植物內(nèi)生菌生物抗菌活性物質(zhì)研究進(jìn)展

黃敬瑜，張楚軍，姚瑜龍，高旭，侯梓淇，張露，李歐

浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310016

植物內(nèi)生菌生物抗菌活性物質(zhì)研究進(jìn)展

黃敬瑜，張楚軍，姚瑜龍，高旭，侯梓淇，張露，李歐

浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310016

黃敬瑜, 張楚軍, 姚瑜龍, 等. 植物內(nèi)生菌抗菌活性物質(zhì)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(2): 178–186.

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植物內(nèi)生菌作為一種新型的微生物資源，分離和確定其代謝產(chǎn)物是一條尋找新型天然活性物質(zhì)的重要途徑。目前為止，許多研究者從不同的植物內(nèi)生菌中分離到大量具有抗菌活性的新化合物，這些新的化合物被認(rèn)為是解決日益嚴(yán)重的微生物多重耐藥性的希望之一。本文從植物內(nèi)生菌的多樣性、抗菌活性物質(zhì)多樣性及國內(nèi)內(nèi)生菌研究進(jìn)展等多個角度概述了當(dāng)前有關(guān)植物內(nèi)生菌研究的主要成果和最新進(jìn)展，以期為植物內(nèi)生菌相關(guān)研究提供借鑒。

植物內(nèi)生菌，抗菌活性，次生代謝產(chǎn)物

幾乎各類植物中都存在數(shù)目眾多、種類多樣的內(nèi)生菌，其中多數(shù)內(nèi)生菌菌株能分泌多種活性成分，是活性物質(zhì)的重要來源，尤其是有些內(nèi)生菌能夠分泌與宿主相同或相似的活性成分。而且，植物內(nèi)生菌作為一種新型微生物資源還是一個待開發(fā)的新領(lǐng)域，其所產(chǎn)生的活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)較新穎，具臨床應(yīng)用的潛在可能。此外，由于植物自身對毒性分子充當(dāng)了天然選擇系統(tǒng)，造成植物內(nèi)生菌來源的活性物質(zhì)毒性相對較低。因此，合理開發(fā)利用植物的內(nèi)生微生物具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

1 植物內(nèi)生菌的多樣性

內(nèi)生菌 (Endophyte) 是指那些生活史的部分或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物。這類微生物具有以下特征：被感染的植物 (至少暫時) 不表現(xiàn)出外在病癥；可通過組織學(xué)方法從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生[1]。植物內(nèi)生菌是一個龐大的微生物類群，其種類繁多，分布于不同寄主植物的不同部位，因此能產(chǎn)生多種不同的代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲、免疫抑制、抗氧化和降糖等活性。而隨著對現(xiàn)有抗生素耐藥的超級細(xì)菌的出現(xiàn)和耐藥程度的不斷增強(qiáng)，尋找更多療效更顯著的新型抗菌藥物的重要性和緊迫性日益凸顯。而植物內(nèi)生菌為抗菌活性成分的篩選開辟了新的來源，具有誘人的研究前景。

表1 各種不同來源的抗菌活性物質(zhì)Table 1 Example of the endophytic activities against microbes

2 不同種類的植物內(nèi)生菌抗菌活性化合物

植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，具有多種生理活性；且許多內(nèi)生菌在長期的進(jìn)化過程中與宿主植物發(fā)生基因交換，獲得了宿主植物的基因，故可能產(chǎn)生與宿主植物相同的代謝產(chǎn)物，具有與宿主相同或相似的生理活性。植物內(nèi)生菌產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)從而抑制植物病原菌生長是其作為生防菌的重要作用機(jī)制。近年來，從各種不同的植物內(nèi)生菌中分離到不同的抗菌活性成分，包括生物堿、多肽、甾體、萜類、醌類、酮類和酯類等，表1總結(jié)了各種不同來源的抗菌活性物質(zhì)。

