青蒿素納米脂質(zhì)體的制備及其藥效學(xué)研究

陸慧(燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院生物系，河北 秦皇島 066004)

張海朝 栗坤(燕山大學(xué)，河北 秦皇島 066004)

青蒿素納米脂質(zhì)體的制備及其藥效學(xué)研究

陸慧(燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院生物系，河北 秦皇島 066004)

張海朝 栗坤(燕山大學(xué)，河北 秦皇島 066004)

目的：通過對青蒿素納米脂質(zhì)體的處方和制備工藝的研究，研制高包封率和高穩(wěn)定性的脂質(zhì)體。方法:采用薄膜水化法制備脂質(zhì)體，以正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方，測定脂質(zhì)體中藥物的包封率，并初步考察脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。結(jié)果:優(yōu)化處方與工藝所得脂質(zhì)體形態(tài)均勻，包封率大于43%，粒徑為194 nm，Zeta電位為-32.8 mV；在-4℃條件下，觀察這些藥品貯存2周和4周后，無顯著變化，具有良好的穩(wěn)定性。采用U14宮頸癌荷瘤小鼠模型研究青蒿素納米脂質(zhì)體的抗腫瘤效果，其抑制率為71.86%，與青蒿素水溶液比較有較好的抗腫瘤效果（P＜0.01）。結(jié)論:薄膜水化法制備脂質(zhì)體工藝簡便，制備出的脂質(zhì)體包封率高，穩(wěn)定好，抑瘤率高。

青蒿素；脂質(zhì)體；薄膜水化法；包封率；抑瘤率

青蒿素（Artemisinin）是從青蒿、黃花蒿等植物中分離提取出來的具有過氧化基團(tuán)的倍半萜內(nèi)脂類化合物，青蒿琥珀（Artesunate）和雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin）等均為青蒿素的衍生物[1]。青蒿素類藥物不僅是目前抗瘧特效藥，還可以選擇性抑制和殺滅多種腫瘤細(xì)胞，具有良好的耐受性，毒副作用較小，具有顯著的抗腫瘤作用[2]。1992年鄧安定首次報(bào)道了青蒿素衍生物對小鼠白血病P388細(xì)胞具有一定的殺傷活性[3]。Efferth等人在研究青蒿琥酯對55種癌細(xì)胞株的抗癌活性時發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對白血病細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的抗癌活性最強(qiáng)，對黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤及腎癌細(xì)胞等有中度活性，對非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞的活性最弱[4]。目前該類藥物上市的劑型主要是普通的片劑、栓劑、注射劑，這類藥物在體內(nèi)代謝迅速、消除半衰期短、生物利用度低、瘧原蟲復(fù)燃率高等缺點(diǎn)[5]。因此，研發(fā)青蒿素類藥物新劑型以降低復(fù)燃率、增加溶解度、提高生物利用度、增強(qiáng)靶向和緩釋作用已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。本研究利用大豆卵磷脂、膽固醇等來制備青蒿素納米脂質(zhì)體，以提高藥物的穩(wěn)定性、緩釋效果和藥物的治療指數(shù)。

1 材料與儀器

青蒿素（Artemisinin）、大豆磷脂酰膽堿（SPC，AR）、膽固醇（CHOL，AR）、甲醇（CH2OH，AR）、二氯甲烷（CH2Cl2，AR）、U14宮頸癌細(xì)胞株。

JY-2002型電子天平（上海精密儀器有限公司）；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海申生科技有限公司）；超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī)（Beck? man Coulter）；722s型紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；Zetasizer Nano-90激光粒度測定儀（Malvren公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 工藝設(shè)計(jì)與優(yōu)化

2.1.1 工藝設(shè)計(jì)

通過有關(guān)文獻(xiàn)[6]及單因素考察實(shí)驗(yàn)，分析確定了影響青蒿素納米脂質(zhì)體包封率的4個主要因素，即脂質(zhì)體與藥物的質(zhì)量比（A）、大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比（B）、甲醇與二氯甲烷的體積比（C）、成膜的溫度（D）。采用正交試驗(yàn)來篩選處方，各因素取3水平，以包封率和載藥量為指標(biāo)，選用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，制備1～9號脂質(zhì)體。以包封率為衡量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)進(jìn)行直觀分析。由方差分析可知：包封率的影響因素大小為A＞D＞B＞C，A對包封率有顯著影響，C無顯著影響，其中最優(yōu)工藝條件為：A（10:1）、B（2:1）、C（2:4）、D（40）。即大豆卵磷脂80mg，膽固醇20mg，甲醇2ml，二氯甲烷4ml，青蒿素10mg，成膜溫度40℃。

