豬O型口蹄疫病毒細(xì)菌樣顆粒疫苗的制備與免疫原性鑒定

侯立婷，陳瑾，喬緒穩(wěn)，于曉明，侯繼波,3，鄭其升，李槿年

1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036

2 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014

3 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

豬O型口蹄疫病毒細(xì)菌樣顆粒疫苗的制備與免疫原性鑒定

侯立婷1,2，陳瑾2，喬緒穩(wěn)2，于曉明2，侯繼波2,3，鄭其升2，李槿年1

1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036

2 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014

3 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

侯立婷, 陳瑾, 喬緒穩(wěn), 等. 豬O型口蹄疫病毒細(xì)菌樣顆粒疫苗的制備與免疫原性鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 217–227.

Hou LT, Chen J, Qiao XW, et al. Design and immunogenicity evaluation for the bacteria-like particle vaccine against swine type O Foot-and-mouth disease virus. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 217–227

驗(yàn)證基于革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì) (Gram-positive enhancer matrix，GEM) 展示口蹄疫病毒細(xì)菌樣顆粒(Bacteria-like particles，BLP) 疫苗的可行性。按照大腸桿菌偏好性密碼子優(yōu)化合成基于豬口蹄疫病毒Mya98株序列的3種抗原基因設(shè)計(jì)，并將其插入到含有錨鉤蛋白基因的原核表達(dá)載體pQZ-PA，鑒定陽(yáng)性后轉(zhuǎn)入Escherichia coliBL21，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。利用SDS-PAGE與Western blotting對(duì)目的基因表達(dá)及產(chǎn)物的可溶性進(jìn)行分析。利用GEM顆粒純化目的蛋白，制備細(xì)菌樣顆粒疫苗抗原；利用BCA試劑盒測(cè)定重組蛋白的濃度，將重組蛋白與白油佐劑乳化，制備疫苗，免疫5周齡小鼠，同時(shí)設(shè)商品化多肽苗對(duì)照與空白對(duì)照，免疫后不同時(shí)間采集試驗(yàn)小鼠血清，利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和O型口蹄疫抗體液相阻斷酶聯(lián)免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫小鼠血清的抗體水平；利用噻唑藍(lán)比色法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT) 測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖情況；利用熒光定量PCR方法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫水平。SDS-PAGE結(jié)果表明，設(shè)計(jì)在大腸桿菌中的3種口蹄疫病毒抗原基因均以可溶形式獲得高效表達(dá)；Western blotting結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白能夠與口蹄疫病毒陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，利用GEM顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)重組蛋白的一步離心純化，制備BLP疫苗抗原；免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的重組抗原B (T1BT2) 4B不但能夠刺激免疫小鼠產(chǎn)生更高水平的多肽特異性ELISA抗體與口蹄疫特異性液相阻斷抗體，而且產(chǎn)生了更高水平的脾淋巴細(xì)胞增殖及Th1型的細(xì)胞因子分泌。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究制備的BLP疫苗GEM-B (T1BT2) 4B具有良好的免疫原性，為研究口蹄疫病毒基因工程亞單位疫苗開(kāi)辟了一條新的思路。

口蹄疫病毒，VP1蛋白，可溶性表達(dá)，細(xì)菌樣顆粒疫苗，免疫原性

口蹄疫 (Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD) 是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV) 引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病。臨床特征是在偶蹄動(dòng)物口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰性疹。該病毒傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 (OIE) 將其列為法定報(bào)告的動(dòng)物傳染病之一[1–3]。在我國(guó)，F(xiàn)MD屬于國(guó)家強(qiáng)制免疫類(lèi)疾病，目前商品化的疫苗有FMD滅活疫苗和多肽疫苗兩種。目前FMD O型合成肽疫苗由于具有安全性好、免疫原性強(qiáng)和免疫副反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用[4–5]。Brown等用大腸桿菌表達(dá)的FMDV VP1基因第140–160和200–213位肽段串聯(lián)多肽免疫牛、豬等動(dòng)物，結(jié)果顯示可獲得較好的免疫力[6]。Chan將FMDV VP1基因編碼的第141–160位肽段和200–213位肽段串聯(lián)起來(lái)與豬IgG重鏈進(jìn)行融合表達(dá)，所得產(chǎn)物免疫后豬可以抵抗50LD50的FMDV攻擊[7]。王長(zhǎng)怡將O型FMDV VP1蛋白141–160位肽段和一個(gè)具有廣譜性的輔助性T細(xì)胞表位進(jìn)行化學(xué)合成，制備疫苗免疫豬后可以抵抗104.5TCID50FMDV的強(qiáng)毒攻擊[8]。方明麗等利用O型FMDV VP1上的主要表位，模擬天然口蹄疫病毒的VP1蛋白構(gòu)象，將其進(jìn)行不同數(shù)量、不同形式的串聯(lián)表達(dá)，免疫豚鼠和牛后能產(chǎn)生了較高滴度的中和抗體[9]。

