三聚體納米顆粒自組裝過程的分子動力學(xué)模擬

馮 濤，王 珂，周進杰，Deepak Bhopatkar，陳 楓， Osvaldo Campanella，Bruce R. Hamaker，Marcelo Carignano，莊海寧

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三聚體納米顆粒自組裝過程的分子動力學(xué)模擬

馮 濤1,2，王 珂1，周進杰1，Deepak Bhopatkar2，陳 楓3， Osvaldo Campanella2，Bruce R. Hamaker2，Marcelo Carignano4，莊海寧5

（1. 上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2. 普度大學(xué)食品科學(xué)系惠斯特勒碳水化合物研究中心，西拉法耶特市47906-2009；3. 普度大學(xué)信息技術(shù)中心羅森高級計算中心，西拉法耶特市47907-21084；4. 卡塔爾環(huán)境與能源研究所，多哈 5825；5. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海 201403）

為了更深入理解直鏈淀粉/-乳球蛋白/-亞油酸三元復(fù)合物體系自組裝行為的機制，該研究借助Gromacs軟件，采用分子動力學(xué)模擬對玉米直鏈淀粉、-乳球蛋白、-亞油酸三者在373 K溫度下的結(jié)合過程進行研究。通過三元納米粒子在500 ns內(nèi)的自組裝快照圖，可以得出直鏈淀粉、-亞油酸、-乳球蛋白3種組分的結(jié)合順序。通過三元納米粒子的自由能曲面圖，可知該三元納米粒子的形成是熱力學(xué)自發(fā)的過程。進一步對其水合半徑及溶劑可接觸表面積的分析表明，該三元復(fù)合物納米顆粒溶解性良好。研究闡釋了水溶性自組裝納米顆粒的形成機理，為納米科學(xué)領(lǐng)域?qū)ふ液线m的壁材提供了一種新的研究途徑。

納米顆粒；分子動力學(xué)；自組裝；直鏈淀粉；-乳球蛋白；-亞油酸

0 引 言

許多食物中含有納米級成分，它們通常是很重要的原料，如淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等。在食品加工過程中，這些分子會在納米或微米尺寸上發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。直鏈淀粉作為主要的食物成分，可以用作增稠劑、穩(wěn)定劑、吸附劑[1]等。直鏈淀粉現(xiàn)在已經(jīng)在主-客體包合[2-3]、提高碳納米管的生物相容性[4]、藥物和風(fēng)味成分[5]方面取得了顯著的成功。淀粉顆粒被加熱后可以釋放出生物聚合物，這些生物聚合物能夠重結(jié)晶形成納米結(jié)構(gòu)，例如，重結(jié)晶的直鏈淀粉區(qū)域約為10～20 nm。-乳球蛋白因具有優(yōu)良的凝膠性、持水性、起泡性而廣泛被用做食品賦型劑、穩(wěn)定劑。此外，-乳球蛋白還具有轉(zhuǎn)運脂肪酸、脂質(zhì)和脂溶性維生素等功能[6]。天然的-乳球蛋白，長度約為 3.6 nm，在pH值、溫度、壓力等條件變化時可變性，在酸奶中，變性的-乳球蛋白可以聚集成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[8]。脂肪的主要成分為甘油三酯，是由1個甘油分子和3個長鏈的脂肪酸分子組成。甘油的分子比較簡單，而脂肪酸的種類和長短卻不相同。脂肪酸可以分兩大類：飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其中不飽和脂肪酸還可分為單元不飽和脂肪酸、多元不飽和脂肪酸。王存芳等[7]探討不同壓力條件及不同加熱方式對嶗山奶山羊乳中各脂肪酸、短鏈脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸組成的影響，表明超高壓處理能夠更好的保持羊乳中脂肪酸的含量及組成。脂肪，例如單甘酯可以組裝形成甘油三酯結(jié)晶（10～100 nm）[8]。目前已有研究者將單一形成納米材料的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪組合在一起進行研究。

Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)由淀粉、乳清蛋白、游離脂肪酸組成的較稀三元體系，在沸水浴中不斷攪拌加熱后形成了一種水溶性三元體系。根據(jù)他們的高效體積排阻色譜（high- performance size exclusion chromatography，HPSEC）檢測、碳水化合物和碘親和力分析，發(fā)現(xiàn)淀粉/蛋白質(zhì)曲線沒有跡象表明復(fù)合物形成，只有當?shù)矸邸⒌鞍踪|(zhì)、游離脂肪酸三種組分都存在時，一種新的淀粉/游離脂肪酸/蛋白質(zhì)分子復(fù)合物才會形成，這說明游離脂肪酸在連接淀粉和蛋白質(zhì)方面發(fā)揮了重要的作用，但尚不清楚這種現(xiàn)象發(fā)生的機制。Zhang等[10]還用不同的谷物面粉進行試驗，發(fā)現(xiàn)分別來自高粱、玉米、大米、小米、小麥的5種面粉在快速黏度分析儀測得的曲線上有相似的冷卻階段黏度峰值。這種在冷卻階段出現(xiàn)的黏度峰值，與糊化曲線上在95 ℃出現(xiàn)的黏度峰值不同，是由于面粉中淀粉/游離脂 肪酸/蛋白質(zhì)的相互作用。這說明淀粉、蛋白質(zhì)和游離脂肪酸這3種成分的相互作用在食品體系中是一個普遍的現(xiàn)象。Zhang等[11]進一步研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸是連接熱力學(xué)不相容的直鏈淀粉和蛋白質(zhì)分子的橋梁，游離脂肪酸的羧基官能團是形成這種復(fù)雜的三元體系的必需結(jié)構(gòu)。此外，鹽處理和pH值的影響表明蛋白質(zhì)所帶的正電荷和游離脂肪酸羧基所帶的負電荷之間的靜電相互作用可能是復(fù)合物自組裝的基礎(chǔ)。這種自組裝的復(fù)合物可以用作控釋的疏水性功能物質(zhì)的納米載體，來保持疏水性功能物質(zhì)的水溶性、生物活性等。盡管直鏈淀粉--乳球蛋白-游離脂肪酸水溶性納米粒子體系已在實驗室進行研究，但在分子水平上對其形成機理的研究還很少。

計算機模擬為研究復(fù)雜體系的自組裝行為提供了另一種途徑，通過模擬可以研究直鏈淀粉的折疊和絡(luò)合行為。Sattelle和Almond12]通過圖形處理器（graphic processing unit，GPU）加速全原子模擬來探索直鏈淀粉單螺旋和雙螺旋在水中運動的微秒動力學(xué)，經(jīng)過10s的模擬，得出在微秒時間范圍內(nèi)雙螺旋比單螺旋穩(wěn)定，雙螺旋平行構(gòu)象比反平行構(gòu)象穩(wěn)定。López等[13]利用分子動力學(xué)技術(shù)研究了直鏈淀粉在脂質(zhì)存在下的折疊和絡(luò)合行為。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在水溶液中直鏈淀粉片段保持一個擴展左手螺旋結(jié)構(gòu)，再往體系中加入脂質(zhì)后，可以觀察到直鏈淀粉鏈自發(fā)折疊成螺旋結(jié)構(gòu)。Lee等[14]利用分子動力學(xué)模擬研究了均一的兩親性肽（peptide amphiphile，PA）的混合水溶液，兩親性肽分子進入柱形纖維膠束起點的自組裝過程，發(fā)現(xiàn)PA分子首先形成球狀微膠束，接著微膠束在范德華力作用下形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，然后三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)了一種直徑為8×10-9m的纖維結(jié)構(gòu)。Wang等[15]為了了解紫杉醇被殼聚糖/水楊酸（chitosan oligosaccharide/salicylic acid，COS/SA）包埋的過程，進行了全原子分子動力學(xué)模擬來分析COS/SA分子聚合物，發(fā)現(xiàn)范德華力和疏水相互作用是紫杉醇包埋過程中的主要作用力。Xie和Soh[16]使用分子動力學(xué)技術(shù)探討直鏈淀粉和單壁納米管片段之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)范德華力是兩者之間的主要作用力，直鏈淀粉與納米管的包埋受納米管大小的影響。Bhopatkar[17]等為了研究直鏈淀粉/-乳球蛋白/亞油酸三聚體納米膠囊包埋1-萘酚的作用機制，利用Gromacs軟件進行了分子動力學(xué)模擬，得出直鏈淀粉、亞油酸、-乳球蛋白組裝成四聚體復(fù)合物的過程吉布斯自由能變小于零，是熱力學(xué)有利的，1-萘酚位于直鏈淀粉的螺旋空腔里，并接近亞油酸的疏水尾部。

