人CD133基因及蛋白分子生物學(xué)研究進(jìn)展

唐楠，雷德強(qiáng)，趙洪洋

·綜述·

人CD133基因及蛋白分子生物學(xué)研究進(jìn)展

唐楠，雷德強(qiáng)，趙洪洋

Prominin-1是五次跨膜糖蛋白家族兩大成員之一。Prominin-1于1997年從小鼠神經(jīng)上皮干細(xì)胞中分離，因?yàn)樗晃挥诩?xì)胞膜上突出的位置故名priminin，為“突出”之意。同年，細(xì)胞表面抗原AC133基于AC133單克隆抗體的使用被發(fā)現(xiàn)，且是人類發(fā)現(xiàn)的首個(gè)五次跨膜蛋白，而且人AC133實(shí)際上是小鼠Prominin-1的人同源蛋白，同源性達(dá)60%。該蛋白在2000年第七屆國(guó)際白細(xì)胞分化抗原工作組會(huì)議(mDAW)上被正式命名為CD133，AC133僅作為表位的名稱來使用。

1 CD133蛋白及其分布

CD133蛋白是人類發(fā)現(xiàn)的首個(gè)五次跨膜蛋白，分子量約為96.8kD，是一個(gè)由大約850個(gè)氨基酸組成的單肽鏈，起于胞外的N端，含五個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)巨大的胞外環(huán)，兩端較小的胞內(nèi)環(huán)，終于胞內(nèi)的C端。并且在兩個(gè)胞外環(huán)上各發(fā)現(xiàn)了4個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。AC133單克隆抗體可能識(shí)別的就是某個(gè)被糖基化的表位，而且被糖基化后蛋白分子的分子量會(huì)增加20kD左右。故進(jìn)行western blot時(shí)最后被AC133識(shí)別的CD133的條帶的分子量為120kD左右，即AC133抗原是一個(gè)相對(duì)分子量為120kD的糖基化蛋白。

CD133表達(dá)于多種組織的干細(xì)胞及前體細(xì)胞，如造血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞等；近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中存在CD133+腫瘤干細(xì)胞，如膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、喉癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌及骨肉瘤等。

2 CD133基因及其表達(dá)的調(diào)節(jié)

人CD133基因位于4號(hào)染色體短臂1區(qū)5帶3亞帶2次亞帶(4p15.32)(NCBI gene 8842)，包含至少37個(gè)外顯子，超過150kb長(zhǎng)度，并由5個(gè)啟動(dòng)子控制其轉(zhuǎn)錄，屬于復(fù)雜性轉(zhuǎn)錄單位，即從一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)會(huì)產(chǎn)生幾種不同的成熟mRNA 。

CD133基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要位于轉(zhuǎn)錄起始處的調(diào)控，比如啟動(dòng)子甲基化及組織特異性的啟動(dòng)子活化，和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，主要指不同組織中存在不同的CD133mRNA剪接變體。在翻譯水平的調(diào)控目前研究尚不多。

2.1 CD133的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控 CD133的轉(zhuǎn)錄起始由5個(gè)啟動(dòng)子控制并受甲基化和組蛋白去乙酰化調(diào)節(jié)。CD133基因5端有5個(gè)串聯(lián)的啟動(dòng)子(P1、P2、P3、P4和P5)，在這些啟動(dòng)子中都缺乏TATA盒并且其中3個(gè)(P1、P2和P3)位于CpG島中。而且，在體外實(shí)驗(yàn)中P1和P2的甲基化可導(dǎo)致其失活。對(duì)其5端UTR的分析顯示這些它們的表達(dá)呈現(xiàn)組織特異性。例如：肝、腎、胰腺、胎盤、結(jié)腸可以同時(shí)檢測(cè)到表達(dá)外顯子1A和外顯子1B的mRNA；在腦、卵巢、嬰兒肝和小腸中只能檢測(cè)到表達(dá)外顯子1B的mRNA；而表達(dá)外顯子1D的mRNA僅能在睪丸中檢測(cè)到。由不同啟動(dòng)子啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄具有不同的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，而公用第二外顯子。

