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    夏枯草中多糖的提取與含量的測定

    2013-09-05 14:22:00張霞聶少平李景恩李卷梅林慧霞李昌謝明勇
    食品研究與開發(fā) 2013年1期
    關(guān)鍵詞:夏枯草精制蒸餾水

    張霞,聶少平,李景恩,李卷梅,林慧霞,李昌,謝明勇

    (南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

    夏枯草(Prunella vugarisL.)為唇形科(Labiatae)夏枯草屬(prunella)植物,多年生草本,全球約15種,廣泛分布于歐亞溫帶地區(qū)及熱帶山區(qū),非洲北部及北美洲也有分布,我國產(chǎn)4種3變種,其中1種為引種栽培,主要產(chǎn)于湖南、安徽、浙江、江蘇等地[1-2]。它具有幾千年的藥用歷史,其果穗和全草均可入藥,《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“主寒熱、瘰疬、鼠瘺、頭瘡,破癥,散癭結(jié)氣,腳腫濕痹”,具有清火、明目、清肝、散結(jié)及消腫之功效。

    近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)夏枯草進(jìn)行了廣泛的研究,尤其在其化學(xué)成分和藥理研究方面作了較深入的探討[3-7],研究表明,夏枯草含有多種活性化學(xué)成分,具有抗菌、降壓、抗炎、抗腫瘤、降血糖等作用[8-12],其中多糖作為夏枯草的重要活性成分也受到廣泛關(guān)注,為了進(jìn)一步研究夏枯草多糖的理化性質(zhì)及活性,為其后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù),本實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)過前處理去雜質(zhì)后的夏枯草樣品進(jìn)行熱水浸提,得樣品溶液,采用苯酚-硫酸比色法[13-15]測定其多糖含量,實(shí)驗(yàn)中為減少誤差采用精制夏枯草多糖測得夏枯草多糖對(duì)葡萄糖的換算因子。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    夏枯草,粉碎,貯于干燥器中備用。無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖等試劑除注明外均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    FA1104電子天平:上海精天電子儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;SHZ-IIIB循環(huán)水真空泵:上海亞榮生化有限公司;TGL-5-A離心沉淀機(jī):上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司;EYELAN-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:廈門精藝興業(yè)科技有限公司;DZG-6050型真空干燥箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;CQ超聲微清洗器:上海超聲波儀器廠;透析袋(規(guī)格為 8 000~10 000 Da):Sigma公司;TU-1900雙光束紫可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

    1.3 方法

    1.3.1 夏枯草多糖的提取與精制

    稱取經(jīng)干燥粉碎后過20目篩的夏枯草粉末200g,用1 600 mL 80%乙醇浸泡24 h。用雙層濾布過濾,濾渣陰干后,按料水比1∶20 g/mL在90℃熱水中浸提2 h,間歇攪拌,雙層濾布過濾,濾渣重復(fù)提取兩次,合并三次濾液,在4 800 r/min條件下離心分離10 min,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行真空濃縮(55℃、50 r/min、真空度0.095 MPa),使?jié)饪s液約為原體積的1/5,然后向濃縮液中加入無水乙醇使乙醇濃度達(dá)70%,于4℃冰箱中醇沉 24 h,再離心分離(4 800 r/min,10 min),棄去上清液,將所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌兩次,在55℃條件下真空干燥,得夏枯草粗多糖。將干燥的粗多糖用蒸餾水溶解,采用Sevag法脫蛋白,加入約為樣液體積1/3量的氯仿、正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇為4∶1)劇烈振搖10 min,離心分離(4 800 r/min,10 min),分去水層和有機(jī)溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)。對(duì)得到的上清液反復(fù)脫蛋白至幾乎無蛋白層,然后將所得溶液先用自來水透析48 h,再用蒸餾水透析24 h,透析完成后,將透析液進(jìn)行真空濃縮(55℃,50 r/min,真空度0.095 MPa),向濃縮液中加入無水乙醇使乙醇濃度達(dá)70%,于4℃冰箱中過夜醇沉,再離心分離(4 800 r/min,10 min),所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌兩次,得精制夏枯草多糖,在55℃下真空干燥,所得樣品置干燥器中備用。

    1.3.2 測定波長的確定

    配制一定濃度的精制夏枯草多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,精密量取2 mL于具塞試管中,按照1.3.3中所述方法顯色,以等量的蒸餾水作空白,在TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)上從400 nm~700 nm進(jìn)行掃描,確定精制夏枯草多糖和葡萄糖的最大吸收波長。

