥前及給藥后第4 d、9 d、14 d時分別評價各組小鼠的左前肢使用率。小鼠被放在一個直徑10 cm，高14 cm的圓柱體玻璃瓶中觀察5 min，記錄每只老鼠右爪或左爪及兩爪同時碰壁的次數(shù)，只有完全碰壁才可以被計數(shù)。最后以損傷側(cè)(即左側(cè))前爪碰壁次數(shù)與總兩爪同時碰壁次數(shù)的比值作為左前肢使用率的測定。

1.2.3.2 不自主運動的評價 于造模后第1 d、3 d、5 d、8 d、10 d、13 d給藥后2 h每隔20 min對小鼠進行1次異常不自主運動(AIM)評分[9]，每次觀察1 min，AIM評分按觀察時間內(nèi)總積分的平均數(shù)進行統(tǒng)計。AIM分成3個部分(上肢AIM、口面部AIM、軸性AIM)進行評定，每部分又根據(jù)其有無和嚴(yán)重程度分為5個等級：(1)0級：無；(2)1級：AIM存在不到觀察時間的50%；(3)2級：AIM存在大于觀察時間的50%；(4)3級：持續(xù)存在，刺激使之停止；(5)4級：持續(xù)存在，刺激不能使之停止。另外根據(jù)肢體和軸向運動障礙的幅度，再分為0～4個等級：(1)軸向的AIM的幅度是由動物的頸部及軀干從小鼠軀體的縱向軸線的橫向偏離(或扭轉(zhuǎn))程度來定：①1級：頭頸部扭轉(zhuǎn)在0°～30°；②2級：頭頸部扭轉(zhuǎn)在30°～60°；③3級：頭頸部、軀干上部扭轉(zhuǎn)在60°～90°；④4級：頭頸軀干扭轉(zhuǎn)>90°，失去平衡。(2)肢體的AIM的振幅是基于四肢活動的程度和近端肌肉群的收縮程度：①1級：上肢遠(yuǎn)端和爪有輕微震顫；②2級：近遠(yuǎn)側(cè)上肢有明顯的移動；③3級：整個上肢有明顯移動，并伴有肩部肌肉收縮；④4級：強烈的上肢和肩部大幅度的運動，有偏側(cè)投擲樣的特征。

1.2.4 紋狀體CREB及DARPP-32磷酸化水平的檢測 采用Western blot法檢測紋狀體部位CREB及DARPP-32磷酸化水平的表達。所有小鼠于第15 d斷頭處死，快速開顱取腦分離紋狀體。加入勻漿液(強裂解液+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑，其中裂解液的量為組織塊重量×4 μl，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑量∶裂解液量=1∶100)，用電動勻漿器勻漿，每勻漿10 s停頓30 s，重復(fù)2～3次。將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，15 000 r/min，4℃離心30 min，取上清，用BCA法蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，取樣本(10 μl)經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)轉(zhuǎn)印蛋白至NC(硝酸纖維素)膜，用封閉液室溫封閉1.5 h，加入CREB或p-CREB、DARPP-32或p-DARPP-32的兔抗溶液及抗β-actin的鼠抗溶液 (滴度均為1∶500)，4℃孵育過夜；洗后加山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗(1∶10 000)，室溫孵育1.5 h；洗后再移入Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)玻璃板上方，按照該機器使用說明設(shè)置參數(shù)，掃描條帶，顯示結(jié)果并進行圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組左前肢使用率的比較 見表1。假手術(shù)組治療前后左前肢使用率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PD組給藥后左前肢使用率逐漸下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，KN-93組給藥后左前肢使用率逐漸升高，治療后第14 d與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，KN-92組給藥前后左前肢使用率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PD組、KN-92組和KN-93組給藥前左前肢使用率兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PD組、KN-92組和KN-93組小鼠治療前及治療第4、9 d左前肢使用率均顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，PD組、KN-92組治療第14 d左前肢使用率均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，KN-93組治療第14 d左前肢使用率與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與PD組比較，KN-92組治療第4、9、14 d及KN-93組治療第4、9 d左前肢使用率顯著升高(均P<0.01)。與KN-92組比較，KN-93組第14 d左前肢使用率顯著升高(P<0.01)。

