超高壓液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜篩查漁用投入品中禁限用藥物

孔聰　周哲　汪洋　黃原飛　沈曉盛　黃冬梅　蔡友瓊　于慧娟

摘要建立了超高壓液相色譜靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)漁用投入品中可能造成風(fēng)險(xiǎn)隱患的禁限用藥物的快速篩查與定量技術(shù)。以水（含1%甲酸）乙腈（1∶9， V/V）溶液進(jìn)行提取，通過(guò)稀釋降低基質(zhì)效應(yīng)，在Accucore RPMS 色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）上，以水（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）溶液為流動(dòng)相，利用梯度洗脫、ESI離子化，F(xiàn)ullscan ddMS2 （opN）掃描模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，通過(guò)與預(yù)先建立好的藥物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜、色譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，實(shí)現(xiàn)了53種禁限用藥同時(shí)篩查確證與定量分析。各藥物最低檢出濃度均低于10 ng/mL，在0.01～1.0 μg/mL范圍內(nèi)，各藥物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.98，根據(jù)實(shí)際測(cè)定結(jié)果設(shè)定對(duì)漁藥及漁用飼料中篩查藥物的檢出限分別為0.5和5.0 mg/L，對(duì)漁藥及漁用飼料基質(zhì)添加10和100 mg/kg 的各篩查成分，定量回收率均高于50%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。將本方法用于農(nóng)業(yè)部漁用投入品質(zhì)量安全隱患排查項(xiàng)目中，共篩查68個(gè)樣品，其中在29個(gè)漁用獸藥樣品中篩查出15種說(shuō)明書中未標(biāo)明成分。

關(guān)鍵詞漁用投入品； 篩查； 高分辨質(zhì)譜

1引 言

我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量占全世界總量70%左右，是漁用投入品（包括漁藥與漁用飼料）生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)[1]。漁用投入品中添加違禁藥物將導(dǎo)致水體污染、水產(chǎn)品違禁藥物殘留，并通過(guò)食物鏈富集轉(zhuǎn)移到人體中，危害人體健康[2]。在我國(guó)，存在漁用投入品中添加禁用或限用藥物的不規(guī)范生產(chǎn)和使用現(xiàn)象，導(dǎo)致其在水產(chǎn)品中殘留超標(biāo)，影響我國(guó)養(yǎng)殖水產(chǎn)品質(zhì)量安全，有必要對(duì)漁用投入品中禁限用藥物進(jìn)行檢測(cè)，以確保投入品的安全使用[3]。

目前，漁用投入品中禁限用藥物的檢測(cè)主要采用液相色譜法[4]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[7]等。液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有檢出限低、準(zhǔn)確度高和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，在漁用投入品檢測(cè)中應(yīng)用最為普遍[8]。但由于漁用投入品理化性質(zhì)差別較大，且三重四極桿質(zhì)譜儀質(zhì)量精密度較低，單次檢測(cè)較多種類的化合物相互干擾較大，通常以結(jié)構(gòu)類似的同族藥物或單一藥物來(lái)開(kāi)發(fā)相應(yīng)的方法[9]，在藥物篩查中需建立多種檢測(cè)方法，且對(duì)非檢項(xiàng)目的篩查能力不足，造成檢測(cè)資源浪費(fèi)， 通過(guò)高效的多組分同時(shí)篩查和定性技術(shù)可解決該問(wèn)題[10，11]。

基于靜電場(chǎng)軌道離子阱的超高分辨率質(zhì)譜技術(shù)為多組分目標(biāo)化合物分析提供了新的研究方向[12]。靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)與色譜分離技術(shù)串聯(lián)，可在一次檢測(cè)過(guò)程中對(duì)數(shù)百種化合物進(jìn)行分析[13]。該質(zhì)譜可進(jìn)行基于母離子強(qiáng)度猝發(fā)的子離子掃描模式，可實(shí)現(xiàn)母離子全掃描模式下對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性子離子掃描，同時(shí)實(shí)現(xiàn)篩查與確證功能[14，15]。