2.1 生物堿類

生物堿 (Alkaloids) 是植物次生代謝產(chǎn)物的主要成分之一，絕大多數(shù)生物堿分布在高等植物尤其是雙子葉植物中，而最近的研究表明植物內(nèi)生菌中也能產(chǎn)生大量的生物堿，且某些生物堿具有抑菌活性。Zheng等從藏紅花Crocus sativus中分離得到1株內(nèi)生真菌葡酒色青霉Penicillium vinaceum，能發(fā)酵得到喹唑啉生物堿，活性測定表明其對白色念珠菌、新型隱球菌、紅色毛癬菌、煙曲菌等多種致病菌具有顯著抑菌活性[2]。Zhou等從紅樹林植物木欖Bruguiera gymnorrhiza的內(nèi)生真菌青霉菌Penicilliumsp．GD6中分離得到1個新的雙吡咯烷類生物堿penibruguieramine A，其對金黃色葡萄球菌具有極強(qiáng)的抑菌活性[3]。Govindappa等也從桑寄生科植物的不同部位分離到3株內(nèi)生菌，均能產(chǎn)具抑菌活性的生物堿類化合物[4]。有的植物內(nèi)生菌還能同時產(chǎn)生多種具抗菌活性的生物堿，如從銀杏Ginkgo biloba內(nèi)生球毛殼菌Chaetomium globosum中分離到兩種不同結(jié)構(gòu)的生物堿chaetoglobosins，對毛霉具有較強(qiáng)的抑菌活性[5]。大量的研究表明多種植物內(nèi)生菌中均能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)各異但具抑菌活性的生物堿，如酰胺類、有機(jī)胺類、吡咯類和喹啉類等[23]。這些活性生物堿一部分可作為藥物先導(dǎo)化合物進(jìn)行深入研究，并有望開發(fā)出新的抗菌藥物，另外一部分對植物病原菌具有抑制活性的化合物也可為研發(fā)新型生物農(nóng)藥提供新的希望。但當(dāng)前尚需大量的研究，探討生物堿類抗菌活性物質(zhì)具體的作用機(jī)制、與宿主植物的相互作用方式以及如何通過結(jié)構(gòu)修飾提升活性等。

2.2 肽類化合物

抗菌肽是一種小分子多肽類化合物，許多植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗菌肽具有極強(qiáng)的抗菌活性。從北半球一種常見的杜鵑類灌木Rhododendron tomentosum中分離得到1株內(nèi)生真菌三線鐮刀菌Fusarium tricinctum，產(chǎn)生1種抗菌肽能抑制葡萄球菌、白色念珠菌的生長[6]。Tejesvi等從歐洲赤松Pinus sylvestrisL.的分生組織中分離到1株甲基營養(yǎng)桿菌Methylobacterium extorquensDSM13060，可產(chǎn)1種抗菌肽，對所測試的多株革蘭氏陽性菌具有較高的活性[7]。Cui等從紅樹林植物Acrostichu maureurm中分離到1株青霉Penicilliumsp.，能夠產(chǎn)生兩種新的抗菌肽[8]。當(dāng)前有關(guān)植物內(nèi)生菌所產(chǎn)抗菌肽的報道非常多，且活性相對較高，因此具有潛在的開發(fā)成新型抗菌藥物的應(yīng)用價值。尤其是近年來隨著動物和微生物抗菌肽理論和應(yīng)用研究的逐步深入，先后有Maganin、Nisin和Cecropins等抗菌肽在醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域中成功應(yīng)用[24]，再加上其獨(dú)特的抗菌機(jī)制及不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢，抗菌肽的研究具有廣闊前景。

2.3 甾體類化合物

甾體類化合物是一類具環(huán)戊烷多氫菲碳骨架的化合物的總稱。幾乎所有的生物都能合成甾類化合物，它是最廣泛存在的天然成分之一。而植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的甾體類化合物也是抗菌活性成分的重要來源之一。Dai等從刺柏屬植物Juniperus cedre中分離到一種多節(jié)孢屬真菌Nodulisporiumsp.，其發(fā)酵液粗提物中含有兩種具抗菌活性的甾體類化合物，對所測定的多株細(xì)菌、真菌甚至是藻類均具有一定的抗菌活性[9]。從歐亞甘草Glycyrrhiza uralensis中也分離到1株根瘤菌Mesorhizobium，可產(chǎn)生1種新的抗菌甾體類化合物[10]。另外也有研究者從蛇足石杉Huperzia serrata的內(nèi)生菌產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenumP1X中分離得到9種抗菌甾體類化合物，具有較罕見的C25類固醇骨架[11]。甾體類化合物具有來源廣、價廉，且較少出現(xiàn)耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，這使得甾體類抗菌藥的研究和開發(fā)具有良好的前景。但甾體化合物除抗菌活性外還具有其他生物活性，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)其他活性方面的研究。另外，大部分甾體化合物作為抗菌藥物在抗菌機(jī)制上尚不明確，需進(jìn)一步的探討；且相比其他抗菌化合物，多數(shù)甾體類化合物只具有中等活性，因此還需要篩選更多高活性的甾體類抗菌化合物，以滿足需求。