關(guān)于啟動(dòng)子甲基化在調(diào)節(jié)CD133基因表達(dá)中的作用頗有爭(zhēng)議，在不同組織和細(xì)胞系中結(jié)果不盡相同。You等在一些結(jié)直腸癌的細(xì)胞系中證明了CpG島中啟動(dòng)子的過度甲基化會(huì)導(dǎo)致CD133轉(zhuǎn)錄水平的抑制，而去甲基化可恢復(fù)大部分細(xì)胞系中CD133的表達(dá)，子宮內(nèi)膜癌的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中也有類似結(jié)果。而Davide[1]等人認(rèn)為DNA甲基化對(duì)于CD133表達(dá)的調(diào)節(jié)作用僅限于細(xì)胞系，在良性和惡性的前列腺的原代培養(yǎng)中CD133的調(diào)節(jié)并不依賴于DNA甲基化而依賴于染色質(zhì)凝聚的動(dòng)力學(xué)控制。近來又有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明在卵巢癌細(xì)胞中CD133的表達(dá)是同時(shí)受甲基化調(diào)節(jié)和組蛋白去乙?；揎椪{(diào)節(jié)。

2.2 CD133的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 繼1997年發(fā)現(xiàn)AC133分子(現(xiàn)稱為CD133)以來，2002又發(fā)現(xiàn)了AC133-2。與AC133-1一樣，CD133-2也可以被AC133的單克隆抗體識(shí)別，不同的是剪接方式，AC133-2的mRNA比AC133-1的mRNA少了外顯子3，少了27個(gè)核苷酸，因此編碼的蛋白僅有856個(gè)氨基酸，與AC133-1相比胞外的N端少了9個(gè)氨基酸。它們?cè)谌梭w不同組織中的分布不同，在人不同生長(zhǎng)發(fā)育階段分布也不同。迄今為止被發(fā)現(xiàn)的CD133基因的剪接變體共有7種，為減少混淆統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，2007年Fargeas CA將它們以s為前綴冠名，根據(jù)成熟mRNA中外顯子3、9、19、25、26a/b、27和28的存在于否分別命名為s1、s2、s7、s9、s10、s11和s12[2]。不同的剪接方式最終影響的是開放性閱讀框，進(jìn)而影響蛋白的氨基酸序列。不同的剪接變體之間除了外顯子3的存在與否，與其關(guān)聯(lián)的是胞外N端9個(gè)氨基酸的存在與否，其他的外顯子25、26、27、28的存在與否均影響的是胞內(nèi)的C端，進(jìn)而可能影響的是與不同的胞內(nèi)蛋白相互作用。雖然關(guān)于CD133分子胞內(nèi)作用的信息和研究并不多但是仍然有一些有趣的發(fā)現(xiàn)。其他物種的CD133s3、s4、s5的C端末尾幾個(gè)氨基酸可能是Ⅱ類PDZ結(jié)合域配體，人類中存在的CD133s9的C端可能與Ⅲ類PDZ結(jié)合域配體相關(guān)，CD133s1、s2、s7、s8和s11的C端可能與Ⅰ類PDZ結(jié)合域配體有關(guān)[2]。

關(guān)于CD133分子的糖基化還有很多問題需要研究。確實(shí)在不同的發(fā)育階段以及不同的組織會(huì)有未被糖基化的CD133分子表達(dá)，但是糖基化的的調(diào)節(jié)尚不明了，但是有實(shí)驗(yàn)證明胞外環(huán)的N-糖基化有助于AC133表位的表達(dá)和識(shí)別。目前已開發(fā)出針對(duì)兩種不同的糖基化表位AC133和AC141的單克隆抗體，并廣泛應(yīng)用于CD133表達(dá)的檢測(cè)。

