以對(duì)羥基苯甲酸和1,10菲啰啉為配體銅配合物的合成及與DNA的作用

李小芳，馮小強(qiáng)，常 慧，楊 聲

(1.天水師范學(xué)院化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001； 2.定西師范高等?？茖W(xué)校，甘肅 定西 743000)

以對(duì)羥基苯甲酸和1,10菲啰啉為配體銅配合物的合成及與DNA的作用

李小芳1，馮小強(qiáng)1，常 慧1，楊 聲2

(1.天水師范學(xué)院化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001； 2.定西師范高等?？茖W(xué)校，甘肅 定西 743000)

通過元素分析、紅外光譜、紫外光譜及差熱熱重分析，對(duì)合成的一種新型銅配合物Cu(phen) (DPA)0.5·3H2O(phen=1,10菲啰啉，DPA=對(duì)羥基苯甲酸)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，并以鯡魚精DNA為靶點(diǎn)，采用光譜法、DNA粘度滴定實(shí)驗(yàn)和循環(huán)伏安法，研究了該配合物與DNA的鍵合方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在加入DNA后，配合物的吸收峰出現(xiàn)減色和紅移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；DNA的相對(duì)粘度隨配合物的加入而增大；配合物在加入DNA后的氧化還原峰電流減小，式量電位發(fā)生正移。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物與DNA通過嵌插方式發(fā)生作用。

對(duì)羥基苯甲酸； 1,10菲啰啉； 配合物； 鯡魚精DNA

1 前 言

銅作為一種生命體必需的元素，以有機(jī)酸等作為配體的Cu(Ⅱ)配合物廣泛的存在于生物體內(nèi)，并在化學(xué)和生物化學(xué)催化系統(tǒng)中起著很重要的作用，已報(bào)道了銅配合物和銅鹽的混合物可以有效地抑制癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并且銅配合物的抗癌藥性優(yōu)于順鉑類抗癌藥物[1]，有望成為防治輻射病、免疫性疾病、心血管疾病、癌癥等疾患的藥用酶[2]。近期仇曉陽[3]合成了一對(duì)中心對(duì)稱的雙核銅配合物[CuL1]2(1)和[CuL2]2(2)，其中L1是雙席夫堿配體N,N′-二(5-氟水楊基)-1,3-丙二胺(H2L1)的二價(jià)陰離子，L2是N,N′-二(5-氟水楊基)-1,2-乙二胺(H2L2)的二價(jià)陰離子，Cu原子都是四方椎配位構(gòu)型。通過MTT法研究了這2個(gè)配合物的抗細(xì)菌(枯草芽孢桿菌,金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和熒光假單胞菌)和抗真菌(白假絲酵母菌和黑曲霉菌)活性。葉行培等人[4]合成了扭曲的四方錐[Cu(L)2(THF](1)和平面正方形[Cu(L)(CH3OH)Cl](2)[HL=3,4-二甲基-2-乙氧羰基-吡咯-5-甲醛苯甲酰腙]酰腙銅配合物。配合物2對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用(MIC=1.98μg·mL-1)，而配合物1則對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性(IC50=9.1μmol·L-1)。