2.4 萜類化合物

內(nèi)生菌產(chǎn)生的萜類化合物主要為倍半萜、二萜和三萜，而倍半萜是最主要的具抗菌活性的萜類化合物[25]。從桂梅Cassia spectabilis中分離到1株內(nèi)生真菌桂擬莖點(diǎn)霉Phompis cassiae可產(chǎn)生5種不同的倍半萜，對測試的兩種植物致病菌具有極強(qiáng)的抗菌活性[12]。梯牧草Phleum pratense的內(nèi)生柱香菌Epichloe typhina中分到7種倍半萜類化合物對致病菌草本枝孢霉Cladosporium herbarum有明顯的抑制活性[13]。除倍半萜外，研究者發(fā)現(xiàn)其他的萜類也具有抗菌活性。從瑞香科植物Daphnopsis americana莖桿上分到1株內(nèi)生真菌CR115 (菌株尚未鑒定)，能生產(chǎn)一種新的二萜化合物，對兩株具多重耐藥性的金黃色葡萄球菌和糞腸球菌具有明顯的抑制活性[14]。萜類化合物結(jié)構(gòu)眾多，隨著其來源的內(nèi)生菌的不同而呈現(xiàn)出差異性，因此導(dǎo)致其生理活性和藥理學(xué)作用的多樣性。后續(xù)研究中，需在保留藥效基團(tuán)的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成系列衍生物，并研究與抗菌活性相關(guān)的構(gòu)效關(guān)系，則有望得到作用機(jī)制明確、高效、有應(yīng)用前景的候選抗菌藥物，對進(jìn)一步尋找新的具有較好活性的藥物分子具有重要指導(dǎo)意義[26]。

2.5 酮類化合物

酮類化合物具有廣譜的抗菌、抗炎、抗病毒等活性，其抗菌作用包括直接抗菌、協(xié)同抗生素抗菌及抑制細(xì)菌的毒力等。研究發(fā)現(xiàn)許多植物內(nèi)生菌能合成黃酮或者其前體物質(zhì)。Koshno等[21]在巴西的一種植物雀稗芹Paspalum maritimum中分離到1株黃曲霉菌Aspergillus flavus，對黃酮前體查爾酮具有很好的轉(zhuǎn)化效果，能將查爾酮、三甲氧基查爾酮、四甲氧基查爾酮等前體以較高的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的具有抗菌活性的酮類化合物[15]。從Juniperus cedre的多節(jié)孢屬內(nèi)生菌Nodulisporiumsp.中分離到幾種黃酮類物質(zhì)，可作為前體合成具有極強(qiáng)抗菌活性的化合物[9]。Dhanya等從石莼Ulva reticulata中分離到1株內(nèi)生細(xì)菌斯氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri，其發(fā)酵產(chǎn)物中的黃酮類成分對測試的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌等均具有抑菌活性[16]。黃酮類化合物在自然界廣泛存在并且具有良好的抗菌作用，尤其是對現(xiàn)有的許多耐藥菌株具有抗菌活性，且自身不易產(chǎn)生耐藥性，已逐漸成為研究的熱點(diǎn)。但其抗菌機(jī)制研究不足，且多數(shù)研究側(cè)重于體外活性，對體內(nèi)活性的研究相對較少，這些缺陷也急需在后續(xù)的研究中進(jìn)一步完善。

2.6 酯類化合物

植物內(nèi)生菌中已發(fā)現(xiàn)多種具有抑菌活性的酯類化合物。不同的研究表明，在多種植物內(nèi)生真菌、內(nèi)生放線菌中均發(fā)現(xiàn)具抑菌活性的酯類化合物鄰苯二甲酸二丁酯，對常見的植物病原真菌及其他G+細(xì)菌和G?細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抑制作用[27]。銀杏內(nèi)生球毛殼菌C. globosum中也分離到兩種具有抗菌活性的酯類化合物[5]。另外在紅樹林內(nèi)生菌擬莖點(diǎn)霉Phomopsissp.中也分離到2種酯類化合物，對測試的尖孢鐮刀菌和白色念珠菌有較好的抗菌活性[17]。劉寧等從采自西雙版納藥用植物中分離了165株放線菌，抗菌活性測定表明42%菌株可拮抗病原菌，其中1株內(nèi)生放線菌能產(chǎn)6種具抗菌活性的酯類化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)表征鑒定為抗霉素及其衍生物[28]。