革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)表面展示系統(tǒng) (Grampositive bacteria enhancer matrix particles，GEM)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種顆?？乖苽湫录夹g(shù)。該系統(tǒng)包括GEM顆粒和蛋白錨鉤 (Protein anchor，PA) 兩個(gè)構(gòu)件。GEM顆粒是乳酸乳球菌MG1363經(jīng)熱酸煮沸處理，去除全部蛋白和核酸等物質(zhì)后獲得的球形肽聚糖骨架[10]。蛋白錨鉤PA是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，可以非共價(jià)方式特異性與肽聚糖結(jié)合。大量研究表明，與PA融合表達(dá)的目標(biāo)蛋白能夠展示在GEM顆粒表面，以GEM為骨架形成顆粒樣抗原。該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，只需一步離心即可完成顆?？乖闹苽鋄11–13]。

目前，關(guān)于FMD亞單位疫苗的研究存在以下問(wèn)題：1) 靶標(biāo)抗原在E. coli中表達(dá)時(shí)，多數(shù)以包涵體形式存在，需要變性復(fù)性過(guò)程，在大規(guī)模生產(chǎn)中難以實(shí)現(xiàn)；2) 大多數(shù)研究中對(duì)表達(dá)蛋白的純化是利用Ni-NTA樹(shù)脂純化，這種方法成本高，操作繁瑣，在大生產(chǎn)中也難以實(shí)現(xiàn)[14]；3) 與E. coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)相比，人工合成肽疫苗仍然存在成本過(guò)高的缺點(diǎn)。如果能夠?qū)MDV的抗原表位加以組合、設(shè)計(jì)，在選擇合適的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)重組抗原在E. coli中的可溶性表達(dá)，結(jié)合GEM技術(shù)實(shí)現(xiàn)抗原的快速純化與表面展示，對(duì)于FMDV基因工程亞單位疫苗研究具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

含有錨鉤蛋白基因的重組原核表達(dá)載體pQZ-PA由本課題組保存[15]。質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購(gòu)自AxyGEN公司；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PCR試劑、pMD19-T vector、DNA Marker等試劑購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子量Marker、BCA試劑盒為T(mén)hermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品；FMDV多肽陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備，系用商品化的申聯(lián)生物醫(yī)藥 (上海) 股份有限公司生產(chǎn)的FMDV合成肽疫苗多次免疫小鼠獲得；DAB顯色液、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、MTT購(gòu)自南京生興生物科技有限公司；5周齡的ICR小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；FMDV多肽ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司；O型口蹄疫液相阻斷抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 抗原表位設(shè)計(jì)與合成

主要靶抗原表位包括FMDV Mya 98株VP1蛋白上的主要B細(xì)胞表位 (B：第140–160位，20個(gè)氨基酸) 與兩個(gè)輔助性T細(xì)胞表位Th1[VP1 (第200–213位，14個(gè)氨基酸)]、Th2 [3A (第21–35位，15個(gè)氨基酸)]。共設(shè)計(jì)了3種抗原，表位之間均有接頭連接：1) BT1B：編碼FMDV VP1兩個(gè)拷貝的141–160位氨基酸殘基和一個(gè)拷貝的200–213位氨基酸殘基構(gòu)成的串聯(lián)片段20 AA–14 AA–20 AA的核苷酸片段；2) BT2B：編碼FMDV VP1兩個(gè)拷貝的141–160位氨基酸殘基和一個(gè)拷貝的21–35位氨基酸殘基構(gòu)成的串聯(lián)片段20 AA–15 AA–20 AA的核苷酸片段；3) B (T1BT2) 4B：編碼FMDV VP1兩個(gè)拷貝的141–160位氨基酸殘基和一個(gè)拷貝的200–213位氨基酸殘基及和一個(gè)拷貝的21–35位氨基酸殘基構(gòu)成的串聯(lián)片段20 AA–(14 AA–20 AA–15 AA) 4–20 AA的核苷酸片段。所有基因均按照大腸桿菌表達(dá)優(yōu)化合成，在序列兩端添加BamHⅠ和Hind Ⅲ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并克隆入pUC57載體。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將基因片段BT1B、BT2B與B (T1BT2) 4B從pUC57載體上通過(guò)BamHⅠ和Hind Ⅲ兩個(gè)酶切位點(diǎn)切下，克隆到含有錨鉤蛋白基因的原核表達(dá)載體pQZ-PA，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，分別將其命名為pQZ-BT1B-PA、pQZ-BT2B-PA和pQZ-B (T1BT2) 4B-PA。