根據(jù)歷年中國(guó)農(nóng)業(yè)部辦公廳漁用投入品質(zhì)量安全隱患排查計(jì)劃，本研究針對(duì)漁用投入品中可能造成的風(fēng)險(xiǎn)隱患的各種禁限用藥物成分，利用超高壓液相色譜靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)，對(duì)禁限用藥物標(biāo)準(zhǔn)品在統(tǒng)一的參數(shù)下進(jìn)行分析，建立藥物色譜質(zhì)譜信息庫(kù)，開(kāi)發(fā)禁限用藥物篩查與定性確證方法，成功用于對(duì)漁用投入品的隱患排查，為我國(guó)漁用投入品安全隱患的有效監(jiān)控提供了新技術(shù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Ultimate 3000超高壓液相色譜QExactive靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（附帶Xcalibur及racefinder操作與分析軟件，美國(guó)hermo Fisher 公司）； NEVAP 112氮吹濃縮儀（美國(guó)Organomation公司）； 渦旋攪拌器（德國(guó)IKA VOEX X3）； CL6R離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）； 16RXII高速冷凍離心機(jī)（日本IACI CF公司）； MilliQ超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）； PL602L電子天平（Mettleroledo公司）； B 125D精密天平（Sartorius公司）； KQ300E超聲波提取儀（ 昆山市超聲儀器有限公司）。hermo Accucore RPMS色譜分離柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm， 美國(guó)hermo公司）。

53種風(fēng)險(xiǎn)排查物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（見(jiàn)表1）均購(gòu)于Dr.Ehrenstofer Gmb公司。乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、二氯甲烷（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）； 二甲基亞砜、冰醋酸、乙二胺四乙酸二鈉 （分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 乙酸銨（PLC 級(jí)，F(xiàn)luka公司）； 甲酸（ACS純，美國(guó)Sigma公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1溶液配制稱取各藥物標(biāo)準(zhǔn)品5 mg左右，以甲醇溶解并定容至50 mL，不易溶解藥品可先加入1 mL甲酸或二甲基亞砜溶解，繼續(xù)配制成100 μg/mL 左右的單標(biāo)儲(chǔ)備液，

2.2.2樣品提取方法漁藥： 準(zhǔn)確稱取各漁藥500 mg（液體藥品以移液槍量取500 μL），以乙腈（含1%甲酸） 25 mL充分溶解， 8000 r/min離心30 min，取上清液待用。

漁用飼料： 將漁用飼料充分混勻均質(zhì)，稱取樣品（5.00 ± 0.05）g于50 mL離心管中，加入0.1 g 乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDA）以及水乙腈溶液（1∶9， V/V， 含1%甲酸）提取劑25 mL， 混合，常溫渦旋振蕩提取5 min，超聲溶解20 min， 8000 r/min離心30 min，取上清液待用。

2.2.3色譜分析條件Accucore RPMS色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）； 流速： 0.3 mL/min； 柱溫： 30℃； 進(jìn)樣量： 20 μL； 流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.1%甲酸）； 洗脫梯度： 0～3.0 min，5% B； 3.0～22.0 min，5%～100% B； 22.0～25.0 min，100% B； 25.0～25.1 min，100%～5% B； 25.1～30.0 min，5% B。

2.2.4質(zhì)譜分析條件ESI離子源，噴霧電壓： 3200 V（+），2800 V（-）； 鞘氣： 40 arb； 輔氣： 10 arb； 吹掃氣： 1 arb； 氣體加熱溫度： 350℃； 離子傳輸管溫度： 325℃； 質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲取模式： Fullscan ddMS2 （opN） 掃描模式。

2.2.5定性篩查信息庫(kù)、篩查確證、定量方法收集整理各篩查藥物分子式，以獲知其分子量、分子離子峰、質(zhì)荷比等信息，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜檢測(cè)條件下，獲得以100 ng/mL藥物標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間與母離子和子離子信息，在racefinder中創(chuàng)建各藥物的篩查比對(duì)信息庫(kù)。對(duì)處理好的待篩查樣品采用Fullscan ddMS2 （opN）質(zhì)譜采集方法上機(jī)分析，通過(guò)已建立好的各藥物質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息庫(kù)對(duì)待篩查樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)篩查、確證。以同樣的方法對(duì)10，50，100，500和1000 ng/mL濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，通過(guò)racefinder對(duì)定性篩查出的陽(yáng)性藥物選擇母離子進(jìn)行定量分析。

3結(jié)果與討論

3.1實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.1.1提取劑的選擇漁藥屬于純度較高的藥品，雜質(zhì)較少，采用合適的溶劑直接溶解即可獲得較高的提取效率。而對(duì)于漁用飼料，考慮采用混合提取劑進(jìn)行其中藥物的提取。由于磺胺類、喹諾酮類在酸性條件下更容易被溶解提取，五氯酚鈉在酸性條件下變?yōu)槲迓确?，從而可溶于有機(jī)溶劑，其它藥物（孔雀石綠、結(jié)晶紫、硝基呋喃類、喹乙醇、己烯雌酚、阿維菌素類、氯霉素類等）易溶于乙腈及其酸性溶液中，而三唑磷在酸堿介質(zhì)中易水解，故提取劑酸度不宜過(guò)高，因而采用水乙腈溶液（1∶9， V/V， 1%甲酸）。而四環(huán)素在純乙腈及酸化乙腈中的提取效率均較低，參考相關(guān)研究，加入提取液前加入Na2EDA可將四環(huán)素的提取效率提高至60%，同時(shí)保證其它藥物的提取效率在70%以上[16]。