2.2 各組AIM評分的比較 見表2。各組治療前均無不自主運動，給藥后KN-93組、KN-92組小鼠出現(xiàn)不自主運動。KN-93組、KN-92組小鼠治療后第1、3、5、8、10 d AIM評分呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。治療后第14 d，KN-93組AIM評分明顯低于KN-92組(P<0.01)，治療后第1、3、5、8、10 d ，KN-93組AIM評分與KN-92組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 各組紋狀體CREB及DARPP-32磷酸化水平的比較 見表3。各組間CREB及DARPP-32水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與假手術(shù)組比較，PD組及KN-93組p-DARPP-32及p-CREB水平顯著降低(均P<0.01)，KN-92組p-DARPP-32及p-CREB水平顯著升高(均P<0.01)。與PD組比較，KN-92組p-DARPP-32及p-CREB水平顯著升高(均P<0.01)，KN-93組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。KN-93組p-DARPP-32及p-CREB水平明顯低于KN-92組(均P<0.01)。

表1 各組左前肢使用率的比較(x±s)組別例數(shù)治療前(%)治療后(%)第4d第9d第14dPD組1120.35±5.21#16.17±3.19*#11.00±4.95*#5.50±2.78*#KN-93組1120.62±3.69#23.56±4.37#△28.72±5.13#△33.18±5.89*#▲KN-92組1120.67±3.12#23.81±6.31#△29.56±5.32#△20.92±4.58△假手術(shù)組1033.46±5.4633.21±5.2033.32±4.8133.25±5.31 注:與治療前比較*P<0.01;與假手術(shù)組比較#P<0.05;與PD組比較△P<0.01;與KN-92組比較▲P<0.01

表2 各組AIM評分的比較(x±s)組別例數(shù)治療前治療后第1d第3d第5d第8d第10d第14dPD組110000000KN-93組11023.46±2.3463.43±4.03*98.86±3.04*135.43±6.32*147.46±3.64*32.43±4.62*△KN-92組11022.74±3.0664.02±6.35*97.57±4.37*136.68±5.46*162.35±3.01*156.75±4.76假手術(shù)組100000000 注:與前一個時間點比較*P<0.01;與KN-92組比較△P<0.01

表3 各組紋狀體CREB及DARPP-32磷酸化水平的比較(x±s,%)組別例數(shù)p-DARPP-32DARPP-32p-CREBCREBPD組116.77±3.84*54.91±3.197.11±4.24*43.48±4.29KN-93組119.84±2.19*△57.15±4.429.83±4.85*△43.14±5.21KN-92組1125.37±4.64*#54.91±4.1923.71±3.01*#43.66±3.07假手術(shù)組1014.27±4.2356.70±3.9516.64±3.5344.31±6.19 注:與假手術(shù)組比較*P<0.01;與PD組比較#P<0.01;與KN-92組比較△P<0.01

3 討 論

臨床研究[8]結(jié)果顯示，約有80%的PD患者在接受長期左旋多巴治療后出現(xiàn)運動并發(fā)癥，并且隨著治療時間的延長及疾病的加重，其發(fā)生率增加且發(fā)生的程度加重。本研究結(jié)果表明PD小鼠在接受波動性左旋多巴治療后AIM評分呈現(xiàn)逐漸升高后趨于平穩(wěn)的趨勢，這表明PD小鼠的AIM行為學(xué)與人類PD誘發(fā)的LID在表現(xiàn)特征上具有相似性，可以作為研究LID的嚙齒類模型[9]。