分子動力學(xué)研究可以揭示三元聚合物納米粒子的原子結(jié)構(gòu)。分子模擬是目前常用的一種對分子行為進行解釋或預(yù)測的研究方法，廣泛地應(yīng)用于各學(xué)科領(lǐng)域中[18]。分子動力學(xué)模擬是生物大分子理論研究的一種主要工具。目前，利用分子動力學(xué)模擬進行生物大分子的研究，主要集中在蛋白質(zhì)和核酸上，對于淀粉及其與其他生物大分子形成納米粒子的研究很少。在本研究中，我們用Gromacs模擬了玉米直鏈淀粉-乳球蛋白--亞油酸三元體系的自組裝過程。與之前研究的直鏈淀粉與風(fēng)味分子體系相比，模擬時間由1 ns增加到了500 ns，使所得到的結(jié)果更有說服力；在之前研究的直鏈淀粉、-亞油酸體系的基礎(chǔ)上，又引入了-乳球蛋白，利用全原子模擬分析三元體系的動態(tài)行為，深入了解直鏈淀粉/-乳球蛋白/-亞油酸三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和形成過程，研究-乳球蛋白和-亞油酸對直鏈淀粉構(gòu)象的影響，三元復(fù)合物的溶解性質(zhì)和三元復(fù)合物形成過程中的結(jié)構(gòu)和自由能變化，為直鏈淀粉/-乳球蛋白/-亞油酸三元復(fù)合物作為壁材輸送不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。同時該研究為納米科學(xué)領(lǐng)域?qū)ふ液线m的壁材提供了一種新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

50%（質(zhì)量分數(shù)）直鏈玉米淀粉（美國Cargill公司）；-乳球蛋白；亞油酸（C18:3）（美國Sigma化學(xué)公司）

1.2 三元納米粒子的制備和成像

根據(jù)Zhang等[10]的方法制備納米粒子懸浮液，以20 : 2 : 1的質(zhì)量比，將熱水提直鏈淀粉上清液和-乳球蛋白（10 mg/mL）溶液，亞油酸混合。混合物置于沸水浴加熱20 min，攪拌轉(zhuǎn)速450 r/min，然后25 ℃下攪拌冷卻4 h。

利用高效體積排阻色譜（high-performance size exclusion chromatography，HPSEC）-多角度光散射（multi angle lightscatter，MALS）和折光率（refractive index，RI）檢測器聯(lián)用，純化納米粒子。純化條件：懸浮液過0.45m微孔濾膜，取100L注射到Sephacryl HR-500（美國通用電氣醫(yī)療集團）填充柱，流動相為0.02% 疊氮化鈉水溶液，流速1.3 mL/min。光散射檢測系統(tǒng)，配有658 nm GaAs激光二極管的Dawn Heleos-II型MALS檢測器和OptilabrEx RI檢測器（美國懷亞特科技公司）。數(shù)據(jù)收集和分析軟件為檢測器自帶的ASTRA 5.3.4.10。光散射數(shù)據(jù)利用Zimm法，即1.46d/d（d/d為納米粒子懸浮液的折射梯度）來計算納米粒子的平均分子質(zhì)量和平均半徑根。

此外，注射500L納米粒子懸浮液到相同的HPSEC系統(tǒng)中利用餾分收集器收集而得純化樣品，用于成像分析。取3.5L懸浮液涂布到碳涂層?xùn)鸥?，并在液態(tài)乙烷（-135 ℃）中玻璃化。用Philips CM200 FEG透射電鏡(荷蘭飛利浦公司)對柵格檢測，圖片放大38 000倍。

1.3 直鏈淀粉、-乳球蛋白和-亞油酸的模型

本研究采用由Gregor博士提供的V-型直鏈淀粉分子模型進行研究[19]，該模型具有一個由55個葡萄糖殘基組成6個每圈的左手螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)徑約55 nm，外徑約135 nm，長度約738 nm。

本模擬中采用的-乳球蛋白為Uhrinova等[20]確定的核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）結(jié)構(gòu)，所在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的文件名為1DV9.pdb。根據(jù)Zhang等[11]的報道，我們選擇從67號-101號氨基酸的肽段（LYS LYS ILE ILE ALA GLU LYS THR LYS ILE PRO ALA VAL PHE LYS ILE ASP ALA LEU ASN GLU ASN LYS VAL LEU VAL LEU ASP THR ASP TYR LYS LYS）以簡化體系，本段肽鏈含有大量的LYS殘基，可以和游離脂肪酸的羧基之間產(chǎn)生靜電相互作用。然后用PRODRG服務(wù)器（http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg/）[21]生成-乳球蛋白起始結(jié)構(gòu)。

