膽寧片對高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠SOD、MDA的影響

江娜 張金華 王湘寧 劉志平 徐瑩

430010湖北省武漢市漢口醫(yī)院

膽寧片對高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠SOD、MDA的影響

江娜 張金華 王湘寧 劉志平 徐瑩

430010湖北省武漢市漢口醫(yī)院

目的：探討膽寧片對高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠SOD、MDA的影響。方法：SD大鼠53只，首先隨機分為兩組，正常組10只和模型組43只。通過高脂飲食誘導(dǎo)的方式復(fù)制非酒精性脂肪肝大鼠模型。造模第2周起每隔1周隨機處死模型組中1只大鼠觀察造模情況，于4周后確定造模成功，處死正常組10只，剩余40只模型組大鼠隨機分為4組：模型組、膽寧片組、絞股藍組、多烯磷脂酰膽堿組。各組分別予以相應(yīng)劑量的藥物灌胃治療。連續(xù)給藥4周后處死大鼠，生化法檢測血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，比色法檢測肝組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。結(jié)果：治療結(jié)束后，與模型組比較，膽寧片組能有效改善大鼠肝臟病理學(xué)狀態(tài)(P＜0.05)；與模型組比較，膽寧片組大鼠血清中的血脂有不同程度的下降(P＜0.01，P＜0.05)；膽寧片組肝組織MDA含量下降(P＜0.01)、SOD含量升高(P＜0.01)，其中在升高SOD方面優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿組及絞股藍組(P＜0.01)。結(jié)論：膽寧片對改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠具有保護作用。

非酒精性脂肪肝；大鼠；膽寧片；SOD；MDA

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的以肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征[1]，現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達國家和我國富裕地區(qū)慢性肝病的重要病因，歐美國家成人脂肪肝患病率從20世紀(jì)80年代的10%上升到目前的31%[2]。膽寧片由大黃、虎杖、青皮、白茅根、陳皮、郁金、山楂組成，該藥臨床已經(jīng)作為治療慢性膽囊炎、膽囊結(jié)石以及發(fā)展成為治療習(xí)慣性便秘的有效藥物；目前在臨床的應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)該藥對治療NAFLD有一定的療效，因其有價格低廉、安全性高、療效顯著等特點[3]，部分學(xué)者已經(jīng)將其作為治療NAFLD的常用藥。本實驗采用高脂飲食喂養(yǎng)的方式誘導(dǎo)NAFLD的方式，觀察膽寧片對高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NAFLD血脂、肝功能的影響，并通過檢測肝組織中SOD、MDA的變化，研究膽寧片對NAFLD大鼠肝臟的保護作用，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

動物SD大鼠，SPF級，雄性數(shù)量53只，重量180～220 g。

藥品及試劑：膽寧片配制成56.25 mg/mL的溶液，絞股藍總苷片配制成1.875 mg/mL的溶液，多烯磷脂酰膽堿膠囊配制成14.25 mg/mL的溶液。高脂飼料(配方：豬油10%，蛋黃粉5%，膽固醇1%，丙硫氧嘧啶0.2%，脫氧膽酸鈉0.5%，蔗糖5%，基礎(chǔ)飼料78.3%；固體飼料的制備：將各成分按比例計算出所需量)。SOD、MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

方法：①模型的制備、分組及給藥：正常組給予正常飼料進行喂養(yǎng)，模型組給予高脂肪飼料進行喂養(yǎng)，持續(xù)4周的時間，每周處死1只模型組大鼠，觀察造模情況。于造模4周后，將正常組10只和模型組3只大鼠進行處死。對兩組大鼠的肝組織病理切片及肝組織生化進行檢測。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：模型組大鼠肝臟30%以上的肝細胞均已形成大泡伴小泡性脂肪變性及肝臟脂肪含量水平上升[4]。造模結(jié)束后，將另40只模型組大鼠隨機均分為4組：模型組：灌胃生理鹽水10 mL/(kg·d)、膽寧片組：灌胃膽寧片562.5 mg/(kg·d)、絞股藍組：灌胃絞股藍溶液18.75 mg/(kg·d)、多烯磷脂酰膽堿組：灌胃多烯磷脂酰膽堿溶液142.5 mg/(kg·d)。治療4周后，將所有大鼠進行處死，采集血液和肝臟標(biāo)本。②比色法測定肝組織MDA、SOD的含量：MDA測定：精確稱取肝臟300 mg，加入預(yù)冷的2 700 μL生理鹽水中，在冰水中制成10%的勻漿，4℃3 000轉(zhuǎn)離心10 min，提取上清液測定MDA含量。計算公式：組織勻漿中MDA含量=(測定管OD值-測定空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測樣品蛋白濃度。SOD測定：同樣步驟制成10%的勻漿，然后從中取出10 μL，加入另一100 μL的生理鹽水，制備成1%的組織勻漿。4℃3 000轉(zhuǎn)離心10 min，提取上清液測定SOD含量。組織勻漿中SOD含量=(對照OD值-測定OD值)/對照OD÷50%×(反應(yīng)應(yīng)液總體/取樣樣)÷待測樣品蛋白濃度。統(tǒng)計學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用(±s)表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