2.1.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按優(yōu)選工藝制備3批青蒿素納米脂質(zhì)體，平均包封率為43%。表明優(yōu)選處方和工藝得到的青蒿素納米脂質(zhì)體穩(wěn)定可行。電子顯微鏡下觀察，所得3批青蒿素納米脂質(zhì)體形態(tài)圓整，粒徑小而均勻。

2.2 青蒿素納米脂質(zhì)體的制備工藝

采用薄膜水化法制備脂質(zhì)體，按正交試驗(yàn)得到的最佳處方組成，固定其余各原料用量。稱取適量大豆卵磷脂、膽固醇、青蒿素加入到25ml茄型瓶中，再向瓶中加入二氯甲烷和甲醇，放入超聲儀中超聲2min使其充分溶解。然后再將此混合溶液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃水浴下進(jìn)行梯度抽真空使其均勻成膜。加入一定量的超純水充分水和，在60℃水浴下震蕩水化30min使膜脫落，在60℃水浴中超聲20min至形成脂質(zhì)體水性懸濁液，經(jīng)過0.45um和0.22um濾膜過濾2次，即得青蒿素納米脂質(zhì)體。置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。同法制得空白納米脂質(zhì)體。

2.3 脂質(zhì)體的表征

2.3.1 物理和化學(xué)性質(zhì)

在制備脂質(zhì)體時有許多因素需要考慮，包括技術(shù)和處方的因素。經(jīng)過多次處方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲得了最佳制備工藝?？瞻准{米脂質(zhì)體是泛藍(lán)光的乳懸液，青蒿素納米脂質(zhì)體是淡黃色的混懸液。

2.3.2 脂質(zhì)體電鏡觀察

取少量青蒿素納米脂質(zhì)體蒸餾水稀釋，滴至載玻片上，用磷鎢酸負(fù)染，再滴至專用銅網(wǎng)上，自然揮干，使粒子在銅網(wǎng)上沉積，電鏡下觀察，脂質(zhì)體為粒徑較均勻的球狀或近球狀小囊泡，彼此分離，粒徑約為200 nm，空白納米脂質(zhì)體和青蒿素納米脂質(zhì)體的形狀是球形，表面光滑，多為單室脂質(zhì)體。

2.3.3 Zeta電位及粒徑與粒度測定

青蒿素納米脂質(zhì)體用Zetasizer Nano-90激光粒度測定儀進(jìn)行粒徑分布測定，可見青蒿素納米脂質(zhì)體粒徑集中分布在150～220nm范圍內(nèi)；Zeta電位平均值為-32.8mV。

2.3.4 包封率的測定

青蒿素溶解在超純水和甲醇混合溶劑（V/V 1：2）中，得到濃度為100μg/ml的溶液，然后將混合物稀釋為50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml。然后使用紫外可見分光光度計(jì)在λmax=275nm的波長下進(jìn)行檢測青蒿素含量。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度為縱坐標(biāo)y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得吸光度y與青蒿素濃度x線性范圍為3.125～50μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y= 69.4069X+0.5699（R2=0.9827）。青蒿素溶液的紫外可見吸收光譜。用超速離心法分離未包封的藥物，取適量的青蒿素納米脂質(zhì)體在50000r/min下離心40min。然后，將未包封的青蒿素溶解在超純水和甲醇混合溶劑（V/V 1：2）中，按上述方法檢測青蒿素含量。其濃度根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出。藥物包封率（EE%）用下面的公式（1）來計(jì)算。

公式（1）：EE%={W(total)-W(free)}/W(total)×100%

2.4 青蒿素納米脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究

2.4.1 小鼠腫瘤模型的建立

在三只小鼠腹腔內(nèi)注射0.3 ml濃度為1×107個/ml的U14宮頸癌細(xì)胞。當(dāng)小鼠腹部明顯變大時，抽出腹水生理鹽水稀釋為1×106個/ml，取0.3 ml宮頸癌細(xì)胞小鼠前肢腋下，接種后第三天，腫瘤在小鼠腋下生長良好，表明接種成功，成功率為100%。成功接種的小鼠分成4組，每組8只，命名如下：