2.7 醌類化合物

醌類化合物 (Quinones，quinonoids) 是一類重要的天然產(chǎn)物，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，醌類化合物具有廣泛的生物活性，如抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎消腫以及殺寄生蟲等多種功效。從菊科藥用植物Urospermum picroides的內(nèi)生白粉寄生菌Ampelomycessp.中分離到兩種醌類化合物，對所測試的革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及糞腸球菌等均具有抗菌活性[18]。從龍膽科植物Fragraeab odenii的內(nèi)生真菌擬盤多毛孢屬Pestalotipsis jesteri中分離到2種醌類化合物具有抗終極腐霉的活性[19]。另外從紅樹林中分離到的多種內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌及內(nèi)生真菌均能產(chǎn)具抗菌活性的醌類化合物[29]。雖然從植物內(nèi)生菌中可分離到多種具抗菌活性的醌類化合物，但醌類化合物在內(nèi)生菌中含量較低，再加上次生代謝復(fù)雜，使得相關(guān)化合物的提取存在嚴(yán)重的生態(tài)、環(huán)境污染等問題，嚴(yán)重阻礙了醌類先導(dǎo)化合物的研究與應(yīng)用[30]。

2.8 酚類化合物

從植物內(nèi)生菌中分離的酚類及酚酸類化合物常常具有包括抗菌活性在內(nèi)的多種活性。Richardson等從多株北美白松Pinus strobus中分離到2株格孢菌目真菌MassarinaceaeDAOM 242779 和242780，能產(chǎn)多種酚類物質(zhì)，對測試的枯草芽孢桿菌及1株植物致病菌花藥黑粉菌Microbotryum violaceum具有抑制活性[20]。從梯牧草Phleum pratense內(nèi)生柱香菌Epichloe typhina中也分到5個具有抗菌活性的酚類化合物[21]。另外，Hoffman等[22]也從來自于水冬瓜Saurauia scaberrinae的內(nèi)生菌莖點(diǎn)霉屬Phomasp.中分離到新的酚類化合物phomodione，對包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多株指示菌具有較高的抑菌活性。

2.9 其他化合物

從植物內(nèi)生菌中分離到的抗菌活性化合物種類繁多，除了上述幾類常見的化合物外，還有一部分化合物由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，暫時無法歸類。如從心葉船形果木Eucryphia cordifolia中分離到1株內(nèi)生粘帚霉Gliocladiumsp.，能產(chǎn)生多種揮發(fā)性有機(jī)化合物如環(huán)辛四烯、3-甲基-1-丁醇等，對植物病原菌終極腐霉Pythium ultimum和大麗輪枝菌Verticillum dahliae具有較好的抑菌效果[31]。從1株未知的植物中分離到1株內(nèi)生菌擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis fici，能產(chǎn)生5種環(huán)己酮衍生物類化合物，其中兩種具有抑制煙曲霉的活性[32]。

3 國內(nèi)植物內(nèi)生菌抗菌物質(zhì)研究

近年來，國內(nèi)在植物內(nèi)生菌方面也開展了大量的研究與探索。在20世紀(jì)70?80年代，以中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳延熙教授為主的團(tuán)隊(duì)，在國內(nèi)首次提出了“植物微生態(tài)學(xué)”的概念，并發(fā)展了植物內(nèi)生菌理論，率先開展了多種植物內(nèi)生菌的研究，取得明顯的社會和經(jīng)濟(jì)效益[33]。20世紀(jì)90年代末，隨著國家自然科學(xué)基金委連續(xù)多年出臺相關(guān)政策扶持內(nèi)生菌的研究，有效地帶動了我國植物內(nèi)生菌及其活性物質(zhì)尤其是抗菌活性物質(zhì)的研究。

如南京大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)從多株不同的曲霉中分離到多個對包括幽門螺旋菌在內(nèi)的多株致病真菌和致病細(xì)菌具抑制活性的化合物[34-36]。中山大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)從香蕉的根部分離出24株內(nèi)生菌，對香蕉病原菌具有明顯的抑制作用[37]。另外，中國科學(xué)院植物研究所、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)等多個研究團(tuán)隊(duì)也取得不錯的成果[38]。

目前，我國已形成了一支隊(duì)伍龐大、成果豐碩的科研力量，在國際植物內(nèi)生微生物研究中占有重要的地位。但是，這些研究總體上也存在著“初步研究多、深入追究少”的特點(diǎn)。即具抗菌活性的內(nèi)生菌的分離和初步鑒定多、明確的分類鑒定少；活性菌株的初級篩選多、達(dá)到或接近可應(yīng)用水平的篩選少；活性檢測和物質(zhì)初步提純多、化合物純化與結(jié)構(gòu)鑒定少，發(fā)展到后期可應(yīng)用的事例則更少[38]。而有關(guān)活性化合物的生物合成基因及其調(diào)控的研究則少之又少。因此，國內(nèi)有關(guān)植物內(nèi)生菌的研究單位或研究人員，應(yīng)加強(qiáng)整合與合作，建立一個合適的廣泛交流討論的平臺，集中優(yōu)勢力量深入開發(fā)具有實(shí)際應(yīng)用價值的產(chǎn)品，促進(jìn)內(nèi)生菌的研究走向可持續(xù)及深入發(fā)展的軌道，才能使我國沖向整個世界內(nèi)生菌研究的前沿。