3.1.2凈化條件的優(yōu)化將提取液以水（含0.1%甲酸）稀釋10倍后，分別在LB、中性氧化鋁和C18固相萃取柱上負(fù)載、洗脫收集及溶解分析，3種小柱對(duì)大部分化合物的回收率均不理想，多低于40%，特別是四環(huán)素類、五氯酚鈉及部分磺胺類等強(qiáng)極性藥物極易丟失，回收率低于10%。采用直接稀釋基質(zhì)方法進(jìn)行凈化，對(duì)于乳液制劑及有較多固體基質(zhì)溶解的藥品和漁用飼料，取其提取液100 μL用900 μL水乙腈溶液（5∶95， V/V， 含0.1%甲酸）稀釋，各雜質(zhì)成分濃度降低90%，基質(zhì)效應(yīng)干擾大大降低，保證了各藥物的回收率均大于50%。對(duì)于部分純度較高、基本無(wú)基質(zhì)溶出的漁藥，直接以1 mL提取劑提取，直接用流動(dòng)相稀釋檢測(cè)對(duì)篩查和定量分析并不產(chǎn)生影響。

3.1.3液相色譜條件的優(yōu)化采用雙流動(dòng)相條件下梯度洗脫模式，考察了在不同酸堿度以及緩沖鹽存在條件下各藥物分離及離子化效率。以純水為水相，甲醇或乙腈為有機(jī)相， 可在25 min內(nèi)洗脫所有目標(biāo)物，但乙腈對(duì)四環(huán)素類、磺胺類的色譜分離后信號(hào)響應(yīng)和峰形均較好。甲酸的加入可明顯提高硝基呋喃類、孔雀石綠、結(jié)晶紫、磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素的正離子化效率，但部分降低了氯霉素類以及五氯酚鈉的負(fù)離子化效率。本研究最終采用水（含0.1%甲酸）與乙腈（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相，在0～25 min 內(nèi)依次按極性由強(qiáng)到弱洗脫各化合物，目標(biāo)物的峰形較好，并保持了較高的檢測(cè)靈敏度。

3.1.4質(zhì)譜條件的優(yōu)化本研究采用Full Scan /ddMS2（opN）質(zhì)譜掃描模式采集數(shù)據(jù)，可連續(xù)對(duì)洗脫化合物進(jìn)行全譜掃描，當(dāng)母離子的信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)設(shè)定閾值時(shí)，選取單次掃描最強(qiáng)的若干母離子進(jìn)行子離子掃描，所獲得的均為高分辨數(shù)據(jù)，在篩查與確證過(guò)程中具有很強(qiáng)的可信度。采用以上掃描模式獲取的數(shù)據(jù)對(duì)藥物進(jìn)行篩查與確證后，同時(shí)以母離子進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)藥物的準(zhǔn)確篩查定性和定量，部分藥物的提取離子流圖如圖1所示。

3.2藥物篩查信息庫(kù)建立

各藥物的篩查比對(duì)信息如表1所示，部分化合物為同分異構(gòu)體，且在質(zhì)譜中第一、第二強(qiáng)的子離子信號(hào)相同，但其保留時(shí)間不同， 故可進(jìn)行有效區(qū)分。

3.3基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)通過(guò)如下公式計(jì)算： 基質(zhì)效應(yīng)=（1-基質(zhì)空白溶液加標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度/空白溶劑加標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度）×100%。漁藥和漁用飼料提取液在前處理過(guò)程中通過(guò)溶劑稀釋，將基質(zhì)濃度降低了10倍，其在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中基本不受基質(zhì)效應(yīng)影響，結(jié)果表明，所有待篩查藥物的基質(zhì)效應(yīng)均小于15%，屬于低基質(zhì)效應(yīng)影響，故在實(shí)際定量分析過(guò)程中省略基質(zhì)加標(biāo)曲線分析過(guò)程。

3.4篩查與確證

對(duì)藥物標(biāo)準(zhǔn)品與空白加標(biāo)樣品進(jìn)行分析比對(duì)時(shí)，各類信息重復(fù)性和穩(wěn)定性由優(yōu)到差依次為： 母離子質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、子離子中最強(qiáng)的兩個(gè)離子質(zhì)量數(shù)及豐度比、子離子其它離子信息。本研究根據(jù)比對(duì)信息的穩(wěn)定性，在對(duì)樣品的篩查過(guò)程中，依次需要滿足以上前3個(gè)條件，方可確定樣品中陽(yáng)性組分的存在。通過(guò)Xcalibur獲取數(shù)據(jù)，并通過(guò)racefinder編輯藥物的比對(duì)信息，按照確定的比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩查確證與定量分析，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)際漁用投入品的各藥物的定性篩查與定量分析。