皮質(zhì)紋狀體Glu能投射中系統(tǒng)是腦內(nèi)最重要的興奮性氨基酸投射系統(tǒng)之一，廣泛介導(dǎo)各種生理過程，在腦內(nèi)信息加工和處理，傳導(dǎo)徑路的重塑中占有重要地位。研究[10]表明，皮質(zhì)紋狀體突觸活性增強在基底節(jié)環(huán)路的失衡改變中為一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與LID的發(fā)生密切相關(guān)，而突觸長時程電位(LIP)的可塑性改變常伴隨突觸前及突觸后蛋白的異常磷酸化，突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。早期的研究[4]表明，CaMK Ⅱ與多種形式的行為學(xué)及突觸可塑性有關(guān)，并指出CaMK Ⅱ信號介導(dǎo)的多種靶蛋白磷酸化在突觸反應(yīng)中發(fā)揮重要角色。新近的研究[5]發(fā)現(xiàn)，由CaMK Ⅱ引起磷酸化后的CREB是基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)，它引發(fā)的基因表達可加強長時程記憶的形成。而LID的發(fā)生與左旋多巴長期治療誘發(fā)的皮質(zhì)紋狀體病理性LTP形成密切相關(guān)[6]，因此體內(nèi)CaMK Ⅱ信號激酶介導(dǎo)GluR1的絲氨酸參與了運動并發(fā)癥的發(fā)生[11]。既往研究[12]表明，多巴胺作用于D1受體引起直接通路的過度激活在異動癥的發(fā)生中起重要作用。多巴胺通過D1受體引起一系列病理性的分子生物學(xué)和蛋白改變，其中慢性左旋多巴治療激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)，生成cAMP，進而激活PKA，PKA導(dǎo)致DARPP-32的Thr34位點磷酸化增加，減少Thr75位點磷酸化，Thr34位點磷酸化增加后通過抑制下游的目的蛋白-蛋白質(zhì)磷酸酶Ⅰ進一步增強PKA效應(yīng)。磷酸化DARPP-32可以磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)，同時啟動相關(guān)的級聯(lián)反應(yīng)激活下游的兩種轉(zhuǎn)錄因子：CERB和Elk-1。CREB對多種基因如FosB和強啡肽基因表達有調(diào)控作用。這些都表明DARPP-32磷酸化激活后在LID的發(fā)生中起重要作用[13]。CaMK Ⅱ可以導(dǎo)致內(nèi)源性多巴胺的增加，而波動性的多巴胺刺激可導(dǎo)致紋狀體中PKA通路的過度活化，促進DARPP-32磷酸化水平異常升高，從而誘發(fā)LID的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，給予左旋多巴腹腔注射的KN-93組、KN-92組的第1 d、3 d、5 d、8 d、10 d AIM評分呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。治療后第14 d，即給予KN-93及KN-92干預(yù)后，KN-93組AIM評分明顯低于KN-92組(P<0.01)。PD組、KN-93組及KN-92組給予6-羥基多巴處理的小鼠左前肢使用率顯著下降，予左旋多巴處理后，KN-92組治療第4 d、9 d、14 d及KN-93組治療第4 d、9 d左前肢使用率顯著高于PD組(均P<0.01)。治療后第14 d，即給予KN-93或KN-92干預(yù)后，KN-93組左前肢使用率顯著高于KN-93組(P<0.01)。提示KN-93可以在不影響左旋多巴治療PD作用的同時減少PD小鼠LID的發(fā)生。通過KN-93抑制CaMKⅡ的活性，不僅可以有效逆轉(zhuǎn)了長期左旋多巴所誘導(dǎo)的AIM評分明顯下降及左前肢使用率的提高，而且通過Western blot法檢測損傷側(cè)紋狀體區(qū)CREB、DARPP-32及其磷酸化水平變化情況發(fā)現(xiàn)，KN-93抑制了CREB及DARPP-32的磷酸化表達，進而改善了LID的癥狀，推測是由于CaMKⅡ抑制了PKA信號系統(tǒng)進而導(dǎo)致下游信號分子表達變化所致。

綜上所述，LID可能與紋狀體投射神經(jīng)元內(nèi)的CaMK Ⅱ有關(guān)，其抑制劑 KN-93可能是治療PD引發(fā)的運動并發(fā)癥的一種新的治療方式。對于CaMK Ⅱ抑制劑 KN-93的自身調(diào)節(jié)機制、作用機制及與其他信號蛋白間的相互作用機制，有待進一步詳細(xì)研究，才能為臨床治療LID提供一個新的治療靶點。

[1]Rothwell JC, Edwards MJ. Parkinson’s disease[J]. Handb Clin Neurol, 2013，115:535.

[2]李曉慶，鄭國慶.帕金森病的神經(jīng)保護治療[J].中國現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)雜志，2004，3：37.

[3]Sulzer D,surmeier DJ.Neuronal vulnerability pathogenesis,and Parkinson’s disease[J]. Mov Disord, 2013,28:41.

[4]Peltier J,O’Neill AV.Schaffer D.PI3K/Akt and CREB regulate adult neural hippocampal progenitor proliferation and differentiation[J]. Devel Neurobio, 2007,67:1348.

[5]張廣輝，王超峰.CREB依賴的突觸長時程增強[J].中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志，2011，28：2767, 2780.

[6]宋璐，馬雅萍，劉振國，等.左旋多巴誘導(dǎo)帕金森病異動癥與紋狀體DARPP-32磷酸化的關(guān)系[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2011，18：1.

[7]Lundblad M, Picconi B, Lindgren H, et al. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function[J]. Neurobiol Dis, 2004, 16: 110.

[8]巴茂文，劉振國.左旋多巴誘發(fā)異動癥的病理生理機制研究進展[J].中華神經(jīng)科雜志，2005：403.

[9]Lundblad M, Andersson M, Winkler C, et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson’s disease[J]. Eur J Neurosci, 2002, 15: 120.