脫氧核糖核酸(DNA)不僅在生命的延續(xù)、生物物種遺傳特性的保持和生長發(fā)育中起著重要的作用，而且與生物變異(如腫瘤、遺傳病、代謝病等)密切相關(guān)。許多防癌、抗癌、治癌藥物與DNA之間通過嵌插作用而發(fā)揮藥理作用[5]，因此，研究DNA與銅配合物的相互作用，對(duì)篩選新型抗癌藥物、闡述其作用機(jī)理都有非常重要的理論意義。但是往往研究方法單一、不全面，研究結(jié)論不充分。近年來，金屬配合物因?qū)NA具有良好的插入斷裂作用使其有可能作為新型DNA結(jié)構(gòu)探針、DNA 斷裂劑、化學(xué)核酸酶和殺菌劑而引起人們的廣泛關(guān)注。國外學(xué)者K.Mohanan以2-羥基苯乙酮和2-氨基嘧啶在乙醇中合成的三齒席夫堿，分別與稀土離子La3+和Nd3+形成的配合物能有效裂解PUC19DNA，并且抑菌性能強(qiáng)于席夫堿配體[6]；T.F.Abbs Fen Reji以苯硫基乙酸和Eu3+和Nd3+配位合成的配合物可以完全裂解DNA，并且能有效抑制人宮頸癌(HeLa)和結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)[7]。考慮到三元配合物與相似的二元配合物相比更穩(wěn)定，而且有望同時(shí)獲得多種效能，本文首次以1,10菲啰啉和對(duì)羥基苯甲酸為配體構(gòu)筑三元銅配合物，同時(shí)，采用諸多研究方法如光譜法、循環(huán)伏安和DNA粘度滴定實(shí)驗(yàn)，從分子水平研究了三元銅配合物與鯡魚精DNA的鍵合方式。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 藥品和儀器

鯡魚精DNA(Sigma公司產(chǎn)品)，其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。TG-DTA分析儀(美國Perkin Elmere公司)；Spectrum One傅立葉紅外光譜儀(美國Perkin Elmere公司)；UV-2450紫外可見光譜儀(日本島津公司)；RF-5301PC熒光光譜儀(日本島津公司)；CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)。

2.2 配合物的合成

稱取DPA 0.37g溶于30mL無水乙醇溶液中，在攪拌下加入0.24g NaOH，75℃水浴加熱回流10min，爾后加入0.595g 的phen，繼續(xù)攪拌10min后，在上述溶液中逐次加入0.48g無水硫酸銅，即刻有淡綠色沉淀析出，50℃下繼續(xù)反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，將沉淀抽濾，烘干。

2.3 配合物與鯡魚精DNA的作用

2.3.1 紫外光譜測定 在參比池和樣品池中分別加入3mL二甲亞砜(DMSO)和3mL銅配合物溶液，依次用DNA分別滴定樣品池和參比池，混勻，放置10min，掃描紫外吸收光譜。

2.3.2 熒光光譜 在樣品池中加入2.0mL 1.0g/L配合物溶液，加入一定體積的DNA溶液，使DNA與配合物的濃度比值不斷增加，用適當(dāng)波長激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，測定配合物的發(fā)射光譜；設(shè)定激發(fā)波長為550nm，激發(fā)和發(fā)射光譜掃描狹縫寬度均為5.0nm。在比色皿中加入2mL DNA溶液和1mL NR的混合溶液，依次用配合物溶液進(jìn)行滴定，掃描發(fā)射光譜。

2.3.3 粘度測定 固定DNA濃度為0.1mg/mL，以不同的R(C配合物/CDNA)加入配合物，溫度恒定在25℃，作用30min進(jìn)行測量，得到(η/η0)1/3與配合物濃度關(guān)系。η為DNA溶液在加入配合物時(shí)的粘度，η0為DNA溶液的粘度。

2.3.4 循環(huán)伏安 循環(huán)伏安測試掃描電位區(qū)間-1.2～1.2V，緩沖溶液為HAc-NaAc(pH 4.6)，工作電極為玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極，對(duì)電極為鉑絲電極。