膽寧片對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝指數(shù)的影響：肝指數(shù)=肝濕重/體重×100%，見表1。與正常組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)明顯升高(P＜0.01)；膽寧片組可明顯降低NAFLD大鼠肝臟指數(shù)。

結(jié)果

表1 各組大鼠肝指數(shù)的比較(±s)

表1 各組大鼠肝指數(shù)的比較(±s)

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05。

組別 動物數(shù) 肝指數(shù)(%)正常組 8 2.94±0.41模型組 8 3.75±0.26##膽寧片組 8 3.24±0.24?絞股藍組 8 3.48±0.20多烯磷脂酰膽堿組 8 3.48±0.45

膽寧片對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠血脂的影響：與正常組比較，模型組TG、TC、LDL均顯著升高，HDL顯著降低；與模型組比較，各治療組TG、TC、LDL均下降，HDL升高，見表2。

表3 各組大鼠肝組織SOD和MDA的比較(±s)

表3 各組大鼠肝組織SOD和MDA的比較(±s)

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01，?P＜0.05；與多烯磷脂酰膽堿組比較，△△P＜0.01；與絞股藍組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù) SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)正常組 8 49.55±4.30 1.04±0.10模型組 8 34.17±3.73## 1.30±0.07##膽寧片組 8 46.24±3.76??△△ 0.96±0.06??絞股藍組 8 32.75±5.80 1.13±0.06多烯磷脂酰膽堿組 8 39.17±4.11? 0.94±0.13??

膽寧片對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠SOD和MDA的影響：與正常組比較，模型組大鼠肝組織中SOD明顯降低(P＜0.01)、MDA明顯升高(P＜0.01)；各治療組藥物均可改善肝組織中SOD和MDA含量，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL、LDL的變化(±s，mmol/L)

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL、LDL的變化(±s，mmol/L)

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01，?P＜0.05。

組別 動物數(shù) TG TC HDL LDL正常組 8 2.13±0.34 1.87±0.35 1.54±0.33 0.39±0.05模型組 8 3.38±0.32## 2.94±0.53## 1.03±0.16## 0.49±0.13##膽寧片組 8 1.88±0.23?? 1.69±0.36?? 1.45±0.17?? 0.35±0.12?絞股藍組 8 2.27±0.31?? 1.79±0.92 1.48±0.12 0.30±0.03多烯磷脂酰膽堿組 8 1.94±0.35?? 2.20±0.59 1.38±0.18 0.38±0.14

討論

近些年來，隨著生活水平的不斷提高、疫苗接種率的逐年提高，人群中肝臟疾病譜也發(fā)生著變化。慢性病毒性肝炎呈逐年下降趨勢，而非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生率不斷上升，不容易引起重視，部分患者會逐步發(fā)展成為肝硬化，因此該疾病的治療日漸成為廣泛關(guān)注的課題。臨床上往往以護肝對癥治療為主，而脂質(zhì)在肝臟過度堆積得不到有效緩解，使疾病容易反復(fù)發(fā)作。