2.3 其他調(diào)節(jié) 另外在肝癌細(xì)胞中CD133的表達(dá)還可能接受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming Growth Factor β，TGF-β)的調(diào)節(jié)，TGF-β通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNAmethyltransferase 1，DNMT1)和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3β(DNAmethyltransferase 3-β，DNMT3-β)表達(dá)來使CpG島上的P1去甲基化從而上調(diào)CD133的表達(dá)，這個(gè)過程是Smads途徑依賴的，即TGF-β受體被TGF-β激活后，Smad2和Smad3被磷酸化并結(jié)合成異源性二聚體，繼而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄[3]。

Fukamachi等[4]最近的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在胃腫瘤細(xì)胞系中SOX17的表達(dá)與CD133的表達(dá)相關(guān)，而前者是維持自我更新能力和干細(xì)胞特性的重要轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)表達(dá)S0X17能導(dǎo)致CD133表達(dá)的增強(qiáng)，而用用RNA干擾技術(shù)減少SOX17的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD133的表達(dá)隨SOX17表達(dá)的減少而減少，證明SOX17可能是控制CD133表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

Campo等[5]發(fā)現(xiàn)在表達(dá)AC133表位的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，氧分壓水平可能影響AC133表位的表達(dá)甚至CD133基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。在缺氧參與的CD133表達(dá)調(diào)節(jié)中，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor α，HIF-α)及SOX2起調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用[6]。

另外，Notch信號(hào)、Ras/ MEK/ERK信號(hào)通路和mTOR信號(hào)被阻斷時(shí)CD133表達(dá)下調(diào)及上調(diào)，證明可能CD133可能也是notch、Ras/ MEK/ERK、mTOR信號(hào)的下游基因[7]。

3 CD133相關(guān)生物學(xué)功能及其展望

盡管CD133被廣泛認(rèn)為是各種組織干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞膜表面標(biāo)記物并被用于干細(xì)胞的分離，盡管它的具體生物學(xué)功能并不清楚，但是若其功能缺失將導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性和骨骼肌萎縮。輸入從血液中分離的CD133+細(xì)胞可以治療肌萎縮，而且CD133+的骨髓干細(xì)胞移植有望改善移植效果，且提高梗死心肌的功能[7]。鑒于CD133有以下特點(diǎn)：總是位于細(xì)胞突起處，與膜小體和膽固醇膜蛋白有關(guān)，一些不同剪接變體具有不同的胞內(nèi)C端等，基于目前對(duì)CD133結(jié)構(gòu)的分布及其他相關(guān)的研究推測(cè)CD133可能具有以下功能。

3.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化[8-9]實(shí)驗(yàn)表明在多種組織及細(xì)胞系中CD133+的細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤性和轉(zhuǎn)移能力，提示在這些組織及細(xì)胞系中CD133可能是一個(gè)很有用的干細(xì)胞標(biāo)記物。CD133之所以能維持干細(xì)胞自我更新及增殖能力，可能是通過調(diào)節(jié)某些信號(hào)通路如p38MAPK及P13k/Akt途徑、NOTCH信號(hào)影響下游基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的分化。因CD133剪接變體分布存在組織特異性，以及在發(fā)育的不同階段同一器官可能轉(zhuǎn)錄出兩種不同的CD133mRNA，提示CD133可能在細(xì)胞的分化中起重大作用。

3.2 參與神經(jīng)髓鞘形成[10]雖然對(duì)于人的CD133與髓鞘形成的關(guān)系目前尚無報(bào)道但在對(duì)小鼠CD133分布研究中發(fā)現(xiàn)，CD133僅位于神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘，而且在髓鞘缺失的小鼠中CD133的表達(dá)大大降低以至低于檢測(cè)下限。因?yàn)樗枨矢缓|(zhì)，尤其是膽固醇、鞘糖脂、半乳糖腦苷脂以及半乳糖硫酸腦苷脂，CD133可能為膠質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜生長(zhǎng)提供脂質(zhì)機(jī)構(gòu)，尤其是膜膽固醇，而后者是CD133的交互作用分子?；蛘逤D133可能是作為一類新的粘附分子，用它兩個(gè)巨大的胞外糖基化環(huán)通過嗜同或是嗜異的交互作用在髓鞘緊縮或軸突形成中起重要作用。