-亞油酸的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）文件下載自：http://xray.bmc.uu.Se /hicup/EIC/。然后用PRODRG服務(wù)器（http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/ prodrg/）[21]生成-亞油酸起始結(jié)構(gòu)。

1.4 力場

根據(jù)Damm等[22]和Kony等[23]確定葡萄糖的力場參數(shù)，所有的模擬由葡萄糖對直鏈淀粉的力場設(shè)定而計算。原子的標注如圖1所示，原子的變化如表1所示。由于糖苷鍵的不同，GLC、GLM和GLK分別被命名代表直鏈淀粉上葡萄糖殘基的起點、中間和末端。LA代表-亞油酸，LGP代表-乳球蛋白肽鏈。圖1中的數(shù)字標號對應(yīng)于表1最后一列的原子編號。

注：碳原子被染成綠色，氧原子被染成紅色，氫原子被染成灰色。圖1中的數(shù)字標號對應(yīng)于表1中的原子編號。

表1 葡萄糖力場中葡萄糖拓撲結(jié)構(gòu)原子變化

1.5 分子動力學(xué)模擬過程

蛙跳式運動路線由Gromacs 4.6.1（歐洲研究委員會生命科學(xué)可擴展軟件服務(wù)事務(wù)中心）分子動力學(xué)（MD）軟件進行設(shè)定，使用2×10-15s時間步長。模擬步數(shù)為 250 000 000，總運行時間為500 ns。利用LINCS算法限制所有的鍵長（迭代次數(shù)，用于lincs約束精度）=1，（約束耦合矩陣階次，用于lincs精度）=4。調(diào)整不同組間的Berendsen熱電偶，弛豫時間為0.1 ps，保持溫度為 373 K，壓力保持在1.0×105Pa，松弛時間2×10-12s。利用相鄰柵格切除方案處理非化學(xué)鍵相互作用。短距離內(nèi)的相鄰分子列表截止距離為0.9 nm，計算列表中每個時間步之間的相互作用。伴隨每隊列表的更新，分別同時計算短距靜電截止半徑0.9 nm，長距范德華力截止半徑1.4 nm[13]。

1.6 三元納米粒子模擬和分析

三元納米粒子由55個葡萄糖殘基的直鏈淀粉鏈、-乳球蛋白肽鏈和-亞油酸組成，該粒子被放在充滿 11 272 mol水分子的10 nm × 6 nm × 6 nm長方體內(nèi)。水的模擬模型為TIP4P，直鏈淀粉鏈在-亞油酸附近與-乳球蛋白肽或-亞油酸進行預(yù)結(jié)合，由于整個體系靜電荷為+4，加入4 mol氯離子以中和初始狀態(tài)。在分子動力模擬產(chǎn)生時間之前，利用最速下降算法將鏈的內(nèi)能最小化。然后，模擬運行500 ns以獲得此三元結(jié)構(gòu)在水環(huán)境中的平衡結(jié)構(gòu)。模擬的起始結(jié)構(gòu)如圖2所示，模擬起始結(jié)構(gòu)的搭建是根據(jù)試驗結(jié)果進行的，接近于現(xiàn)實，符合物理原理，親水基團親水。該模型的運算和分析均在Gromacs 4.6.1軟件上執(zhí)行。

1.7 自由能曲面圖分析

利用0～500 ns間三元納米粒子體系上-亞油酸和直鏈淀粉主鏈之間的均方根偏差（Root mean square deviation，RMSD）和回轉(zhuǎn)半徑（Radius of gyration，()）制作出體系的自由能曲面圖。圖生成后，在0、100、200、300、400和500 ns處分別填上它們的RMSD和()值。因此，可以畫出500 ns內(nèi)系統(tǒng)的自由能變化曲線，其他具體信息參照Felts等[24]的報道。

注：直鏈淀粉中氧原子被染成紅色，碳為白色，氫為藍色。圖中著重強調(diào)使用主鏈（GLC_GLM_GLK）和α-亞油酸（LA）、主鏈和β-乳球蛋白肽（LGP），β-乳球蛋白肽和α-亞油酸之間的距離作為標記位點，以估算主鏈和LA、主鏈和LGP以及LA和LGP區(qū)域間距離，下同。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米粒子