4 展望

綜上所述，植物內(nèi)生菌種類豐富、蘊(yùn)藏量大，從內(nèi)生菌中分離到的抗菌活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)多樣，且毒性較低，相比化學(xué)合成抗菌藥物具有較明顯優(yōu)勢。大量的研究表明，從植物內(nèi)生真菌中可發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎且具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，其中某些化合物的活性較強(qiáng)，具有開發(fā)成為新一類抗菌藥物[39]的潛力。據(jù)估計，地球上存在著數(shù)百萬種微生物，但目前通過可培養(yǎng)的方法成功分離的微生物仍占少數(shù)。因此發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)生菌、分離抗菌活性物質(zhì)的研究仍具有十分廣闊的前景[40]。

當(dāng)然，植物內(nèi)生菌還有許多方面有待加強(qiáng)：1) 對內(nèi)生菌的研究存在一定的盲目性，如植物的選材，應(yīng)充分考慮篩選植物的生長環(huán)境、特殊分布、物種的年代、抗病性以及植物的背景等，可以有效地降低研究的盲目性；2) 必須建立與宿主植物內(nèi)環(huán)境類似的生態(tài)模型，才能真實(shí)反映植物內(nèi)生菌的生物學(xué)特征。內(nèi)生菌長期生活在植物組織內(nèi)部并與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，其形態(tài)特征必然發(fā)生一定的變化以適應(yīng)其內(nèi)生環(huán)境，那么，經(jīng)典的形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)是否能準(zhǔn)確反映其分類地位也值得探討；3) 已分離到的有益菌株尚不能進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)或應(yīng)用階段，因此這些菌株急需進(jìn)行系統(tǒng)研究或遺傳改造，使其早日為人類帶來社會、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益；4) 目前常用的抗菌活性檢測模型不管是對峙培養(yǎng)、帶毒平板、打孔藥劑擴(kuò)散、生物自顯影等方法，都存在不足之處，建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的檢測方法，將會提高活性篩選的效率，減少漏篩的可能性。針對當(dāng)前許多篩選模型效率較低的問題，我們實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行了一定的研究，建立了一種基于96孔深孔板的快速高效的活性篩選方法。此方法通過96孔板發(fā)酵培養(yǎng)植物內(nèi)生菌，并通過快速萃取、氮吹濃縮對樣品進(jìn)行預(yù)處理。這種方法避免某些具活性的化合物因濃度較低而被漏選，提高篩選的陽性率。同時結(jié)合刃天青顯色法的高效篩選方法，節(jié)省篩選工作量，提高篩選效率，成功從丹參、三七等藥用植物中篩選到多株具有較高抗菌活性的內(nèi)生菌 (數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。總之，內(nèi)生菌的研究還處于初級階段，除了現(xiàn)有理論體系和科研技術(shù)的不完善外，人們對內(nèi)生菌認(rèn)識的匱乏和內(nèi)生菌本身對外界環(huán)境適應(yīng)能力不強(qiáng)，產(chǎn)物不穩(wěn)定，離體培養(yǎng)后會出現(xiàn)特性退化和消失等都阻礙了人們對內(nèi)生菌的研究。內(nèi)生菌具有很好的應(yīng)用模式以及潛在的商業(yè)價值，但想要服務(wù)于生產(chǎn)實(shí)踐，仍有很長的路要走[41-42]。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress in antimicrobial substances of endophytes

Jingyu Huang, Chujun Zhang, Yulong Yao, Xu Gao, Ziqi Hou, Lu Zhang, and Ou Li
College of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou310016,Zhejiang,China

Isolation and characterization of metabolites produced by endophytes are significant ways to search for novel natural active substances, proving that the endophytes are the unique resources of newer and more effective compounds. Many new compounds with antimicrobial activity from different endophytes have been isolated so far. These new compounds provide alternatives to fight against multi-drug resistance of microorganisms. This review outlined the major achievements and latest developments of endophytes, including the diversity of endophytes and antimicrobial activity of endophytes, as well as its development in China.

endophyte, antimicrobial activity, secondary metabolites

Ou Li. Tel/Fax: +86-571-86843195; E-mail: Ouli@zstu.edu.cn

Received:July 22, 2016;Accepted:October 27, 2016

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