1.4 重組菌的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

1.4.1 重組表達(dá)菌的獲得

將重組質(zhì)粒pQZ-BT1B-PA、pQZ-BT2B-PA、pQZ-B (T1BT2) 4B-PA分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布含氨芐青霉素的LB平板，挑取單菌落，得到重組菌pQZ-BT1B-PA/BL21、pQZ-BT2B-PA/BL21及pQZ-B (T1BT2) 4B-PA/BL21。將空質(zhì)粒pQZ按照相同的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，得到對(duì)照菌株pQZ/BL21。

1.4.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取重組菌pQZ-BT1B-PA/BL21、pQZ-BT2B-PA/BL21、pQZ-B (T1BT2) 4B-PA/BL21與pQZ/BL21單菌落，接種5 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子液。次日將種子液按1∶100比例轉(zhuǎn)接含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1.5–2 h (OD600達(dá)到0.5–1.0)，加入終濃度為0.4 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷，15 ℃誘導(dǎo)24 h，收獲細(xì)菌。

1.5 目的蛋白的可溶性鑒定

取2 mL誘導(dǎo)后菌液，離心收集菌體，用1 mL PBS緩沖液重懸，在冰水浴中超聲波破碎細(xì)胞。破碎后離心轉(zhuǎn)移全部上清，保留備用，沉淀用1 mL PBS緩沖液重懸。將完整的誘導(dǎo)菌體以及超聲波破碎后的上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)及可溶性。

1.6 Western blotting鑒定

重組蛋白SDS-PAGE電泳后再轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%的BSA 37 ℃封閉孵育1 h，TBST洗滌2次，加1∶100稀釋的小鼠陽(yáng)性血清孵育過(guò)夜，TBST洗滌5次，5 min/次，加1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST洗滌5次，5 min/次，DAB顯色后觀察特異性條帶。

1.7 BLP疫苗抗原的制備

從–70 ℃取出制備好的GEM顆粒，1 U的GEM顆粒離心后用適量蛋白重懸，室溫緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)孵育30 min，離心收集沉淀，用SDS-PAGE及電鏡觀察鑒定效果。

1.8 BLP疫苗免疫原性鑒定

1.8.1 蛋白定量及小鼠免疫

分別取3個(gè)重組蛋白破碎后上清1 mL，與GEM顆粒結(jié)合后離心取沉淀，重懸于1 mL PBS中，加入50 μL 10% SDS，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，分離沉淀和上清，取上清用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。按照50 μg/只的劑量與白油乳化制備BLP疫苗，免疫5周齡的ICR小鼠，每組8只，同時(shí)設(shè)置空菌、空白和多肽疫苗 (生產(chǎn)廠家：申聯(lián)生物醫(yī)藥 (上海) 股份有限公司，批號(hào)：(2014) 090297522) 對(duì)照組。皮下多點(diǎn)注射200 μL/只，免疫21 d后加強(qiáng)免疫200 μL/只，分別于免后21、35、49和63 d采集血液進(jìn)行間接ELISA與LPB-ELISA抗體檢測(cè)。

1.8.2 間接ELISA抗體檢測(cè)

取出試劑盒中的樣品稀釋板，每孔加入200 μL樣品稀釋液，在相應(yīng)孔加入10 μL對(duì)照血清或被檢血清，振蕩。對(duì)照血清設(shè)兩個(gè)平行，其余各1個(gè)孔。取出抗原包被板，分別從稀釋板上取稀釋好的對(duì)照和被檢血清各100 μL，封膜后37 ℃作用1 h。洗滌液洗板5次，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃作用30 min，洗板5次，TMB顯色15 min，加終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的OD值。

1.8.3 液相阻斷抗體檢測(cè)