圖3a顯示了純化納米粒子的冷凍透射電鏡視圖，圖上圓圈內(nèi)密集的納米粒子表示較少的包埋和單個的納米粒子。圖上的納米粒子結(jié)構(gòu)方向各異，但當看到全部的水平視野時，它們便呈現(xiàn)出統(tǒng)一的形態(tài)和大?。ò魻?，寬10 nm，長40 nm）。雖然在筆者之前的試驗中已經(jīng)證實了直鏈淀粉、蛋白質(zhì)和-亞油酸自組裝的納米復(fù)合體（20～40 nm）存在，但均一的納米粒子是否是由其非特異性聚集或是自組裝而形成的，并不清楚。使用冷凍透射電鏡，雖然圖a，b兩者的放大倍數(shù)不同，但由于標尺線的差異，仍可看出兩者的微觀結(jié)構(gòu)上的差異，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)納米粒子顯示均一大小，這一現(xiàn)象表示在指定條件下這些大分子發(fā)生高度特異性的自組裝締結(jié)。圖3b顯示了只有直鏈淀粉的溶液中的非特異性聚集。

a. 直鏈淀粉-蛋白質(zhì)-脂肪酸納米粒子（×38 000）

a. Amylose-protein-fatty acid nanoparticles (×38 000)

b.淀粉（直鏈淀粉）上清液（×27 500）

b.Starch (amylose)supernatant (×27 500)

注：a圖圓圈內(nèi)可以看到離散的、均勻的棒狀結(jié)構(gòu)；b圖圓圈內(nèi)可以看到無定型聚集結(jié)構(gòu)。

Note: It can be seen as discrete, regular, rod-shaped structures in the circle of Fig. 3a; an amorphous aggregated structures can be seen in the circle of Fig.3b

圖3 純化的三元納米粒子和淀粉上清液冷凍透射電鏡圖

Fig.3 Cryo-TEM images of purified ternary nanoparticles and starch supernatant

2.2 三元納米結(jié)構(gòu)的動力學(xué)模擬

運行三元體系500 ns 分子動力學(xué)模擬，起點為理論構(gòu)象的柱形3D結(jié)構(gòu)（由葡萄糖構(gòu)成的3D柱形螺旋結(jié)構(gòu)， 每圈6個葡萄糖）。選擇此柱形結(jié)構(gòu)的依據(jù)為：1）試驗證明直鏈淀粉在水中的構(gòu)象是由多于100個葡萄糖單位組成的螺旋片段構(gòu)成，2）該結(jié)構(gòu)為絡(luò)合物中直鏈淀粉模擬提供了模板，這對闡明三元納米粒子的自組裝中-乳球蛋白肽和-亞油酸的作用具有重要的意義。如材料與方法部分1.6中所講，在直鏈淀粉中-乳球蛋白肽和-亞油酸都發(fā)生預(yù)絡(luò)合，模擬過程涵蓋了所有的原子。

圖4a顯示了三元納米粒子在500 ns內(nèi)的自組裝快照圖。該模擬顯示了所有結(jié)構(gòu)的實質(zhì)性重組，所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和初始狀態(tài)的柱形3D結(jié)構(gòu)（圖2）不同。在100 ns內(nèi)LA從直鏈淀粉上分開；在200 ns時LA從直鏈淀粉另一側(cè)再次進入直鏈淀粉，LGP將LA和直鏈淀粉環(huán)繞；接著，300 ns時LA被包裹在直鏈淀粉片段的中部，而LGP從LA和直鏈淀粉上分出；400 ns時，LA仍被包裹在淀粉片段的中間位置，LGP靠近直鏈淀粉和LA；最終，在500 ns時，LA保持在原有位置，LGP再次將LA和直鏈淀粉環(huán)繞，形成棒狀構(gòu)象。該結(jié)構(gòu)與圖3a中的納米粒子圖相當一致。