3.5方法學(xué)考察

對(duì)配制的1～10 ng/mL各標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)篩查數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性篩查確證，結(jié)果表明，隱色結(jié)晶紫、伊維菌素在10 ng/mL水平下均可檢出； 呋喃妥因、呋喃西林、噁喹酸、氟甲喹、培氟沙星、土霉素、金霉素、阿維菌素在5 ng/mL下均可檢出； 其它藥物均可在1 ng/mL水平下檢出。針對(duì)漁用投入品中禁限用藥物的篩查可基于較高檢出限條件下進(jìn)行，即使添加藥物含量為5 mg/kg，經(jīng)過(guò)前處理過(guò)程后均超過(guò)以上檢出限，完全可滿足實(shí)際篩查需要。在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，各藥物標(biāo)準(zhǔn)品保持了良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.98，保證了漁用投入品的篩查與定量結(jié)果準(zhǔn)確性。

對(duì)不同的漁用飼料及漁藥基質(zhì)分別添加濃度為10 和100 mg/kg的混合藥物，篩查與定量結(jié)果表明，各藥物的檢出率為100%，在漁藥基質(zhì)中各藥物的回收率>90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%； 而在各飼料基質(zhì)中，各藥物的回收率>50%，兩個(gè)加標(biāo)水平的每種藥物的定量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%（表2）， 表明本篩查方法的定量分析結(jié)果具有很好的準(zhǔn)確性和精密度。

3.6實(shí)際樣品分析

將本方法應(yīng)用于華東地區(qū)的漁用投入品質(zhì)量安全隱患排查項(xiàng)目中68個(gè)樣品的分析，采用建立的藥物篩查數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行53種化合物的分析，對(duì)于飼料樣品通過(guò)基質(zhì)空白加標(biāo)進(jìn)行回收率校正，對(duì)于漁藥樣品直接進(jìn)行定量分析。在29個(gè)漁用獸藥樣品中，檢出15種在說(shuō)明書中未明確標(biāo)明的篩查藥物，且檢出含量均超過(guò)100 mg/L，結(jié)果如表3所示。

4結(jié) 論

本研究針對(duì)漁用投入品中可造成風(fēng)險(xiǎn)隱患的禁限用藥物成分在投入品中高含量特點(diǎn)，通過(guò)簡(jiǎn)單的提取與稀釋凈化方法，利用超高壓液相色譜串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)，對(duì)禁限用藥物在統(tǒng)一的參數(shù)下進(jìn)行分析，建立藥物色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，開(kāi)發(fā)禁限用藥物同時(shí)篩查、定性確證與定量方法，成功應(yīng)用于漁用投入品中禁限用的藥品的隱患排查。

Abstracto screen the illegal substances in fishery inputs， we established the database including the precursor and the daughter ions for these possible components by the quadrupole/orbittrap mass spectrometer， and the retention time of each drug on the same chromatographic column. And then， the extracted and diluted samples were analyzed and the components in the real samples were identified under the same conditions. Chromatographic analysis was performed on an Accucore RPMS column （100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm） using gradient elution with 0.1% formic acid in water and 0.1% formic acid in acetonitrile as mobile phase. Elutes were ionized through heatable electrospray ionization （ESI） in both positive and negative mode simultaneously. Data acquisition was conducted by Fullscan ddMS2 （opN） mode， in which the full mass profile for a continuous precursor ion injection and the fragments of each high abundant precursor of targeted were acquired with excellent time and mass resolution. Screening was carried out through comparison of the information of real samples with that of standards in the database， which were processed by software （racefinder）. he Quantification of each component was analyzed based on the precursor ion chromatography acquired by orbittrap mass spectroscopy， which showed a good linearity between 0.01-1 μg/mL， with R>0.98. he method was validated by checking its minimum screening concentration （0.5 mg/L for drugs and 5 mg/L for feedstuffs） and evaluating the recovery after addition of the standard mixture in real samples （>50%， under the addition of 10 and 100 mg/kg）. he results for 68 practical samples demonstrated the effective performance of this method for screening with highthroughput， rapidness and acceptable minimum screening concentration and accuracy， in which 15 of 29 fishery drug samples were screened out for positive components that were not indicated in their labels.

KeywordsFishery drug； Screen； igh resolution mass spectroscopy