3 結(jié)果與討論

3.1 配合物組成的確定

配體對(duì)羥基苯甲酸、1,10菲啰啉及配合物的紅外光譜如圖1所示：對(duì)羥基苯甲酸中，δOH(面內(nèi))在1387cm-1的吸收峰在配合物中位移至1378cm-1，νAr-O(1291cm-1、1245cm-1)也分別位移至1272cm-1和1222cm-1處，表明酚羥基氧原子參與配位；-COOH的νC=O(1675cm-1)特征吸收峰也在配合物中消失，同時(shí)配合物還在1593cm-1和1433cm-1出現(xiàn)的新的強(qiáng)吸收峰，歸屬于羧基的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，Δν(-COO-)<200cm-1，表明羧基脫掉質(zhì)子以酸根的形式與銅離子雙齒形式配位[8]，配合物在3373cm-1的峰為水的吸收峰。鄰菲啰啉在1579cm-1、1501cm-1和1353cm-1處出現(xiàn)的特征吸收峰，形成配合物后分別移動(dòng)到1593cm-1、1519cm-1、1378cm-1，并且鄰菲啰啉的νC=N(649cm-1)特征峰消失，表明鄰菲啰啉以雙齒螯合形式與銅(Ⅱ)離子配位。

圖1 對(duì)羥基苯甲酸、1,10菲啰啉及配合物的紅外光譜Fig.1 IR spectra of 4-hydroxybenzolate acid, 1,10-phenanthroline and complex

DMSO作為溶劑和參比，在190～500nm測定了游離配體及配合物的紫外光譜，數(shù)據(jù)列于表1。配體DPA在265nm有一紫外吸收，屬于π-π*躍遷吸收光譜，phen在273.5nm有一個(gè)吸收譜帶，屬于π-π*躍遷，吸收遠(yuǎn)強(qiáng)于對(duì)羥基苯甲酸。兩配體與銅離子作用后形成的配合物在269nm和297.2nm處出現(xiàn)兩個(gè)譜帶。配合物第二個(gè)譜帶相對(duì)于DPA和phen的吸收峰均發(fā)生了較大程度的紅移，說明配合物共平面性增大，稠環(huán)數(shù)目增多，π鍵共軛程度增大，降低了體系的能量。

表1 配體及配合物的紫外光譜數(shù)據(jù)(溶劑DMSO)

升溫速率10℃/min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至1000℃，測定配合物的TG，如圖2所示。TG曲線在200℃之前失重15.1 %，表明配合物中存在3分子結(jié)晶水，水分子也參與配位。200℃以后配合物繼續(xù)氧化分解，對(duì)應(yīng)TG曲線開始明顯下滑，隨著溫度升高，TG曲線在200～500℃之間出現(xiàn)了一個(gè)幅度較大失重過程，總失重為49.3 %，這是配合物結(jié)構(gòu)坍塌，配體氧化分解所致。當(dāng)繼續(xù)加熱，失重不明顯，到1000℃時(shí)配合物質(zhì)量還有25.3 %的剩余，可歸屬為CuO。

圖2 配合物的TG-DTG-DTA曲線Fig.2 TG-DTG-DTA curves of complex

在25℃，濃度為1×10-3mol·L-1配合物的DMSO溶液中，測定了配合物的摩爾電導(dǎo)為14.5 s·cm2·mol-1，表明配合物在DMSO中不電離，以中性分子形式存在[9]。Cu2+含量采用EDTA滴定法測得Cu 21.89(19.39)，元素分析結(jié)果 C 54.62(54.54)，H 2.91(3.0)，N 8.06(8.48)(括號(hào)內(nèi)為理論值/%)。結(jié)合紅外光譜、紫外光譜及TG結(jié)果的數(shù)據(jù)，確定三元銅配合物分子式為Cu(phen) (DPA)0.5·3H2O(phen=1,10菲啰啉，DPA=對(duì)羥基苯甲酸)。

3.2 配合物的電化學(xué)行為

在-1.2～1.2 V電位范圍內(nèi)掃描，配合物在玻碳電極表面有電化學(xué)響應(yīng)，當(dāng)掃描速率為1.4 V/s，中心銅離子在循環(huán)伏安圖上在0.4 V/-0.1 V和0.05 V/-0.65V處呈現(xiàn)兩對(duì)明顯的氧化還原峰。通過改變掃描速度，發(fā)現(xiàn)氧化還原峰電流隨著掃描速度的增大而增大，峰電位隨掃描速度的增大而發(fā)生移動(dòng)(圖3)。以掃速υ對(duì)氧化峰電流Ipc作圖，發(fā)現(xiàn)氧化峰電流與掃描速度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系Ipc(10-5A)=-0.08-0.194 υ(R=0.998)，表明中心Cu2+在電極上的反應(yīng)過程主要由吸附過程控制。