為定量分析構(gòu)象的轉(zhuǎn)變過程，分別測定了主鏈（GLC-GLM-GLK）、LA和LGP之間的相互間距（圖4b）。500 ns內(nèi)主鏈與LA之間距離從約3.5 nm降低到0.5 nm，而主鏈與LGP間距由5.0 nm降低到2.0 nm，LA與LGP間距由3.0 nm減少到2.0 nm。域間距離軌跡圖（圖4b）說明LA相對于直鏈淀粉主鏈的移動在200 ns處存在轉(zhuǎn)折點，表明LA再次進入直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)；LGP相對于直鏈淀粉主鏈移動在100 ns處存在轉(zhuǎn)折，而LA相對于LGP移動在100 ns時距離最近，并直到150 ns時才增加，在220 ns時兩者再次接近，并直到250 ns才增加，350 ns處第三次接近，隨后直到500 ns結(jié)束，其距離才略增加2 nm。表明LA在穩(wěn)定體系方面發(fā)揮著比LGP更重要的作用。因此，我們的模擬可以得出在500 ns內(nèi)可以達到平衡狀態(tài)。模擬軌跡和Zhang等[9]的研究結(jié)果游離脂肪酸在連接淀粉和蛋白質(zhì)方面發(fā)揮了重要的作用相吻合，表明分子動力學(xué)模擬可以精確地表現(xiàn)出-乳球蛋白肽和亞油酸對直鏈淀粉構(gòu)象的影響。根據(jù)構(gòu)型中觀察到的LA-依賴性變化，可以推測出V型直鏈淀粉和游離脂肪酸之間穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并不依賴于小分子特定的初始絡(luò)合位點和方向，而是在直鏈淀粉上有最終穩(wěn)定的絡(luò)合位點。

2.3 三元體系的溶劑可接觸表面

模擬過程一開始三元納米粒子的疏水區(qū)域面積立刻變小，接著便保持在42.5 nm2左右，其變小原因為三元結(jié)構(gòu)的擴展，促進了鏈與水分子之間的接觸。疏水區(qū)域面積的降低意味著疏水性受到影響，隨著暴露的疏水性區(qū)面積減小，疏水區(qū)域周圍的水分子釋放到本體溶液中。從圖5可以看出，親水區(qū)域面積在模擬過程中，一直大于疏水區(qū)域面積，所以宏觀上來看，直鏈淀粉/-乳球蛋白/-亞油酸三元復(fù)合物表現(xiàn)出親水特性大于疏水特性的特點，即該三元復(fù)合物是水溶性的。溶劑可接觸總面積最后穩(wěn)定在90 nm2左右，與模擬初始相比，總面積明顯降低，溶劑可接觸面積的降低是由于三元體系構(gòu)象折疊，使其與水接觸的表面積減少。

圖5 三元納米體系溶劑可接觸表面積（SASA）

solv代表三元復(fù)合物溶解在水中的自由能，當solv小于0時，溶劑化作用將是熱力學(xué)有利的，在該 研究中，solv是一個負值，在圖5中顯示出來的solv是一個絕對值，三元體系的溶劑化過程表現(xiàn)出溶劑化自由能先降低后增加，最終穩(wěn)定的一個趨勢，這說明直鏈淀粉/-乳球蛋白/-亞油酸三元復(fù)合物溶劑化過程是一個復(fù)雜的熱力學(xué)自發(fā)過程。自發(fā)過程的驅(qū)動力及組分之間的相互作用力將在以后進行深入研究。

2.4 三元體系的回轉(zhuǎn)半徑

回轉(zhuǎn)半徑是直接反映三元復(fù)合物溶解性質(zhì)的主要特征之一。依據(jù)三元納米粒子回轉(zhuǎn)半徑的變化，可以闡明三元體系更多的信息。圖6顯示了水溶液中三元納米粒子的回轉(zhuǎn)半徑與模擬時間的變化曲線。為觀察水對直鏈淀粉主鏈、LGP和LA回轉(zhuǎn)半徑大小的影響，圖6分別繪制了這3種結(jié)構(gòu)域在水溶液中的回轉(zhuǎn)半徑變化趨勢圖。水溶液中直鏈淀粉主鏈的回轉(zhuǎn)半徑可以分為3個階段，與構(gòu)象的變化相對應(yīng)。第一階段（0<<200 ns），水溶液中三元納米粒子中直鏈淀粉主鏈的回轉(zhuǎn)半徑降到最低，()=2.25 nm。()減小的原因可能是因為LA和LGP從主鏈上分離，而造成主鏈縮緊（圖4b）。第二階段（200 ns<<350 ns），因為LA與主鏈之間的作用力大于LA與LGP間的作用力，所以當主鏈再次包裹LA時，立即引起主鏈擴展，直鏈淀粉的回轉(zhuǎn)半徑漸漸增加（圖4a）。當三元體系中直鏈淀粉的回轉(zhuǎn)半徑增加到最大4.13 nm后略有降低。第三階段（350 ns<<500 ns），主鏈的回轉(zhuǎn)半徑便在4 nm處上下振動，沒有大幅度變化。在平衡階段，水溶液中納米粒子的主鏈回轉(zhuǎn)半徑均值約為4 nm，這表明三元納米粒子在水中被拉長。試驗結(jié)果與水溶液中聚丙烯酰胺和十二烷基硫酸鈉自組裝分子動力學(xué)模擬結(jié)果相吻合[25]，這說明在模擬過程中，可以通過監(jiān)測分子的回轉(zhuǎn)半徑來反應(yīng)模擬體系的特性。