3.3 參與糖、鐵代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞骨架改變[11]一篇2007年的論文表明不僅高糖培養(yǎng)能上調(diào)CD133的表達(dá)并降低其磷酸化程度，而且超量的表達(dá)CD133能夠促進(jìn)細(xì)胞攝入葡萄糖，在MDCK細(xì)胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells,MDCK細(xì)胞)中表達(dá)CD133能夠明顯改變其形態(tài)學(xué)和促進(jìn)其遷移能力。尚有報(bào)道CD133參與攝入轉(zhuǎn)鐵蛋白以及鐵代謝。

3.4 參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]雖然關(guān)于CD133胞內(nèi)作用分子目前尚無研究，但是不同的剪接變體之間胞內(nèi)C端的差異著實(shí)可能與胞內(nèi)信號(hào)有關(guān)，例如s3、s4和s5變體C端末位的4個(gè)氨基酸，HFTL符合PDZ第二類結(jié)構(gòu)域配體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，盡管這幾種變體在人類中并不存在；s9變體在人體中存在，其C端末尾4個(gè)氨基酸為SVQC符合第三類PDZ結(jié)構(gòu)域配體的特點(diǎn)，而s1、s2、s7和s11在人體中均存在，它們C端的末4位氨基酸符合第二類PDZ結(jié)構(gòu)域配體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，雖然CD133也就是Prominin-1在胞內(nèi)蛋白相互作用上尚無重大發(fā)現(xiàn)，但是與它同是五次跨膜蛋白家族的另一成員Prominin-2被證實(shí)能與一類新發(fā)現(xiàn)的谷氨酸受體交互蛋白結(jié)合，而后者具有PDZ結(jié)合域。但CD133是否與含有PDZ結(jié)合域的蛋白相互作用還有待進(jìn)一步證實(shí)。

3.5 參與腫瘤細(xì)胞抗藥性調(diào)節(jié)[12]過表達(dá)CD133的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠抵抗化療藥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，而后者常通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式參與腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制。CD133可能通過PI3K-Akt-NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)多重耐藥基因(multidrug resistant gene 1 ，MDR1)的表達(dá)，并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物的抵抗；CD133靶向治療可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的化療療效[13-14]。

4 與CD133相關(guān)的臨床應(yīng)用

CD133在其在膠質(zhì)瘤的高表達(dá)常提示膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后，尤其對(duì)于高級(jí)別膠質(zhì)瘤更是如此，P2啟動(dòng)子低甲基化導(dǎo)致CD133超表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)相關(guān)[15-18]。CD133靶向治療可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的化療療效，靶向CD133的相關(guān)信號(hào)通路如EGFR通路、細(xì)胞自噬通路可改善相關(guān)腫瘤的治療效果[19-20]。

5 展 望

盡管人們對(duì)于CD133功能有以上猜測(cè)，但實(shí)際上對(duì)其功能的研究尚待進(jìn)一步探討。例如根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)CD133+的細(xì)胞較CD133-的細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖及自我更新能力，以及可能通過p38MAPK及P13k/Akt途徑調(diào)節(jié)在NB細(xì)胞系及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。但CD133促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化以及腫瘤細(xì)胞抗藥性的機(jī)制目前尚不清楚，CD133的配體也尚未找到，而且CD133基因上游調(diào)控通路及下游作用通路還不太明確，啟動(dòng)子活化以及mRNA剪接的機(jī)制也不明了，以及對(duì)于CD133蛋白合成后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞突出部位的機(jī)制了解也很少，CD133為何呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)，故關(guān)于CD133還有很多問題待探討。本文就CD133蛋白的結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控，生物功能及臨床相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行了綜述，若上述問題得到明確解答，干細(xì)胞移植，神經(jīng)及其他組織再生，腫瘤的基因治療和化學(xué)治療將會(huì)獲得重大突破。

[1] Jászai J,Fargeas CA,Florek M,etal.Focus on molecules:Prominin-1 (CD133)[J].Exp Eye Res,2007,85:585.

