不同監(jiān)測方法在奶牛結(jié)核病檢疫中的應(yīng)用

石琴，袁立崗，蒲敬偉，李靜，徐晶晶，梁俊明，沙麗，柳煒

（1.新疆兵團(tuán)第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，烏魯木齊 830009；2.新疆兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站，烏魯木齊 830063）

不同監(jiān)測方法在奶牛結(jié)核病檢疫中的應(yīng)用

石琴1，袁立崗1，蒲敬偉1，李靜2，徐晶晶1，梁俊明1，沙麗1，柳煒1

（1.新疆兵團(tuán)第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，烏魯木齊 830009；2.新疆兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站，烏魯木齊 830063）

為了解牛型提純結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)的相關(guān)性，對規(guī)模牛場先進(jìn)行牛型PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，采集檢疫陽性牛和部分陰性?？鼓M(jìn)行牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)，通過試驗(yàn)結(jié)果找出兩者之間的相關(guān)性，研究牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)在牛結(jié)核病檢疫中的可行性。

奶牛；結(jié)核?。籔PD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)；牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)

牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝桿菌引起的一種慢性傳染病。該病傳染性強(qiáng)，且能通過奶制品傳染給人和其他動物，危害嚴(yán)重，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。近年來，隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥性菌株的產(chǎn)生及規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的增加，結(jié)核病的陽性檢出率也在逐年上升。我國奶牛結(jié)核病檢疫的國家標(biāo)準(zhǔn)是牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（GB/T 18645-2002），但該方法具有操作較繁瑣、耗時(shí)長、較易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)的缺點(diǎn)[1]。牛結(jié)核γ-干擾素ELISA檢測方法是近幾年討論較多的檢測方法，具有方便、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[2]。本試驗(yàn)對牛型提純結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)的相關(guān)性進(jìn)行了分析，探尋ELISA方法在牛結(jié)核病檢疫中的應(yīng)用前景。

1 材料

1．1 試驗(yàn)對象

新疆烏魯木齊近郊某規(guī)?；膛?，存欄為1 580頭。

1．2 檢測試劑牛結(jié)核伽馬干擾素ELSIA檢測試劑盒（批號：p201604-001，由青島瑞爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；提純牛型結(jié)核菌素（批號：201502，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)）。

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2．1 牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

按照GB/T 18645-2002 動物結(jié)核病診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，分別于注射前和注射后12h、24h和72h測量皮膚厚度，并計(jì)算皮厚差，按照國家標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

2．2 牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)

2.2.1 采血

每頭試驗(yàn)牛采集血液5mL，放入肝素抗凝管中，輕輕顛倒幾次混合血液，使肝素溶解，室溫（22±5℃，避免溫度過低或過高）下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在采血后8h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，禁止低溫冷藏。

2.2.2 抗原刺激及血漿樣品的收獲

按照說明書在無菌條件下將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板中，每頭動物加3孔，每孔1.5mL抗凝血，3孔分別加入100μL牛PPD、禽PPD和PBS（陰性抗原對照），用微量振蕩器高速振蕩1min，置37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育16～24h。用可調(diào)移液器小心吸取400μL的上層血漿，轉(zhuǎn)入獨(dú)立的1.5mL離心管中，應(yīng)盡量避免吸入紅細(xì)胞。血漿可在2～8℃貯存7d，在-20℃可貯存幾個(gè)月，檢測前，樣品必須恢復(fù)至室溫并充分混勻。

2.2.3 牛γ-干擾素ELISA試驗(yàn)

試驗(yàn)前將所有試劑（除結(jié)合物外）恢復(fù)至室溫（21℃±3℃），溶解凍干試劑并平衡15min。在酶標(biāo)板中加入100μL待檢血清(不需稀釋）、陰性血清、陽性血清和空白對照各一孔，振蕩混勻，封板，室溫孵育1h；洗板4次，在濾紙上排干；每孔加入100μL新鮮配制的酶標(biāo)結(jié)合物，振蕩混勻，封板，室溫孵育1h；洗板4次，在濾紙上排干；每孔加入100μL底物溶液，振蕩混勻，封板，室溫孵育15min，每孔加入50μL終止液混勻，在5min內(nèi)讀出450nm處的OD值。

2.2.4 結(jié)果判定

當(dāng)陽性對照OD值＞0.700；陰性對照OD值＜0.150試驗(yàn)成立；牛PPD的OD值-PBS的OD值≥0.1且牛PPD的OD值-禽PPD的OD值≥0.1，判為牛型結(jié)核病陽性；

當(dāng)禽PPD的OD值-PBS的OD值≥0.1且禽PPD的OD值-牛PPD的OD值≥0.1時(shí)，判為禽型結(jié)核病陽性；

當(dāng)牛PPD的OD值-PBS的OD值＜0.1或禽PPD的OD值-PBS的OD值＜0.1時(shí)，判為陰性。

3 結(jié)果與分析

3．1 結(jié)果

3.1.1 牛型結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

對新疆烏魯木齊近郊存欄為1 580頭奶牛進(jìn)行PPD檢疫，共檢出14頭陽性奶牛，其余均為陰性，陽性牛未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。

3.1.2 牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗(yàn)