注: 直鏈淀粉，LGP，LA。

至于LA，其回轉(zhuǎn)半徑基本沒有變化，()值一直在0.7 nm左右，表明不論模擬時間怎樣變化，LA的回轉(zhuǎn)半徑都不會受到體系中其他結(jié)構(gòu)域的影響。而LGP的()值變化就比較復(fù)雜，三元水合物中LGP的回轉(zhuǎn)半徑在1.0～2.5 nm，這也許和不同構(gòu)象變化有關(guān)。

2.5 三元納米粒子自由能曲面圖

圖7顯示了從初態(tài)到終態(tài)（500 ns）間，3種組分在自組裝過程中自由能曲面圖，快照間隔時間為100 ns。圖7中橫坐標均方根偏差（root mean square deviation, RMSD）表示均方根偏差，左側(cè)縱坐標軸表示回轉(zhuǎn)半徑，右側(cè)縱坐標軸表示自由能。與自由能的關(guān)系是ln()，是和RMSD的或然率。依據(jù)圖1所列的成分，初始狀態(tài)時（圖7，區(qū)域1）自由能為41.0 kJ/mol，大于0，是熱力學(xué)不利的；到第2區(qū)域（圖7，區(qū)域2）自由能迅速變?yōu)?2.6 kJ/mol，此時的復(fù)合物分離成直鏈淀粉主鏈-LGP和LA兩部分；接著在第3區(qū)域（圖7，區(qū)域3）3個組分重新聚集，自由能降低為20.9 kJ/mol；在自由能為8.8 kJ/mol時，LA和直鏈淀粉連在一起，而LGP脫離了三元體系（圖7，區(qū)域4）；然后，當三類成分將完成自組裝時，自由能進一步降低到4.0 kJ/mol（圖7，區(qū)域5）；最終，在500 ns時，自由能為0.13 kJ/mol（圖7，區(qū)域6），LA位于直鏈淀粉中部螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)，LGP環(huán)繞在LA羧基所在位置的直鏈淀粉附近。3種組分自發(fā)的自組裝過程對應(yīng)的自由能降低，表明該過程是一個熱力學(xué)自發(fā)的過程。這與田耀旗[26]的報告直鏈淀粉與-環(huán)糊精的相互作用能在達到一極小值時，直鏈淀粉與-環(huán)糊精分子能進行最佳的復(fù)合相一致。

注：圖中數(shù)字代表如圖3a所示的每隔100 ns快照圖。

3 結(jié) 論

本文利用Gromacs軟件進行分子動力學(xué)模擬，揭示了直鏈淀粉/-乳球蛋白/-亞油酸這一三元復(fù)合物自組裝的機制，得到以下結(jié)論：直鏈淀粉、-乳球蛋白、-亞油酸三者結(jié)合過程中構(gòu)象發(fā)生了大規(guī)模的轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是在直鏈淀粉上自然發(fā)生的。-亞油酸 (-linoleic acid，LA)是直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)形成所必需的。LA促進形成直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)對穩(wěn)定直鏈淀粉具有重要作用。-乳球蛋白(-lactoglobulin, LGP)由LA吸引，增加了納米粒子的穩(wěn)定性。直鏈淀粉、-乳球蛋白、-亞油酸三者結(jié)合形成三元納米粒子的過程是一個熱力學(xué)自發(fā)的過程且該三元納米粒子溶解性良好。

致謝：感謝國家自然科學(xué)基金（31371736）對本研究支持。感謝美國普度大學(xué)羅森高級計算機中心為我們提供超級計算機方面的GPU資源。

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Molecular dynamics simulation of self-assembling process of ternary nanoparticle

Feng Tao1,2, Wang Ke1, Zhou Jinjie1, Deepak Bhopatkar2, Chen Feng3, Osvaldo Campanella2, Bruce R. Hamaker2, Marcelo Carignano4, Zhuang Haining5

