酶抑制法檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留存在的不足及提高檢測準(zhǔn)確性的途徑

王艷樹++馬濤++王琴++魯文娟++湯新金++王文豐

摘要 酶抑制率比色法被廣泛應(yīng)用于蔬菜農(nóng)藥殘留檢測上，但是由于膽堿酯酶的特異性等因素使得該方法存在一些不足之處，使該方法的應(yīng)用在一定程度上受到限制。分析了酶抑制法檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留存在的不足，并從嚴(yán)格儀器、試劑和試驗條件，改進(jìn)前處理方法等方面提出提高檢測準(zhǔn)確性的途徑，以期為酶抑制法的應(yīng)用和推廣提供參考。

關(guān)鍵詞 酶抑制法；農(nóng)藥殘留；準(zhǔn)確性；不足；提高途徑

中圖分類號 TS207.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）01-0104-02

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用。從不使用農(nóng)藥的自然農(nóng)業(yè)發(fā)展到使用農(nóng)藥的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，農(nóng)藥做出了積極的貢獻(xiàn)。但是隨著農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的用量不斷加大和使用技術(shù)不規(guī)范等現(xiàn)象逐漸增多，其造成的環(huán)境污染以及農(nóng)藥殘留問題越來越嚴(yán)重，威脅著人類的健康和安全。現(xiàn)在，這一問題已經(jīng)引起全社會的高度重視，甚至也形成了全球的關(guān)注焦點[1]。

目前，農(nóng)藥殘留檢測的方法較多，受農(nóng)藥品種繁多、化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同、樣品待測組分復(fù)雜等因素的影響，定性、定量分析農(nóng)藥很有必要[2]。氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法及質(zhì)譜聯(lián)用等傳統(tǒng)的農(nóng)藥分析方法只適用于實驗室檢測[3-4]，因為這些方法在預(yù)處理環(huán)節(jié)操作比較麻煩，還需要花費相當(dāng)長的時間進(jìn)行測試，不僅所需儀器的價格昂貴，而且運行成本也不低，最重要的是儀器要求一定的使用條件，同時對操作人員也有嚴(yán)格要求。近年來，關(guān)于農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的研究較多，其中酶抑制比色法不僅研究最多，而且技術(shù)相對成熟，該技術(shù)的優(yōu)點不僅體現(xiàn)在檢測速度快、成本低、操作簡單和便攜等方面，其在不需要配備昂貴的儀器、方便操作者掌握和推廣方面也占有絕對優(yōu)勢[5-7]。酶抑制比色法可以有效緩解專業(yè)農(nóng)藥殘留檢測機(jī)構(gòu)嚴(yán)重不足的現(xiàn)狀，因為該技術(shù)非常適合現(xiàn)場檢測以及大批樣品的篩選，只需要將初篩中具有陽性反應(yīng)結(jié)果的樣本帶回去進(jìn)行實驗室驗證即可[8-9]。

酶抑制法具有諸多優(yōu)點，如檢測速度快、成本低、效率高、操作簡單、便攜、對檢測人員技術(shù)水平要求低等。因此，酶抑制法在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，為了監(jiān)控農(nóng)藥殘留狀況，該技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和銷售企業(yè)中被大量使用，這不僅有利于保障與提升農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全水平，提高經(jīng)濟(jì)效益[10-15]，而且可以大幅降低政府實施農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管成本，從而提高監(jiān)管效率。酶抑制法在很多農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地、鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)技服務(wù)站被廣泛應(yīng)用，因為其不僅可以在產(chǎn)地準(zhǔn)出過程中實現(xiàn)對農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的快速、現(xiàn)場、實時檢測，而且在市場準(zhǔn)入過程中也同樣能夠?qū)崿F(xiàn)對農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的快速、現(xiàn)場、實時檢測。因此，酶抑制法已成為政府實施農(nóng)藥殘留監(jiān)管，實行蔬菜水果市場準(zhǔn)入和退出制度的重要技術(shù)支撐。酶抑制法的推廣使用日益廣泛，其發(fā)揮的作用也越來越大，不僅體現(xiàn)在高毒農(nóng)藥殘留監(jiān)管的各個環(huán)節(jié)，而且滲透在打擊非法生產(chǎn)、濫用高毒農(nóng)藥的工作中。

1 酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留存在的不足之處

20世紀(jì)60年代酶抑制法問世，80年代呈快速發(fā)展之勢，隨著研究的不斷深入，技術(shù)已相對成熟，逐漸成為目前研究最多的一種對部分農(nóng)藥進(jìn)行殘留快速檢測的技術(shù)[1]。但是該技術(shù)尚存在不足之處，即檢測對象不具有廣譜性，目前只適用于檢測某些樣品和農(nóng)藥種類，如可以檢測蔬菜、水果中殘留的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。另外，該方法還比較容易出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象[6]，這是因為其使用的酶、底物、顯色劑都具有一定的特異性，需要控制多個條件才能盡量降低影響。