采集14頭PPD檢疫陽性?？鼓?，隨機(jī)采集17頭PPD檢疫陰性?？鼓?，共31頭進(jìn)行γ-干擾素ELISA檢測，檢出牛型結(jié)核病陽性16份，陰性15份，詳見表1。

3．2 結(jié)果分析

牛型PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)共檢出14份陽性，17份陰性；γ-干擾素ELISA試驗(yàn)檢出16份陽性，15份陰性。PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的陽性敏感率為45%，γ-干擾素ELISA試驗(yàn)的陽性敏感率為52%，后者敏感性大于前者。

兩種方法均為陽性的奶牛10頭，陽性符合率為71%；兩種方法均為陰性的11份，陰性符合率為65%，見表2。與近幾年國內(nèi)公布的數(shù)據(jù)一致。

PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)為陽性，γ-干擾素ELISA試驗(yàn)為陰性的4頭。

PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)為陰性，γ-干擾素ELISA試驗(yàn)為陽性的6頭。

表1 不同監(jiān)測方法檢測結(jié)果比較

表2 兩種檢測方法結(jié)果的比較

4 討論

PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)是我國規(guī)定的動物結(jié)核病檢疫國家標(biāo)準(zhǔn)，該方法易操作，一般獸醫(yī)技術(shù)人員經(jīng)過培訓(xùn)都能進(jìn)行，所需器材如結(jié)核菌素注射器和游標(biāo)卡尺都較易準(zhǔn)備，檢疫試劑牛型提純結(jié)核菌素價(jià)格便宜，用于牛結(jié)核病的檢疫費(fèi)用較低，易于推廣。缺點(diǎn)是檢疫結(jié)果受人為因素影響較大，費(fèi)時(shí)長，容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)（假陽性或假陰性），難以標(biāo)準(zhǔn)化。

γ-干擾素ELISA試驗(yàn)的基本原理是動物感染結(jié)核桿菌后，其免疫主要是細(xì)胞免疫，結(jié)核菌素（PPD）遞呈到全血中的淋巴細(xì)胞后，感染過牛分枝桿菌的細(xì)胞在牛分枝桿菌抗原的再次刺激下就能產(chǎn)生高水平的IFN-γ，未感染的不會產(chǎn)生，本試驗(yàn)可以區(qū)分牛分枝桿菌和副結(jié)核或禽分枝桿菌等的感染，減少了假陽性。γ-干擾素ELISA試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是只需采一次血，在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過抗原刺激、檢測，省時(shí)省力，重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化，可以檢測結(jié)核病的早期感染，缺點(diǎn)是檢測試劑盒價(jià)格高，檢測需要有移液器、酶標(biāo)儀、無菌操作臺等儀器設(shè)備，需由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員進(jìn)行操作，基層獸醫(yī)站難以推廣[3]。

從結(jié)果可以看出，γ-干擾素ELISA試驗(yàn)的陽性敏感率（52%）大于PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的陽性敏感率（45%）。在試驗(yàn)中PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)為陰性，γ-干擾素ELISA試驗(yàn)為陽性的奶牛有6頭，這是由于PPD變態(tài)反應(yīng)是一種遲發(fā)型超敏反應(yīng)，根據(jù)機(jī)體差異應(yīng)答反應(yīng)可能推遲，而γ-干擾素ELISA試驗(yàn)可以檢測結(jié)核病的早期感染。

5 結(jié)論

由于γ-干擾素ELISA試驗(yàn)檢測牛結(jié)核病在國內(nèi)尚處于初級階段，該方法比PPD陽性敏感率高，但由于試劑盒價(jià)格高，在牛場的結(jié)核病檢疫中，主要還是用牛型PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行檢疫。由于PPD方法較易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)（假陰性），所以經(jīng)常在春季結(jié)核病檢疫并按規(guī)定淘汰結(jié)核病陽性牛后，到秋季再進(jìn)行結(jié)核病檢疫又檢出很多結(jié)核病陽性牛。

在實(shí)際應(yīng)用中，養(yǎng)殖場可以進(jìn)行一年兩次結(jié)核病檢疫，對于有條件的養(yǎng)殖場可以先用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行初篩，再對陽性牛再進(jìn)行γ-干擾素ELISA試驗(yàn)，這樣可以剔除由禽型分枝桿菌等非特異性反應(yīng)引起的結(jié)核病假陽性牛。若能連續(xù)進(jìn)行2～3年，并嚴(yán)格按照要求對結(jié)核病陽性牛進(jìn)行隔離、撲殺，對養(yǎng)殖場進(jìn)行徹底消毒，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，經(jīng)過幾年就可以凈化奶牛養(yǎng)殖場結(jié)核病。

[1] 楊顯超,吳秀娟,李凱航,等．皮試法與ELISA法在奶牛結(jié)核病檢測中的對比試驗(yàn)[J]．上海畜牧獸醫(yī)通報(bào),2015,2:10．

[2] 徐繼鵬,劉建文．γ-干擾素檢測技術(shù)對奶牛結(jié)核病檢疫的初步應(yīng)用[J]．中國動物保健,2013,2:33．

[3] 胡文婷,曹瑞,張旭霞,等．牛結(jié)核γ-干擾素ELISA 檢測方法的建立及應(yīng)用[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué),2011,3(2):122．

S858.23

A

1004-4264（2017）01-0033-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.01.009

2016-06-20