圖3 掃速速率對(duì)配合物電化學(xué)影響(1-12,掃速為0.1, 0.2,0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7,0.8,1.0,1.2,1.3,1.4V/s)Fig.3 Effect of scan rate on the electrochemistry of complex

3.3 配合物與DNA的相互作用

3.3.1 紫外光譜分析 DNA的堿基及磷酸氧是許多藥物的作用位點(diǎn)， 與藥物作用后會(huì)導(dǎo)致其特征峰發(fā)生位移，增色、減色效應(yīng)和等色點(diǎn)是DNA特有的與其雙螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的光譜性質(zhì)。在配合物溶液中加入DNA后，若配合物的吸收峰強(qiáng)度減少，波長紅移，可認(rèn)為是配合物插入DNA 的證據(jù)之一[10]。

配合物與DNA相互作用的吸收光譜滴定曲線如圖4所示，配合物在272nm的吸收峰在加入DNA后發(fā)生了一定程度的減色效應(yīng)，最大吸收波長也稍有紅移(紅移4nm)，說明配合物可能以嵌入方式與DNA發(fā)生了相互作用。

圖4 DNA對(duì)配合物紫外吸收光譜的影響c(DNA)=1.3×10-3mol/L, 1～8,DNA體積為0～140 μLFig.4 Effect of DNA on the UV-Vis absorption spectra of complex

圖5 DNA對(duì)配合物熒光光譜的影響Fig.5 Effect of DNA on the fluorescence spectra of complex

3.3.2 熒光光譜 原來發(fā)光的物質(zhì)在DNA存在下發(fā)光光譜變化很小，可認(rèn)為配合物與DNA沒有明顯的作用；如果配合物與DNA作用后出現(xiàn)了熒光增強(qiáng)或減弱現(xiàn)象，說明配合物與DNA發(fā)生了一定的作用，并且熒光變化幅度反映了配合物與DNA作用的強(qiáng)弱。因此DNA存在下配合物的發(fā)光較大幅度地增強(qiáng)或減弱都可能是配合物與DNA發(fā)生較強(qiáng)結(jié)合的證據(jù)。如圖5所示，銅配合物在396nm出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，與DNA作用后，配合物的熒光顯著增強(qiáng)。這是由于配合物中的配體插入到DNA的堿基對(duì)中，受到DNA的保護(hù)，使之免受水分子的淬滅，因而熒光增強(qiáng)。這進(jìn)一步表明配合物與DNA作用較強(qiáng)，可能是插入結(jié)合。

游離態(tài)的中性紅(NR)熒光強(qiáng)度較弱，但是與DNA以嵌插作用結(jié)合后，熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。當(dāng)固定DNA-NR體系的濃度，加入一定量的配合物后，NR-DNA體系在593nm處特征峰的熒光強(qiáng)度逐漸降低，但隨著配合物濃度的增大，體系的熒光強(qiáng)度卻又增強(qiáng)，如圖6所示。這說明配合物與DNA之間存在嵌插作用，配合物能把NR從DNA結(jié)合位點(diǎn)上擠出，導(dǎo)致游離的NR含量增多，熒光強(qiáng)度便減弱。但是，配合物濃度增大到一定值后，由于配合物也具有熒光，從而體現(xiàn)出熒光增強(qiáng)的趨勢。

圖6 配合物對(duì)DNA-NR體系熒光光譜的影響Fig.6 Effect of complex on the fluorescence spectra of DNA-NR

圖7 不同濃度配合物對(duì)DNA粘度的影響Fig.7 Influence on DNA viscosity with different concentrations of complex