1.1 檢測對象僅限于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥

酶抑制法的檢測機(jī)理是：在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥可以抑制膽堿酯酶正常功能的發(fā)揮，而且其抑制率隨著農(nóng)藥濃度的升高而升高，因而判斷樣品中是否存在高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥只要參照抑制率即可得出結(jié)論[7]。

一般酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，乙酰膽堿與顯色劑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計在412 nm處測定吸光度隨時間變化值，就能夠計算出抑制率。邱朝坤等以鯽魚腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶為檢測用酶，利用酶抑制法快速檢測5種蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留情況。研究發(fā)現(xiàn)，要準(zhǔn)確判斷農(nóng)藥殘留情況，就要借助AChE酶活抑制率和農(nóng)藥抑制方程。當(dāng)AChE酶活抑制率>35%時，即可判斷該樣品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，該方法的回收率為80%～120%[8]。

此外，金盛燁等用酶抑制法測定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥含量的研究結(jié)果表明，酶活力的抑制率隨著農(nóng)藥濃度的升高而升高。其中，呋喃丹檢測限為3.5 μg/L，對氧磷檢測限為12.0 μg/L，敵敵畏檢測限為25.0 μg/L，西維因檢測限為50.0 μg/L，含不同濃度呋喃丹的油菜汁的回收率為108.0%～118.0%[9-10]，大白菜汁的回收率為93.2%～107.0%。

酶抑制法在農(nóng)殘檢測方面的應(yīng)用越來越受到限制，一方面該方法只限于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測，而且與國際和國內(nèi)規(guī)定的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)比較，檢測限很大比例都呈偏高態(tài)勢，陽性檢測結(jié)果還需要采用儀器法進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，因此由于該方法的檢測精度較低，不能夠成為法律仲裁依據(jù)[5，11]。另一方面，農(nóng)藥品種更新較快，隨著新的農(nóng)藥品種及用量不斷增加，越來越多的農(nóng)藥品種在例行監(jiān)測中的檢出率和超標(biāo)率呈上升趨勢，從而被列入檢測范圍，如擬除蟲菊酯類、三唑類等其他類別的殺蟲、殺菌和除草劑。而酶抑制法對這些類別的農(nóng)藥卻無法檢測出來[5]。

1.2 檢測精度不高，易受樣品性質(zhì)影響

分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)行的技術(shù)方法及標(biāo)準(zhǔn)獲得檢測結(jié)果主要通過判別樣品的顏色變化來確定，而判別顏色變化本身就成為阻礙檢測靈敏度提高的重要因素。同時，現(xiàn)行方法為了不干擾樣品組織液，待測樣品只能從樣品表面提取，對樣品組織內(nèi)的殘留情況無法檢測，從而阻礙了樣品中農(nóng)藥殘留的檢出限的提高[12]。

另外，酶抑制法容易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象的植物，不僅是《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測》（GB/T5009.199-2003）中提出的汁液中含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)的蔬菜，如蔥、蒜、韭菜、芹菜、香菜、蘿卜、茭白、蘑菇及番茄等，對于一些葉綠素、類胡蘿卜素等色素含量較高的蔬菜也難以準(zhǔn)確檢測，使得該方法在以上這些蔬菜的主產(chǎn)區(qū)或生產(chǎn)基地上應(yīng)用受到限制。