    1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.250 2 g,置于250 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋至刻度,然后再取出10mL置于100mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度、搖勻,配成100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。

    5%苯酚溶液的配制:稱取苯酚100 g,加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g,常壓蒸餾、收集(180±2)℃餾分。精密稱取該餾分約5 g置于100 mL容量瓶中,加水溶解至刻度,搖勻后轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中,即得5%苯酚溶液,置于冰箱中備用(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

    分別移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中,加蒸餾水補(bǔ)至2 mL,配置成系列梯度的葡萄糖溶液,以2 mL蒸餾水作空白,每管加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻,沿管壁緩慢加入濃硫酸各5 mL,迅速搖勻,在室溫下顯色35 min后,于490 nm波長處測定吸光度,以吸光度對(duì)葡萄糖濃度作回歸方程。

    1.3.4 換算因子的測定[16]

    精密稱取干燥至恒重的精制夏枯草多糖100.8 mg,置于100 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋至刻度,搖勻配成精制多糖貯備液;再吸取2 mL上述儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋至刻度,搖勻,制得精制夏枯草多糖供試液。采用苯酚-硫酸比色法測定其吸光度,由回歸方程求出此精制夏枯草多糖供試液中葡萄糖濃度,測得其葡萄糖含量,按(1)式計(jì)算換算因子。因夏枯草多糖干燥后溶解性較差,為減少測定誤差,故將按1.3.1中的方法制得多糖透析液真空濃縮后取等量20 mL濃縮液兩份,經(jīng)醇沉洗滌后,一份直接加蒸餾水溶解、定容、比色、測定多糖含量;另一份真空干燥至恒重,稱得精制夏枯草多糖的干重,由二者計(jì)算平均換算因子。

    式中:W為稱取多糖的重量,mg;C為精制夏枯草多糖貯備液中葡萄糖濃度,(mg/mL);D為多糖的稀釋因素,mL。

    1.3.5 樣品中夏枯草多糖含量測定

    稱取3份約5g干燥過的夏枯草粉末樣品,按1.3.1中多糖的提取方法反復(fù)提取,并分別將提取液加蒸餾水定容至100 mL容量瓶中,準(zhǔn)確吸取2 mL,按照1.3.3中的方法測定吸光度,吸光度連續(xù)三次變化不大時(shí),說明樣品中多糖不再溶出,停止提取。合并濾液,在4 800 r/min的條件下離心分離10 min,將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行真空濃縮(55℃、50 r/min、真空度0.095 MPa),將濃縮液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,以蒸餾水定容至刻度,搖勻備用;再準(zhǔn)確移取上述溶液5 mL置于100 mL容量瓶中,定容至刻度搖勻制成待測溶液備用。

    精密吸取上述待測液各2 mL于各具塞試管中,按照1.3.3中的方法測定吸光度,由回歸方程計(jì)算樣液中葡萄糖濃度,按(2)式計(jì)算樣品中夏枯草多糖含量。

    多糖含量/%=CDf/W×100 (2)

    式中:C為供試液中葡萄糖濃度,(mg/mL);D為多糖的稀釋因素,mL;f為換算因子;W為供試夏枯草樣品的重量,mg。

    1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    配置某一濃度的多糖溶液,確保其吸光度在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi),精密吸取該多糖溶液2 mL于具塞試管中,按照1.3.3下的方法測定吸光度,每隔0.5小時(shí)測定1次,連續(xù)2 h考察其穩(wěn)定性。

    1.3.7 精密度試驗(yàn)

    在照1.3.3的方法測定樣品中多糖含量時(shí),將其中某一供試樣品溶液連續(xù)測定6次吸光度,考察試驗(yàn)的精密度。

    1.3.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

    精密稱取5份同一批夏枯草粉末各5 g,按照1.3.5中方法同時(shí)制取5份樣品溶液。精密移取此樣品溶液各2 mL,分別置于具塞試管中,按照1.3.3下的方法測定吸光度,由回歸方程計(jì)算樣液中葡萄糖濃度,按(1)式和(2)式計(jì)算夏枯草多糖含量,考察試驗(yàn)的重現(xiàn)性。