血清抗體檢測(cè)根據(jù)O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，血清用PBST進(jìn)行兩倍比稀釋?zhuān)♂尪葟?∶2–1∶64，然后與等體積的病毒抗原混合，37 ℃作用1 h。取出預(yù)先用兔抗口蹄疫特異性抗體包被的96孔板，將作用好的抗原抗體混合液轉(zhuǎn)移到該板，37 ℃作用1 h后，用PBST洗板5次，加豚鼠抗口蹄疫血清，37℃作用30 min，PBST洗板5次，加HRP標(biāo)記的抗豚鼠血清，37 ℃作用30 min，PBST洗板5次，OPD顯色15 min，加終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)下的OD值?？乖瓕?duì)照4孔，棄去最高和最低OD492，計(jì)算剩余2孔的平均OD492值再除以2，即50%對(duì)照值，該值即為臨界值。被檢血清OD492值大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的孔為陽(yáng)性孔。若臨界值與稀釋倍數(shù)最高陽(yáng)性孔的OD492值相同，則以被檢血清陽(yáng)性孔的最高稀釋倍數(shù)作為該血清的抗體效價(jià)。

1.8.4 小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

無(wú)菌采取小鼠脾臟，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，以含10% (V/V) 新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度約為2×107個(gè)/mL，加入96孔細(xì)胞板內(nèi)，100 μL/孔，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，向各孔內(nèi)加入5 μg人工合成的豬O型FMDV GH loop表位多肽 (VP1 140–160位AA)作為刺激抗原，同時(shí)設(shè)PHA作為陽(yáng)性對(duì)照組，每孔加入2 μg的PHA，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h，再每孔加入5 μg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。測(cè)定OD492值，取3個(gè)平均值計(jì)算刺激指數(shù) (SI)，試驗(yàn)設(shè)不加口蹄疫抗原的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)照。以刺激指數(shù) (SI) 作為判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度的參數(shù)，(SI=刺激孔OD492值/培養(yǎng)液對(duì)照孔OD492值)。

1.8.5 小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)

采取相同質(zhì)量的免疫小鼠脾臟研磨，反復(fù)凍融3次，用Trizol裂解法提取RNA，利用一步反轉(zhuǎn)試劑盒獲得cDNA。根據(jù)GenBank中公布的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物，參考文獻(xiàn)[16]的方法利用熒光定量PCR檢測(cè)IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α的基因水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的質(zhì)粒鑒定

將合成的目的基因用BamHⅠ與Hind Ⅲ酶切回收后，克隆到重組原核表達(dá)載體pQZ-PA上，獲得重組質(zhì)粒pQZ-BT1B-PA、pQZ-BT2B-PA和pQZ-B (T1BT2) 4B-PA，然后進(jìn)行酶切鑒定。酶切的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可得到200、400和700 bp左右的目的片段 (圖略)，與預(yù)期設(shè)計(jì)的目的基因片段大小一致。

2.2 重組蛋白的表達(dá)及可溶性分析

將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)。取菌液接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)到細(xì)菌濃度達(dá)到OD600為0.5?1時(shí)加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)24 h后，菌液離心去除培養(yǎng)基，用PBS重懸菌體后經(jīng)高壓破碎儀破碎菌體，用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物 (圖1)，3個(gè)融合蛋白都可以表達(dá)，分子量大小分別約為47、28與36 kDa，并且3個(gè)蛋白均能以可溶性形式存在于菌體破碎的上清中。

圖1 重組蛋白表達(dá)及可溶性分析結(jié)果Fig. 1 Expression and solubility identification of the recombinant protein with SDS-PAGE. M: protein molecular marker; 1: blank control of BL21 transformed with plasmid pQZ; 2: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-B (T1BT2) 4B-PA; 3: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-B (T1BT2) 4B-PA transformed BL21; 4: sediment for recombinant plasmid pQZ-B (T1BT2) 4B-PA transformed BL21 after supersonic; 5: blank control of BL21 transformed with plasmid pQZ; 6: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-BT1B-PA; 7: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT1B-PA transformed BL21; 8: sediment for recombinant plasmid pQZ-BT1B-PA transformed BL21 after supersonic; 9: blank control of BL21 transformed with plasmid pQZ; 10: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-BT2B-PA; 11: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT2B-PA transformed BL21; 12: sediment for recombinant plasmid pQZ-BT2B-PA transformed BL21 after supersonication.