1.3 受儀器、試劑、試驗條件等因素的影響較大

一是速測產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊。目前市場上的速測儀產(chǎn)品眾多，而且價格相差較大，一部分可能是偽劣產(chǎn)品。使用者在對有效產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量判斷和選擇時，不僅沒有相關(guān)的認(rèn)定和驗證程序進(jìn)行檢驗，而且也沒有國家或行業(yè)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)或鑒定規(guī)程進(jìn)行參考[10，13]。目前儀器設(shè)備和試劑產(chǎn)業(yè)也缺乏監(jiān)管和規(guī)范統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，加上廠家的行業(yè)自律意識也比較淡薄，整個產(chǎn)業(yè)處于混亂狀態(tài)。這就造成了儀器設(shè)備和試劑市場的混亂，出現(xiàn)儀器性能不穩(wěn)定、試劑性質(zhì)差別較大等問題，導(dǎo)致同批次樣品的檢測結(jié)果的重現(xiàn)性不佳，對快速檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度產(chǎn)生嚴(yán)重影響。二是檢測試劑缺乏相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。酶抑制法的關(guān)鍵和核心是酶試劑，酶試劑的穩(wěn)定性對檢測結(jié)果的影響很大。由于酶的穩(wěn)定性對環(huán)境的變化非常敏感，一旦保存或使用不當(dāng)都會使其失去活性，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。膽堿酯酶的制備來源廣泛，如家蠅、魚類、動物肝臟和血液以及小麥、大豆和玉米等材料，只需要將這些材料進(jìn)行分離和純化即可獲得[14]。目前，各速測產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)獲得酶試劑的途徑較多，有的通過市場直接購買，也有的利用自主分離、提取和純化等方法制備，還有的直接委托其他單位或企業(yè)幫助生產(chǎn)。在質(zhì)量方面這些酶的差別較大，在活性和穩(wěn)定性方面也同樣存在較大的差別，主要是由于酶的來源、類別、生產(chǎn)工藝等不同造成的。然而，目前對于我國最常用的AChE在活性、靈敏度和穩(wěn)定性等性能方面缺少統(tǒng)一的測試和鑒定標(biāo)準(zhǔn)，這就造成市場上的酶試劑產(chǎn)品處于魚龍混雜、質(zhì)量參差不齊的狀態(tài)。要想保證速測結(jié)果的準(zhǔn)確性，僅僅依靠農(nóng)藥殘留檢測用BChE 的標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1157—2006）是完全不夠的。三是缺少針對快速檢測前處理環(huán)節(jié)的設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)。目前國內(nèi)對于快速檢測前處理環(huán)節(jié)的實際操作要求，主要參照國家標(biāo)準(zhǔn)《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測》（GB/T5009.199—2003）。但在實際操作中容易出現(xiàn)誤判現(xiàn)象，因為在實際處理時提取液的獲得途徑比較簡單，只是樣品在緩沖液中經(jīng)過振蕩、混勻、靜置環(huán)節(jié)而已，這造成干擾物質(zhì)去除困難，必須要經(jīng)過凈化和富集過程才行。四是樣品上機(jī)前酶就已經(jīng)開始與底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，致使△As較小，導(dǎo)致抑制率偏小或偏大，乙酰膽堿酯酶反應(yīng)條件受環(huán)境等因素的影響較大，檢測的靈敏度和回收率還有待提高。

2 提高農(nóng)殘快速檢測準(zhǔn)確性的途徑

2.1 針對易出現(xiàn)假陽性及容易誤判的樣品

對于容易產(chǎn)生假陽性的樣品以及色素含量較高的樣品，檢測時可采用整體浸泡或沖洗的方法進(jìn)行提取，取蔬菜的單體，用緩沖液浸泡或反復(fù)沖洗單體，盡量減少次生物質(zhì)和過多的葉綠素對酶產(chǎn)生的干擾，從而可以提高檢測的準(zhǔn)確性。

2.2 對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類以外的農(nóng)藥檢測

對除有機(jī)磷和氨基甲酸酯類以外類型農(nóng)藥殘留的檢測，目前國標(biāo)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中尚無快速檢測的方法，建議根據(jù)《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》（NY/T761—2008）等方法，使用氣相或液相進(jìn)行檢測。

2.3 對因儀器誤差、化學(xué)試劑和操作方法不當(dāng)?shù)仍虍a(chǎn)生的問題

基于酶抑制率原理的農(nóng)藥殘留快速檢測儀大多是在小型分光光度計的基礎(chǔ)上研制的，技術(shù)上比較成熟，但是生產(chǎn)水平良莠不齊，儀器的教研管理落后，沒有相關(guān)的驗證程序，所以質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督部門應(yīng)加強(qiáng)對農(nóng)殘速測儀的認(rèn)證和校驗管理。檢測單位在購買試劑時應(yīng)盡量選用乙酰膽堿酯酶，因為相對其他酶類，乙酰膽堿酯酶與氨基甲酸酯類和有機(jī)磷類農(nóng)藥的特異性反應(yīng)最強(qiáng)，而且靈敏度高，基本不受干擾。要嚴(yán)格注意試劑的保存條件。為了避免樣品轉(zhuǎn)移的損失，減少各種人為因素的偶然誤差，相關(guān)研究單位應(yīng)發(fā)展快速、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保和便捷的樣品前處理技術(shù)和自動化程度更高的速測儀器，以提高檢測準(zhǔn)確性。

另外，檢測人員的素質(zhì)相當(dāng)重要，因為在取樣、提取、加酶試劑反應(yīng)等操作中，檢測人員的操作在很大程度上會影響檢測結(jié)果。我國省市質(zhì)檢機(jī)構(gòu)檢測人員的素質(zhì)和檢測水平較高，而基層速測人員由于工作開展較晚，其素質(zhì)普遍較低，特別是區(qū)縣、大型農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場的速測人員，大部分未經(jīng)過系統(tǒng)的樣品檢測分析知識培訓(xùn)。因此，為了提高檢測人員的綜合素質(zhì)，應(yīng)對其加強(qiáng)技術(shù)和專業(yè)技能培訓(xùn)，使其符合農(nóng)殘速測工作的要求[15]。

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