3.3.3 粘度測定 粘度法被認(rèn)為是在缺乏晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)情況下確定配合物與DNA鍵合模式最有力的證據(jù)之一。已有報(bào)道[11]，當(dāng)配合物以靜電、溝面結(jié)合等非插入方式與DNA作用時(shí)，DNA溶液的粘度無明顯變化；以部分插入方式與DNA作用時(shí)，DNA溶液的粘度降低；而通過經(jīng)典插入方式與DNA作用時(shí)，DNA溶液的粘度增加。在DNA溶液中加入配合物后，含DNA的溶液的相對(duì)比粘度呈增大趨勢，如圖7所示，這可能是因?yàn)榕浜衔镏泄曹椊Y(jié)構(gòu)的苯環(huán)插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，使得雙鏈DNA的分子鏈長度增加，從而導(dǎo)致配合物對(duì)含DNA的溶液的粘度逐漸增大。由此推測配合物以插入方式與DNA作用，這與上述光譜學(xué)研究結(jié)果相一致。

3.3.4 循環(huán)伏安法 在配合物溶液中依次滴加DNA，發(fā)現(xiàn)氧化還原峰電流絕對(duì)值均急劇降低，沒有新的氧化還原峰出現(xiàn)，且峰電位發(fā)生正移，當(dāng)加入的配合物與DNA的摩爾濃度比為30時(shí)，峰電位由0.35 V移動(dòng)至0.45 V，峰電流由-4.6×10-5A降低至-2.6×10-5A，峰電位由-0.1V移動(dòng)至-0.2V，峰電流由3×10-5A降低至2×10-5A，在0.05 V處的氧化峰幾乎消失，而在-0.65 V處的還原峰移動(dòng)至-0.8 V處，即式量電位發(fā)生了明顯的正移，如圖8所示。峰電位的移動(dòng)可以作為判斷DNA與電化學(xué)活性分子作用模式的依據(jù)之一，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)小分子與DNA作用后峰電位負(fù)移，則結(jié)合方式為靜電結(jié)合，相反，如果小分子與DNA作用后峰電位正移，則結(jié)合方式為嵌插[12]。電化學(xué)結(jié)果再次說明配合物與DNA的結(jié)合模式為嵌插作用，其抗腫瘤等活性有待進(jìn)一步研究。

圖8 配合物、配合物-DNA體系的循環(huán)伏安圖(1-6，R=C配合物/CDNA分別為：0, 10, 15, 20, 25, 30)Fig.8 Cyclic voltametry of complex and complex-DNA system

4 結(jié) 論

合成了配合物Cu(phen) (DPA)0.5·3H2O(phen=1,10菲啰啉，DPA=對(duì)羥基苯甲酸)。此外，在配合物中加入DNA后，其吸收峰出現(xiàn)減色和紅移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，配合物的氧化還原峰電流減小，式量電位發(fā)生正移；DNA的相對(duì)粘度隨配合物的加入而增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了配合物與DNA之間存在插入結(jié)合。該研究工作對(duì)診斷并治療與DNA有關(guān)疾病的藥

物設(shè)計(jì)提供參考，深入的研究正在進(jìn)行中。

[1] Pyle A.M., Rehmann J.P., Meshoyrer R., et al. Mixed-ligand complexes of ruthenium (II): factors governing binding to DNA[J]. J. Am. Chem. Soc., 1989, 111:3051～3058.

[2] 謝勇平,李清祿,鄭新宇,等. 銅(Ⅱ)煙酸與L-α-丙氨酸三元配合物的固相合成和表征及抑菌活性[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, 38(1):117～120

[3] 仇曉陽.二核雙席夫堿銅(Ⅱ)配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及抗菌活性研究[J].無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 30(7): 1667～1672.

[4] 葉行培,王冠杰,潘鵬.兩個(gè)含吡咯環(huán)酰腙配體的Cu(Ⅱ)配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)和生物活性[J].無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 30(12): 2789～2795.