2.3 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting鑒定

經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用小鼠抗O型FMDV多肽陽(yáng)性血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting鑒定，結(jié)果如圖2所示，在PVDF膜上獲得的條帶與SDS-PAGE表達(dá)的蛋白條帶大小一致，這表明表達(dá)的重組蛋白可被特異性的抗體所識(shí)別，具有較好的抗原性。

2.4 GEM純化目的蛋白的SDS-PAGE鑒定

如圖3所示，利用SDS-PAGE可檢測(cè)到較高純度目的蛋白的存在，純化后pQZ-BT1B-PA重組蛋白濃度為85 μg/mL；純化后pQZ-BT2B-PA重組蛋白濃度為213 μg/mL；純化后pQZ-B (T1BT2) 4B-PA重組蛋白濃度為870 μg/mL；利用透射電鏡觀察可見(jiàn)，與未結(jié)合之前的GEM相比，結(jié)合重組蛋白后的GEM顆粒有很多不規(guī)則的細(xì)小成團(tuán)結(jié)合物，可能是蛋白形成了多聚體 (圖4)。

圖2 重組蛋白的Western blotting鑒定結(jié)果Fig. 2 Western blotting analysis of recombinant protein. M: protein molecular marker; 1: blank control of BL21 transformed with plasmid pQZ; 2: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-BT1B-PA; 3: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT1B-PA transformed BL21; 4: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-BT2B-PA; 5: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT2B-PA transformed BL21; 6: whole bacterium of BL21 transformed with pQZ-B (T1BT2) 4B-PA; 7: supernatant of supersonicated recombinant plasmid pQZ-B (T1BT2) 4B-PA transformed BL21.

圖3 重組蛋白純化鑒定結(jié)果Fig. 3 Purification analysis of recombinant protein. M: protein molecular marker; 1: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT1B-PA transformed BL21; 2: supernatant for BT1B-PA treated with GEM particles; 3: sedimentation for BT1B-PA treated with GEM particles; 4: GEM particles; 5: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-BT2B-PA transformed BL21; 6: supernatant for BT2B-PA treated with GEM particles; 7: sedimentation for BT12B-PA treated with GEM particles; 8: GEM particles; 9: supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pQZ-(BT1BT2) 4B-PA transformed BL21; 10: supernatant for B (T1BT2) 4B-PA treated with GEM particles; 11: sedimentation for B(T1BT2)4B-PA treated with GEM particles; 12: GEM particles.

圖4 BLP抗原透射電鏡觀察結(jié)果Fig. 4 Transmission electron microscopic images of BLP antigen. (A) Recombinant protein BT1B treated with GEM particles. (B) Recombinant protein BT2B treated with GEM particles. (C) Recombinant protein B (T1BT2) 4B treated with GEM particles. (D) Blank GEM particles. controls.

2.5 免疫小鼠抗體檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 多肽間接ELISA檢測(cè)結(jié)果

小鼠血清按試劑盒操作規(guī)程做1∶20倍稀釋?zhuān)瑴y(cè)得其臨界值為0.495，大于臨界值判為抗體陽(yáng)性。結(jié)果如圖5所示，表達(dá)的B (T1BT2) 4B重組蛋白免疫后35 d后即可產(chǎn)生較高的抗體水平，與多肽苗類(lèi)似。而B(niǎo)T1B重組蛋白和BT2B重組蛋白免疫后小鼠體內(nèi)抗體水平一直較低。

2.5.2 液相阻斷抗體水平檢測(cè)結(jié)果

如圖6所示，B (T1BT2) 4B重組蛋白組小鼠免疫后液相阻斷抗體水平均高于BT1B和BT2B重組蛋白免疫組，并且B (T1BT2) 4B重組蛋白組與多肽疫苗組相比，抗體衰減速度較慢。

2.5.3 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了探討B(tài)LP疫苗免疫小鼠針對(duì)FMDV GH loop抗原表位的淋巴細(xì)胞活化情況，對(duì)免疫后35 d的小鼠進(jìn)行無(wú)菌分離脾臟，提取淋巴細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。如圖7所示，利用人工合成的FMDV多肽作為刺激原，B (T1BT2) 4B免疫組小鼠表現(xiàn)較強(qiáng)的特異性淋巴細(xì)胞增殖，免疫后35 d淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)達(dá)到 (2.29±0.09)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，與商品化的人工合成肽疫苗所引發(fā)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)差異不明顯 (P＞0.05)，與設(shè)計(jì)的其他兩種抗原免疫小鼠差異極顯著 (P＜0.01)。

圖5 疫苗免疫后多肽特異性抗體水平檢測(cè)抗體檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Detection of peptide-specific antibody in mice following vaccination with BLP vaccine by ELISA.