陰性對照組：生理鹽水靜脈注射（0.4 ml/只）；

陽性對照組：青蒿素（80 mg/kg），灌胃0.2 ml/只，根據(jù)課題組前期研究表明，這種劑量青蒿素對腫瘤生長有明顯的抑制作用；

青蒿素組：青蒿素靜脈給藥，0.4 ml/只；

青蒿素納米脂質(zhì)體組：青蒿素納米脂質(zhì)體靜脈給藥，0.4 ml/只。

所述小鼠施用上述制劑15天。在16日當(dāng)天，處死小鼠，然后從小鼠體內(nèi)取出腫瘤組織并稱重，以檢測抑瘤率。

抑瘤率分別根據(jù)公式2計(jì)算：

（公式2）：抑瘤率=（陰性對照組腫塊-實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量）/陰性組腫瘤質(zhì)量×100%

2.4.2 青蒿素納米脂質(zhì)體對腫瘤的抑制作用

青蒿素納米脂質(zhì)體組與陽性對照組對腫瘤生長的抑制作用無差異；青蒿素納米脂質(zhì)體抑瘤作用明顯（P＜0.01）。與陽性對照組相比較，★P＜0.05；與青蒿素組相比較，◆P＜0.01。

3 討論

本試驗(yàn)所用的成膜材料為大豆卵磷脂和膽固醇，其中膽固醇可以調(diào)節(jié)膜的流動性，一定比例的膽固醇可減少膜的穩(wěn)定性，增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，從而提高包封率。通過本實(shí)驗(yàn)可以看出大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為4:1時包封率最高。在本實(shí)驗(yàn)中，影響脂質(zhì)體包封率的一個重要因素是藥物與脂質(zhì)的質(zhì)量比。在多次的處方優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，藥物濃度過高或過低都會影響脂質(zhì)體的包封率，隨著藥物濃度的增大，包封率先增大后減小，說明青蒿素納米脂質(zhì)體的包封率可能具有飽和性[6]。一般情況下，包封率會隨著藥脂比的增高而提高。本實(shí)驗(yàn)在制備青蒿素納米脂質(zhì)體混懸液過程中，對梯度抽真空和吹氮?dú)獾姆椒ㄟM(jìn)行了考察。結(jié)果表明，梯度抽真空法更適合青蒿素納米脂質(zhì)體的制備。所得脂質(zhì)體形態(tài)圓整，包封率高，且處方穩(wěn)定性好，方法操作簡單，而吹氮?dú)夥ㄙY金花費(fèi)更大。Zeta電位的測量結(jié)果可以用于預(yù)測脂質(zhì)體分散體系的物理穩(wěn)定性。一般情況下，Zeta電位絕對值越大，說明脂質(zhì)體之間的經(jīng)典排斥力越大，體系越不容易發(fā)生聚集，穩(wěn)定性越高。本實(shí)驗(yàn)制得的青蒿素納米脂質(zhì)體平均電位為-32.8mV，說明體系較穩(wěn)定。在本實(shí)驗(yàn)中，通過對小鼠的抑瘤率的檢測，最終結(jié)果說明青蒿素納米脂質(zhì)體明顯改善了青蒿素的生物利用度，達(dá)到了改善青蒿素生物利用度的目的。

因此，研究表明，青蒿素納米脂質(zhì)體將成為未來癌癥治療的一個有效的運(yùn)載工具。

[1]樊嶸,謝紅,楊磊等.青蒿素及其衍生物抑制K562細(xì)胞生長作用比較[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,15(3):199-201.

[2]溫悅,孟德勝.青蒿素類藥物藥理作用研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007,10(4)：1193-1195.

[3]鄧定安.有抗腫瘤活性的青蒿B衍生物[J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 1992,27(4):317-320.

[4]EFFERTHT,DUNSTANH,SAUERBREYA,et al.Theantimalarial artesunateisal so active against cancer[J].Int J Oncol, 2001,18(4):767-773.

[5]張東,王滿元,楊嵐.青蒿素類藥物新制劑研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志,2015,03.001.

[6]瞿建江,馮淑華.青蒿素納米脂質(zhì)體的制備及性能研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)2010,09:14-22.

[7]SHEN X K,YAN K D,LUO Z Y,et al.Determination of ar?teannuin element content by the ultraviolet spectrophotometric[J]. J Pharm Anal,1983(3):24-26.