[2] Shmelkov SV,Jun L,St Clair R,etal.Alternative promoters regulate transcription of the gene that encodes stem cell surface protein AC133[J].Blood,2004,103:2055.

[3] Jeon YK,Kim SH,Choi SH,etal.Promoter hypermethylation and loss of CD133 gene expression in colorectal cancers[J].World Journal of Gastroenterology,2010,16:3153.

[4] Friel AM,Zhang L,Curley MD,etal.Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells[J].Reprod Biol Endocrinol,2010,8:147.

[5] Pellacani D,Packer RJ,Frame FM,etal.Regulation of the stem cell marker CD133 is Independent of promoter hypermethylation in human epithelial differentiation and cancer[J].Mol Cancer,2011,10:94.

[6] Yu Y,Flint A,Dvorin EL,etal.AC133-2,a novel isoform of human AC133 stem cell antigen[J].J Biol Chem,2002,277:20711.

[7] Mak AB,Blakely KM,Williams RA,etal.CD133 N-glycosylation processing contributes to cell-surface recognition of the primitive cell marker AC133[J].J Biol Chem,2011,286:41046.

[8] You H,Ding W,Rountree CB.Epigenetic regulation of cancer stem cell marker CD133 by transforming growth factor-beta[J].Hepatology,2010,51:1635.

[9] Fukamachi H,Shimada S,Ito K,etal.CD133 is a marker of gland-forming cells in gastric tumors and Sox17 is involved in its regulation[J].Cancer Sci,2011,102:1313.

[10] Herold-Mende C,Campos B,Zeng L,etal.Expression and regulation of AC133 and CD133 in glioblastoma[J].Eur J Cancer,2011,47:S577.

[11] Matsumoto K,Arao T,Tanaka K,etal.mTOR signal and hypoxia-inducible factor-1 alpha regulate CD133 expression in cancer cells[J].Cancer Res,2009,69:7160.

[12] Fan X,Khaki L,Zhu TS,etal.NOTCH pathway blockade depletes CD133-positive glioblastoma cells and inhibits growth of tumor neurospheres and xenografts[J].Stem Cells,2010,28:5.

[13] Xi G,Li YD,Grahovac G,etal.Targeting CD133 improves chemotherapeutic efficacy of recurrent pediatric pilocytic astrocytoma following prolonged chemotherapy[J].Mol Cancer,2017,16:21.

[14] Xi G,Hayes E,Lewis R,etal.CD133 and DNA-PK regulate MDR1 via thePI3K- or Akt-NF-κB pathway in multidrug-resistant glioblastoma cells in vitro[J].Oncogene,2016,35:241.

[15] Kazama S,Kishikawa J,Kiyomatsu T,etal.Expression of the stem cell marker CD133 is related to tumor development in colorectal carcinogenesis[J].Asian Journal of Surgery,2017,12.:5576.

[16] Fathi A,Mosaad H,Hussein S,etal.Prognostic significance of CD133 and ezrin expression in colorectal carcinoma[J].IUBMB Life,2017,69:328.

[17] Wu B,Sun C,Feng F,etal.Do relevant markers of cancer stem cells CD133 and Nestin indicate a poor prognosis in glioma patients? A systematic review and meta-analysis[J].J Exp Clin Cancer Res,2015,34:44.

[18] Sun B,Wan Z,Shen J,etal.DNA hypomethylation of CD133 promoter is associated with recurrent glioma[J].Oncol Rep,2016,36:1062.

[19] Jang JW,Song Y,Kim SH,etal.CD133 confers cancer stem-like cell properties by stabilizing EGFR-AKT signaling in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett,2017,389:1.

[20] Sun H,Zhang M,Cheng K,etal.Resistance of glioma cells to nutrient-deprived microenvironment can be enhanced by CD133-mediated autophagy[J].Oncotarget,2016,7:76238.

(收稿2017-01-04 修回2017-03-12)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81301051)

430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科

雷德強(qiáng)

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.04.021

R730.2

A

1672-7770(2017)04-0318-03