(1.201418,;2.47906-2009,;3.47907-2108,;4.5825,; 5.201403,)

Ternary complex system of amylose/whey protein/free fatty acid has attracted significant interest in food nutraceuticals or functional compounds in food delivery systems due to the well-known low toxicity, excellent biocompatibility, and solubility. Maize amylose,-lactoglobulin,-linoleic acid were self-assembled and characterized by the TEM. Then, in order to understand the mechanism of the self-assembling actions of such a ternary system (interaction among amylose,-lactoglobulin and-linoleic acid) deeply, all-atom molecular dynamics simulations were performed to analyze the self-assembling of the 3 components by the Gromacs software. An amylose segment of 55 glucose residues was used to form a 6-fold left-handed helix with 55 nm inner diameter and 135 nm outer diameter approximately and a length of 738 nm. A-lactoglobulin peptide segment was used on the basis of the three-dimensional (3D) structure determined from an NMR (nuclear magnetic resonance) analysis. The PDB (protein data bank) file for-linoleic acid was obtained from the Heterocompound Information Centre in Uppsala, Sweden. The glucose force field was chosen and all simulations for the amylose-like molecule were carried out using the glucose force field. The Gromacs 4.6.1 MD package (ScalaLife Competence Center, European Research Council) was used for the simulation. The MD simulations were performed using the leapfrog motion routine with a 2×10-15s time step. A total of 250 000 000 simulation steps (for a total of 500 ns simulation time) were performed to assess the progression of the self-assembly process. The LINCS algorithm was used to constrain all bond lengths. In the simulation, the temperature was set at 100 °C, necessary for the initial formation of the nanoparticle. This was performed using the modified Berendsen thermocouple between the different groups with a relaxation time of 0.1 ps, and the pressure was maintained at 1.0×105Pa using the Parrinello?Rahman coupling to a pressure bath via an isotropic coordinate scaling with a relaxation time of 2×10-12s. Non-chemical bond interactions were handled using a neighboring grid cell cutoff scheme. Within a neighboring molecules list’s cutoff distance of 0.9 nm in a short range, the interactions were evaluated at every time step based on a pair list. A short-range electrostatic cutoff radius of 0.9 nm and a long-range Van der Waals’ cutoff radius of 1.4 nm were evaluated simultaneously with each list updating. The binding order of the 3 components could be obtained through the self-assembly snapshot diagram of ternary nanoparticles within 500 ns. The TEM images showed that ternary nanoparticles had a rod-like conformation, which could be confirmed by the snapshot at 500 ns of ternary system from molecular dynamic simulation. Further analyses of their gyration radius and solvent accessible surface area showed that the ternary nanoparticles were highly hydrosoluble, which indicated that the nanoparticles could significantly enhance the aqueous solubility of some hydrophobic nutraceuticals or functional compounds. It also indicated that the formation of the ternary nanoparticles was a thermodynamically spontaneous process among amylose,-lactoglobulin and-linoleic acid interaction through the free energy curved-surface map of the ternary nanoparticle. The present work provides insights into the mechanism of the atomic structures of aqueous soluble self-assembled nanoparticles and presents new perspective for the design of nutraceuticals delivery systems with desirable properties.

nanoparticles; molecular dynamics; self assembly; amylose;-lactoglobulin;-linoleic acid

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.041

TS231

A

1002-6819(2017)-03-0300-07

2016-08-07

2016-12-22

國家自然科學(xué)基金資助項目（31371736）

馮 濤，男，教授，博士，2012年赴美國普度大學(xué)做訪問學(xué)者，主要從事淀粉科學(xué)和食品風(fēng)味化學(xué)的研究。Email：fengtao@sit.edu.cn

馮 濤，王 珂，周進杰，Deepak Bhopatkar，陳 楓，Osvaldo Campanella，Bruce R. Hamaker，Marcelo Carignano，莊海寧.三聚體納米顆粒自組裝過程的分子動力學(xué)模擬[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2017，33(3)：300－306. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.041 http://www.tcsae.org

Feng Tao, Wang Ke, Zhou Jinjie, Deepak Bhopatkar, Chen Feng, Osvaldo Campanella, Bruce R. Hamaker, Marcelo Carignano, Zhuang Haining. Molecular dynamics simulation of self-assembling process of ternary nanoparticle[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(3): 300－306. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.041 http://www.tcsae.org