[10]曹學(xué)兵，孫圣剛，王嵐，等.左旋多巴誘發(fā)異動癥大鼠皮質(zhì)紋狀體突觸超微結(jié)構(gòu)與功能的變化[J].中華神經(jīng)科雜志，2004，37：126.[11]巴茂文，孔敏，于國平，等.鈣調(diào)激酶Ⅱ抑制劑對帕金森病運動并發(fā)癥大鼠谷氨酸受體GluR1亞基特性的影響[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2010，19：888.

[12]Stocchi F, Olanow CW. Continuous dopaminergic stimulation in early and advanced Parkinson’s disease[J]. Neurology, 2004, 62: S56.

[13]楊新新，任甜甜，吳娜，等.可控釋左旋多巴和芐絲肼微球減少帕金森病大鼠異動癥的發(fā)生[J].中華神經(jīng)科雜志，2011，44：820.

Study on the molecular mechanism of calmodulin kinase Ⅱ inhibitor on the occurrence of dyskinesia

ZHUZhong-fang,DINGXi-qing,YANGXin-xin,etal.

DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221006,China

Objective To investigate the molecular mechanism of calmodulin kinase Ⅱ (CaMK Ⅱ) inhibitor on the occurrence of dyskinesia. Methods 6-hydroxy dopamine was injected into the right medial forebrain bundle to establish the model of Parkinson’s disease (PD) mice.The established PD mice were divided into PD group(n=11), KN-92 group(n=11) and KN-93 group(n=11). Another group of sham-operated mice was involved as control(n=10). KN-92 group and KN-93 group received intraperitoneal injection of L-DOPA (15 mg/kg) and Benserazide (12 mg/ kg), mice in sham-operated group and PD group were injected with the same volume of physiological saline, once daily for 14 d. At 11 d and 12 d, KN-92 or KN-93 (2 μl, concentration 0.1 μg/μl) was intrastriatumly injected into mice before L-doap treatment. Mice in sham -operated group and PD group received normal saline treatment. At 1 d, 3 d, 5 d, 8 d, 10 d and 13 d of treatment, abnormal involuntary movement scale (AIM) was performed in sham -operated group, PD group,KN-92 group and KN-93 group. At 4 d, 9 d and 14 d of treatment,the rate of usage of left fore was evaluated. The levels of cAMP-response element binding protein (CREB), dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32 000 (DARPP-32), phosphorylated levels of CREB and DARPP-32 were determined by western blot. Results There was no difference in the rate of usage on left fore after operation when compared with original condition in sham-operated group. Surprisingly the rate of usage on left fore decreased clearly after treatment and there was significantly difference in using rate when compared with it before treatment in PD treatment group (P<0.01). The rate of usage on left fore increased clearly after treatment and there was significantly difference in KN-92 and KN-93 treating group when compared with it before treatment (P<0.01). Before treatment there was no difference in rate of usage on left fore among all groups. At 4 d and 9 d after treatment the rate of usage on left fore in PD, KN-92, and KN-93 group was lower than that in sham-operated group (P<0.01). At 14 d, there was no difference between KN-93 group and sham-operated group but in both PD and KN-92 treating group rate of usage still lower than that in sham-operated group (P<0.01). The rate of usage on left fore at 4 d, 9 d and 14 d in KN-92 group and at 4 d and 9 d in KN-93 group were significantly higher than those in PD group in corresponding days (allP<0.01). Especially at 14 d, the rate of usage on left fore in KN-93 group was significantly higher than that in KN-92 group (P<0.01). The AIM score in mice increased gradually in 1 d, 3 d, 5 d, 8 d and 10 d after treatment with KN-92 and KN-93 when compared with PD treatment (P<0.01). Except at 14 d, the AIM score was higher after KN-92 treatment there was no difference on all other observing days between KN-92 and KN-93 treatment. The phosphorylated levels of CREB and DARPP-32 were both higher in mice of KN-92 group than those in PD group, and the differences were statistically significant (P<0.01). Moreover, the phosphorylated levels of CREB and DARPP-32 in mice of KN-93 group were significantly reduced, and the differences were statistically significant (P<0.01). Conclusion L-DOPA induced dyskinesia may be associated with CaMK Ⅱ and its inhibitor KN-93 may be used in the treatment of PD motor complications as a new option.

Parkinson’s disease;motor complications;phosphorylation;calmodulin kinase Ⅱ;KN-93

國家自然科學(xué)基金(81301077)；江蘇省高校自然科學(xué)基金(13KJB320026)

221006徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

楊新新

R742.5

A

1004-1648(2017)01-0040-05

2015-10-09

2016-03-18)