[5] Sigman D S, Graham D R, Daurora V, et al. Oxygen dependent cleavage of DNA by the 1,10-phenanthroline cuprous complex inhibition ofEscherichiaColiDNA polymerase I[J]. J.Biol.Chem, 1979, 254(24):12269～12272.

[6] K.Mohanan, R.Aswathy, L.P.Nitha, et al. Synthesis, spectroscopic characterization, DNA cleavage and antibacterial studies of a novel tridentate Schiff base and some lanthanide(III) complexes[J]. Journal of rare earths, 2014, 32(4): 379～388.

[7] T. F. Abbs Fen Reji, A. Jeena Pearl, Bojaxa A. Rosy. Synthesis, characterization, cytotoxicity, DNA cleavage and antimicrobial activity of homodinuclear lanthanide complexes of phenylthioacetic acid[J]. Journal of rare earths, 2014, 31(10):1009～1016.

[8] Abuhijleh A L, Woods C. Mononuclear copper (II) salicylate imidazole complexes derived from copper (II) aspirinate. Crystallographic determination of three copper geometries in a unit cell[J]. Inorganic Chemistry Communications, 2001, 4(3):119～123.

[9] Geary W J. The use of conductivity measurements in organic solvents for the characterization compounds [J]. Coord.Chem.Rev., 1971, 7:81～122.

[10] 楊頻, 周春瓊. 兩種新稀土雙核配合物的合成、表征及其對(duì)磷酸二酯鍵模型物(BDNPP) 和DNA的作用研究[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 61(9):1455～1460.

[11] Satyanaryana S, Dabrowiak JC, Chairs JB. Tris(phenanthroline) ruthenium(II) enantiomer interaction with DNA: Mode and specificity of binding[J].Biochemistry, 1993, 32:2573～2584.

[12] Rodriguez M, Bard A.J. Electrochemical studies of the interaction of metal chelates with DNA. 4.Voltammetric and eletrogenerated chemilu-minescent studies of the interaction of tris(2,2-bipyridine) osmium(Ⅱ)with DNA[J]. Anal Chem, 1990, 62(64): 2658～2662.

Synthesis and Interaction with DNA of Copper Complex Constructed from 4-hydroxybenzolate Acid and 1,10-phenanthroline

LI Xiaofang1， FENG Xiaoqiang1， CHANG Hui1， YANG Sheng2

(1.College of chemical engineering and technology, Tianshui Normal University, Tianshui 741001, China; 2.Ding Xi Teachers’ College, Dingxi 743000, China)

A novel ternary complex of Cu(phen) (DPA)0.5·3H2O (Phen=1,10-phenanthroline, DPA=4-hydroxybenzolate acid) was synthesized and characterized by elemental analysis, IR spectroscope, UV-Vis spectroscope and TG-DTA methods. Using herring sperm DNA as biomolecular target, its interaction with the complex was studied by spectroscopy, CV method and DNA viscosity titration experiment. Results showed that the UV absorption peaks of the complex were red-shifted and the intensity was weakened, and the fluorescence intensity was enhanced by the addition of DNA. In addition, the peak current decreased significantly and the potential moved positively. Viscosity titration experiment verified that the complex increased the relative viscosity of DNA. All of the above illustrated that the complex and DNA bond by the mode of intercalation.

4-hydroxybenzolate acid； 1,10-phenanthroline； complex； herring sperm DNA

1673-2812(2017)01-0129-05

2015-10-09；

2016-01-04

甘肅省青年科技基金資助項(xiàng)目(1606RJYE247)和天水師范學(xué)院“中青年”教師科研資助項(xiàng)目(TSA1508)

李小芳(1983-)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，甘肅甘谷人，主要從事多元有機(jī)稀土配位研究。E-mail:tslxffxq@163.com。

馮小強(qiáng)(1979-)，男，副教授，碩士，甘肅華亭人，主要從事天然產(chǎn)物功能活性研究。E-mail:fengxiaoqiang1979@163.com。

O629.74

A

10.14136/j.cnki.issn 1673-2812.2017.01.026