圖6 疫苗免疫后液相阻斷抗體水平檢測(cè)抗體檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Detection of antibody in mice following vaccination with BLP by LPB ELISA.

圖7 疫苗免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Peptide specific T-cell proliferation responses in the mice after BLP vaccine immunization.

2.5.4 小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

為了進(jìn)一步研究BLP疫苗在免疫小鼠體內(nèi)誘發(fā)特異性針對(duì)FMDV GH loop抗原表位的細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)免疫后35 d的小鼠進(jìn)行分離脾臟，提取RNA，用熒光定量PCR方法檢測(cè)IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF的表達(dá)水平。由圖8可知，利用人工合成的FMDV多肽作為刺激原，B (T1BT2) 4B免疫組小鼠IFN-γ與IL-4的水平與其他兩種抗原設(shè)計(jì)差異極為顯著 (P＜0.01)，與商品多肽疫苗免疫組差異不顯著 (P＞0.05)，同時(shí)所有實(shí)驗(yàn)組IL-10、TNF水平變化均不顯著，說(shuō)明重組蛋白B (T1BT2) 4B免疫后誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了明顯的Th1型免疫反應(yīng)，而沒(méi)有誘導(dǎo)抑制性T細(xì)胞的產(chǎn)生。

圖8 免疫小鼠相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果Fig. 8 Detection of cytokine for immunized mice at 35 days post vaccination.

3 討論

口蹄疫被列為我國(guó)必報(bào)傳染病，國(guó)家采取強(qiáng)制免疫手段預(yù)防口蹄疫疫情。目前市場(chǎng)上商品化的疫苗主要是合成肽疫苗和滅活疫苗，均具有良好的免疫效果，在預(yù)防和控制FMD的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但由于全病毒滅活疫苗存在一定的毒力返強(qiáng)、病毒滅活不徹底、病毒逃逸等不安全因素，從而促使人們尋求一種更加安全高效的FMD疫苗[17–18]。

FMDV VP1結(jié)構(gòu)蛋白暴露在病毒粒子表面，含有可誘導(dǎo)感染動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位，是FMD新型疫苗研究最多的結(jié)構(gòu)蛋白[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，O型FMDV的5個(gè)抗原位點(diǎn)中有3個(gè)位于VP1結(jié)構(gòu)蛋白上，其中第141–160位氨基酸為主要的B細(xì)胞表位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答[21–22]?；谏鲜鲅芯浚狙芯坷没蚬こ谭椒▽?duì)O型FMDV中的抗原表位進(jìn)行優(yōu)化，將FMDV VP1結(jié)構(gòu)蛋白上的B表位與病毒自身的輔助性T表位進(jìn)行串聯(lián)、重復(fù)表達(dá)，得到的3個(gè)重組蛋白經(jīng)Western blotting鑒定可被特異性的抗體所識(shí)別，具有較好的抗原性。本研究選擇50 μg/只的免疫劑量是出于以下考慮：1) 參考我們前期進(jìn)行相關(guān)合成肽疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)；2) 參考已發(fā)表關(guān)于小鼠免疫實(shí)驗(yàn)的資料，若免疫劑量過(guò)高，可能會(huì)引發(fā)免疫耐受，對(duì)正常的免疫應(yīng)答造成負(fù)面影響；免疫劑量過(guò)低，由于沒(méi)有足夠的抗原量作保證，不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的免疫力[23–24]；3)同時(shí)考慮本次實(shí)驗(yàn)最主要的目的是鑒定我們不同表位疫苗設(shè)計(jì)免疫原性的差異，所以選擇了一個(gè)相對(duì)較高的劑量。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)關(guān)于劑量選擇是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上得出的一個(gè)初步結(jié)論，后期需要在本動(dòng)物上進(jìn)行重新篩選、驗(yàn)證。

小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，B (T1BT2) 4B重組蛋白組小鼠可以產(chǎn)生較高水平的口蹄疫特異性抗體及液相阻斷抗體，與目前市場(chǎng)上的商品化多肽苗的免疫效果類(lèi)似，然而商品化多肽疫苗大多用化學(xué)合成的方法來(lái)制備多肽，成本較高。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和GEM純化系統(tǒng)生產(chǎn)制備的抗原可溶性高、成本低、制備過(guò)程簡(jiǎn)單方便。并且該蛋白免疫小鼠后能夠有效刺激小鼠機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，能夠正向調(diào)節(jié)IL-4、IFN-γ的表達(dá)水平。