    1.3.9 加標(biāo)回收率測定

    精密稱取5份夏枯草粉末各1 g,按照1.3.5中方法反復(fù)提取濃縮得到浸提液,稱取5份精制夏枯草多糖各約50 mg,用蒸餾水溶解后分別加入前面所得的5份浸提液中,再以蒸餾水定容于250 mL容量瓶中,搖勻,備用。然后分別精密移取10 mL于100 mL容量瓶中,以蒸餾水定容至刻度,搖勻,備用。按照1.3.3的方法測定吸光度,以其平均值作為回收率的計(jì)算結(jié)果。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 最大吸收波長

    TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)掃描結(jié)果顯示夏枯草樣品溶液在481 nm處有最大吸收,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在490 nm處有最大吸收。因?yàn)槭且云咸烟呛繛闃?biāo)準(zhǔn)測定夏枯草中的多糖含量,所以選擇490 nm作為測定波長,結(jié)果如圖2。

    2.2 換算因子

    將真空干燥的精制多糖溶解于水,測得換算因子f為2.122。利用等體積的多糖透析液,醇沉洗滌后,一份直接加蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,加蒸餾水定容,搖勻。再吸取10 mL用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中,搖勻后取2 mL于具塞試管中,測其吸光度為0.153。另一份真空干燥至恒重,稱其重量為0.0652g。用這種方法測得換算因子f為2.010,取平均值f為2.066。

    2.3 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。

    圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of glucose solution

    回歸方程為y=0.084 8x,R2=0.999 7。由圖1可見,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在10 μg/mL~60 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

    夏枯草樣品和葡萄糖光譜掃描圖,見圖2。

    圖2 夏枯草樣品和葡萄糖光譜掃描圖Fig.2 UV spectra of sample and glucose

    為檢驗(yàn)測定方法的正確性、精確度和穩(wěn)定性,本試驗(yàn)進(jìn)行了穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性和加樣回收率實(shí)驗(yàn),其結(jié)果分別列于表1~表4。

    從表1~表4可以看出,供試液在2 h內(nèi)顯色穩(wěn)定,精密度(RSD=0.312%),測定結(jié)果重現(xiàn)性好(RSD=1.84%),回收率高(平均回收率為101.9%,RSD=2.01%)。

    表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability experiments

    表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Results of precision experiments(n=6)

    表3 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 3 Results of reproducibility experiments(n=5)

    表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 4 Results of recovery experiments(n=5)

    2.4 夏枯草中多糖含量的測定

    實(shí)際樣品含量測定結(jié)果見表5,夏枯草中多糖平均含量為9.3%。

    表5 夏枯草中多糖含量測定結(jié)果(n=3)Table 5 Determination results of polysaccharides in Prunella Vulgaris Linn(n=3)

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測定夏枯草多糖中的糖含量,該方法的依據(jù)是多糖在濃硫酸作用下水解生成單糖,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后與苯酚濃縮合成橙黃色化合物,反應(yīng)過程中顏色穩(wěn)定,在波長490 nm處和一定濃度范圍內(nèi),其吸光度與樣品中多糖含量成正比,符合朗伯-比爾定律,從而可以采用分光光度計(jì)測定其吸光度,并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定樣品中的多糖含量。并且本實(shí)驗(yàn)還通過精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和加樣回收率等試驗(yàn)來驗(yàn)證了苯酚-硫酸比色法測定夏枯草中多糖糖含量的準(zhǔn)確可靠性及簡便快捷性,確定了一種簡便可行的測定夏枯草多糖含量的方法。

    實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)夏枯草多糖水提液應(yīng)盡可能當(dāng)天浸提當(dāng)天測定,因?yàn)樗嵋悍胖脮r(shí)間過長會(huì)被外界環(huán)境中微生物分解,從而含量降低,影響測定結(jié)果。此外因?yàn)橹参锒嗵堑膯翁墙M成比較復(fù)雜,不同單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率不同,所以用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)引起系統(tǒng)誤差,故實(shí)驗(yàn)過程中采用精制夏枯草多糖計(jì)算換算因子,以避免這種系統(tǒng)誤差,所測結(jié)果明顯高于不使用校正因子所得的結(jié)果。

    夏枯草分布廣泛,資源豐富,化學(xué)成分復(fù)雜,藥理作用廣泛,有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)利用價(jià)值,是一種有潛力的藥物資源。夏枯草多糖具有良好的抗氧化性能,根據(jù)自由基理論,應(yīng)具有開發(fā)為功能性食品的潛在價(jià)值[17]。相信隨著研究的不斷深入,夏枯草將在藥理學(xué)、飲品及保健品行業(yè)發(fā)揮越來越重要的作用。

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