研究報道的非酒精性脂肪肝的發(fā)病因素多，目前尚無統(tǒng)一認識，但二次打擊學(xué)說得到大家公認。目前大多數(shù)人認同NAFLD發(fā)病機制的“二次打擊”學(xué)說[5]。“初次打擊”主要是胰島素抵抗(IR)，通過促使外周脂肪分解增加和高胰島素血癥，引起肝細胞脂肪儲積，從而導(dǎo)致其對損害因子的敏感性增高；“二次打擊”主要是氧應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、線粒體解偶聯(lián)蛋白表達增加、細胞因子及Fas配體被誘導(dǎo)活化，從而引起炎癥和纖維化?！岸未驌簟睂W(xué)說強調(diào)了NAFLD發(fā)病機制中線粒體、氧應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化及細胞防御機制改變的作用及其相互關(guān)聯(lián)的關(guān)系。其中氧應(yīng)激(OS)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧自由基攻擊細胞膜而引發(fā)疾病[6]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，過多的MDA會使體內(nèi)SOD的活力下降，導(dǎo)致機體清除氧自由基的能力進一步下降，加重機體組織、細胞的損傷。因此，測定MDA和SOD水平常可以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映肝細胞受損的程度。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠MDA活力明顯升高，SOD活力明顯降低，說明了肝細胞受損嚴(yán)重。

實驗中，膽寧片治療后肝指數(shù)與模型組比較(P＜0.01)，提示能夠有效改善肝組織中脂質(zhì)過度堆積的情況，從而在根本上解決脂質(zhì)過氧化的問題。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠在予以膽寧片灌胃治療后，肝組織形態(tài)學(xué)明顯改善，肝細胞基本趨向正常。與模型組比較，血液中總膽固醇、甘油三酯含量明顯下降(P＜0.01)，高密度脂蛋白含量明顯升高(P＜0.01)；組織中SOD含量顯著升高(P＜0.01)，而MDA含量則顯著降低(P＜0.01)。肝組織中的MDA含量明顯降低而SOD明顯升高，提示膽寧片可能通過對體內(nèi)SOD活性的影響，作用于氧自由基的產(chǎn)生或清除，在提高SOD方面明顯優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿組。

綜上所述，膽寧片在治療NAFLD時，對肝組織中SOD和MDA的含量均有一定影響，通過對機體氧自由基的產(chǎn)生及清除重新達到平衡，起到了對肝臟的保護作用。此外，能夠通過有效降低血脂的方式，從根本上解決脂質(zhì)氧化、氧自由基產(chǎn)生過多的問題。臨床上選擇膽寧片治療NAFLD是可行的。

[1]中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南[J].中華肝臟病雜志,2006,14(3):161-163.

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Effect of Dan Ning tablet on SOD and MDA in rats with nonalcoholic fatty liver induced by high fat diet

Jiang Na,Zhang Jinhua,Wang Xiangning,Liu Zhiping,Xu Ying
Wuhan City Hankou Hospital of Hubei Province 430010

Research project Wuhan City Clinical Medicine Research Project:WX14C55

Objective:To explore the effect of Dan Ning tablet on SOD and MDA in rats with nonalcoholic fatty liver induced by high fat diet.Methods:53 SD rats were randomly divided into two groups:the normal group with 10 rats and the model group with 43 rats.The nonalcoholic fatty liver rat model was induced by high fat diet.From second weeks after modeling,one rat in the model group was randomly killed to observe the modeling situation for every other 1 weeks.The model was successfully established after 4 weeks,and 10 rats in the normal group were killed.The remaining 40 rats in the model group were randomly divided into 4 groups:the model group,the Dan Ning tablet group,the gynostemma group,the polyene phosphatidylcholine group.The each groups were given corresponding doses of drug gavage treatment.After 4 weeks of continuous administration,the rats were killed,and the serum triglyceride(TG),total cholesterol(TC),high density lipoprotein(HDL),low density lipoprotein(LDL)were detected by biochemistry method.The malonaldehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)content in the liver tissue homogenate were detected by colorimetry.Results:After the end of treatment,compared with the model group,the Dan Ning tablet group could effectively improve liver pathological state of rats(P＜0.05).Compared with the model group,the serum lipid in rat serum of the Dan Ning tablet group had different degrees of decline(P＜0.01,P＜0.05).The liver tissue MDA content of the Dan Ning tablet group was decreased(P＜0.01),and the SOD content was increased(P＜0.01),in which the increase SOD was better than that of the polyenephosphatidylcholine group and the gynostemma group(P＜0.01).Conclusion:Dan Ning tablets have protective effects on the improvement of NAFLD rats induced by high fat diet.

Nonalcoholic fatty liver;Rat;Dan Ning tablets;Superoxide dismutase;Malonaldehyde

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.2.1

科研項目武漢市臨床醫(yī)學(xué)科研項目：WX14C55