目前的研究資料已證實(shí)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答在抵抗FMDV感染和清除病毒過(guò)程中具有重要作用。B (T1BT2) 4B重組蛋白能夠誘導(dǎo)高水平的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)可能與幾個(gè)因素有關(guān)：第一，細(xì)胞表位的數(shù)量多、串聯(lián)方式能夠有效地突出抗原表位，從而提高了重組蛋白的免疫原性[25]；第二，GEM顆粒的主要成分是肽聚糖本身為T(mén)LR2的激動(dòng)劑，能夠激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，具有免疫增強(qiáng)功能，提高了疫苗的免疫效力[26]。

本研究利用大腸菌表達(dá)系統(tǒng)獲得GEM-B (T1BT2) 4B顆粒性疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其免疫效力接近商品化的多肽疫苗，且抗原制備過(guò)程簡(jiǎn)單方便。雖然B (T1BT2) 4B重組蛋白的免疫效力還需在豬體上進(jìn)一步驗(yàn)證，但研究思路為FMDV基因工程亞單位疫苗的研究提供了借鑒。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Design and immunogenicity evaluation for the bacteria-like particle vaccine against swine type O foot-and-mouth disease virus

Liting Hou1,2, Jin Chen2, Xuwen Qiao2, Xiaoming Yu2, Jibo Hou2,3, Qisheng Zheng2, and Jinnian Li1
1College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei230036,Anhui,China
2National Research Center of Veterinary Biological Engineering and Technology,Nanjing210014,Jiangsu,China
3Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses,Yangzhou225009,Jiangsu,China

Based on gram positive enhancer matrix displaying technology, we designed and evaluated a bacteria-like particle vaccine against swine type O Foot-and-mouth disease virus. Three optimized genes of type O Foot-and-mouth disease virus strain Mya98 were cloned into recombinant prokaryotic expression vector pQZ-PA and renamed as pQZ-BT1B-PA, pQZ-BT2B-PA and pQZ-B (T1BT2) 4B-PA, fused with an anchor protein (PA) binding to Gram-positive enhancer matrix (GEM) particles specifically. The protein expression was identified with SDS-PAGE and Western blotting, and then purified with GEM particles. Five-week old female mice were randomly divided into six groups and all the immunization was developed according to subcutaneous injection. Mice in the first three groups were injected with 50 μg/dose GEM-BT1B, GEM-BT2B and GEM-B (T1BT2) 4B, respectively. Mice in the fourth group were immunized with commercial peptide vaccine as positive control. The fifth group vaccinated with hostE. colitransformed with pQZ-PA fulfilled as negative control. Mice in the last group injected with sterile PBS served as blank control. The humoral immunity of recombinant protein vaccine was evaluated with peptide-specific antibody and LPB antibody. The cellular immunity was evaluated with lymphocyte proliferation test and cytokine expression detection. SDS-PAGE and Western blotting showed that the most part of soluble target fusion protein have been purified and displayed on GEM particles. Vaccine GEM-B (T1BT2) 4B stimulated mice produce not only higher level of specific antibody against peptide and Foot-and-mouth disease virus specific liquid phase blocking antibody, but also more vigorous spleen lymph proliferation and higher levels of Th1 type cytokines. To summarize, vaccine of GEM-B (T1BT2) 4B possessed good immunogenicity and opened a new way for further Foot-and-mouth disease virus subunit vaccine design.

Foot-and-mouth disease virus, VP1 protein, soluble expression, bacteria-like particles, immunogenicity

s:Qisheng Zheng. Tel: +86-25-84392088; E-mail: njcvc1302@163.com

Received:June 22, 2016;Accepted:November 9, 2016

Supported by:The Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No. 201303046), the Independent Innovation of Agricultural Sciences Program of Jiangsu Province (No. CX(14)2089).

Jinnian Li. Tel: +86-551-3388375; E-mail: Lijinnian2000@163.com

公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè)) 科研專(zhuān)項(xiàng) (No. 201303046)，江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng) (No. CX(14)2089) 資助。

時(shí)間：2016-12-09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20161209.1551.002.html