腎臟組織工程研究進展

陳玉琴，楊亦彬

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州遵義563003)

·綜述·

腎臟組織工程研究進展

陳玉琴，楊亦彬

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州遵義563003)

慢性腎臟病(CKD)已成為日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，其持續(xù)進展的共同結(jié)局是終末期腎臟病(ESRD)。透析和腎移植是目前ESRD主要替代治療手段，但存在種種不足或受限。新興的組織工程技術(shù)在修復、改善和重建人體病損組織或器官已取得可喜的進展，其相關(guān)技術(shù)手段也為腎臟組織工程的研究提供了可能。

腎臟；組織工程；種子細胞；支架；3D生物打印

組織工程旨在應用細胞生物學、生物材料和工程學的原理，研發(fā)用于修復、改善和重建人體病損組織或器官的生物活性替代物。細胞來源、支架材料以及生物活性物質(zhì)是組織工程策略3個主要的組件[1]。腎臟是機體主要的排泄器官，通過腎小球濾過、腎小管上皮細胞和周圍的微血管以及間質(zhì)支持系統(tǒng)互補，來調(diào)節(jié)清除廢物和重吸收。而如何選擇合適的支架材料來模擬體內(nèi)正常的生長環(huán)境，對誘導種子細胞形成腎臟組織是至關(guān)重要的。近年來，新興技術(shù)如去細胞和生物打印技術(shù)革新了組織工程領(lǐng)域，是目前最有前景的兩個器官生物工程方法，使創(chuàng)造復雜的三維器官(如腎臟)成為可能[2-3]。

1 種子細胞的研究

種子細胞是組織工程的核心內(nèi)容之一，能為支架材料提供生命源泉，其主要來源于自體、同種異體或異種，具有增殖和分化為特定細胞的能力以及不引起免疫排斥反應等特點。胚胎干細胞(ESCs)來源于胚胎囊胚的內(nèi)細胞團[4]，是最早期的未分化細胞，具有無限增殖、自我更新和多向分化的潛能，但涉及倫理及移植排斥反應是臨床應用最主要的障礙。而由多個轉(zhuǎn)錄因子重編程普通體細胞獲得人類誘導多能干細胞(IPSCs)，繞開了ESCs面臨的技術(shù)難題和倫理障礙，在再生醫(yī)學及疾病模型等研究領(lǐng)域有著廣闊的應用前景。腎臟是由中胚層通過輸尿管芽的形成和毗鄰的中胚層派生的后腎間質(zhì)分化形成[5]。IPSCs可定向分化成腎臟足細胞，并誘導后腎間質(zhì)標記物的表達，如Wilms腫瘤基因(Wilms tumor 1，WT1)、Pax2基因(paired box gene 2，Pax2)，WT1和Pax2為腎小管上皮細胞胚胎分化、發(fā)育的關(guān)鍵基因[6]。Kim等[7]應用視黃酸、激活素-A和骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)7與ESCs共培養(yǎng)，其ESCs最終可表達中胚層標記，進一步培養(yǎng)后形成腎小管上皮樣結(jié)構(gòu)。在體外，這種干細胞來源的組件顯示腎再生的可能性。

間充質(zhì)干細胞(MSC)由于免疫原性小，不易被宿主免疫系統(tǒng)識別，異體甚至異種移植都具有較好的治療效果，被認為是很有潛力、值得深入研究的組織工程種子細胞。MSC用于腎臟疾病的治療才剛剛起步，眾多研究表明MSC可能成為難治性腎臟疾病的最佳種子細胞。Kale等[8]認為腎組織損傷后，骨髓間充質(zhì)干細胞具有能向腎臟內(nèi)遷移，并定植于腎臟的特性。許多腎臟病理學模型研究也發(fā)現(xiàn)MSC可以歸巢到受損的腎臟，促進組織修復。

除干細胞外，在組織工程模型的發(fā)展中，自體或異體的腎細胞是最直接的來源，迄今已建立了許多動物的腎細胞系，包括狗、豬、兔和老鼠。最近，人近曲小管上皮細胞系HK-2細胞通過不同的細胞永生化技術(shù)得到了發(fā)展并大量應用于組織工程[9]。

2 支架的研究

生物材料在組織工程中起著替代細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的作用，且必須滿足幾個關(guān)鍵特征：(1)生物相容性；(2)擁有適當?shù)臋C械強度；(3)顯示生物活性來調(diào)節(jié)3D細胞微環(huán)境；(4)具有足夠的間隙供營養(yǎng)和代謝廢物擴散。ECM是由細胞分泌到胞外的大分子物質(zhì)，構(gòu)成復雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，因其獨特的優(yōu)點而成為應用最廣的支架材料。ECM支架呈三維空間結(jié)構(gòu)，提供天然和高度保守的基質(zhì)供細胞生存和增殖，還可通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導通路影響細胞分化和遷移。同時，ECM支架能促進移植物新生血管生成，其降解過程中可釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factorβ，TGFβ)等，在支架降解后繼續(xù)促進新生組織分化和生長[10]。

2.1 絲支架慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展是漸進的，某些遺傳性腎病(如多囊腎病)其腎臟病變出現(xiàn)時間跨度較長，故持續(xù)監(jiān)測病理生理變化，對闡明疾病進展和防治是非常必要的。較長時間體外培養(yǎng)的組織結(jié)構(gòu)，其可持續(xù)性是組織工程領(lǐng)域長期存在的問題。傳統(tǒng)的實驗方法包括動物模型和細胞二維培養(yǎng)，存有一定的局限性，而種子細胞在三維條件下培養(yǎng)更接近體內(nèi)真實情況[11]。靜態(tài)系統(tǒng)三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)的細胞3周后開始崩潰，細胞存活率隨時間的推移而降低[12]，故選擇良好的生物材料作支架，對維持長期的組織培養(yǎng)是必不可少的。絲素蛋白(silk fibroin，SF)主要是從家蠶中提取[13]，作為支架具有以下特性：良好的生物相容性，緩慢的生物降解，有強大的力學性能，可保持長時間的框架和開放的多孔結(jié)構(gòu)，而且不需要化學交聯(lián)。同時，絲素也可以制備成水凝膠、復合材料、纖維、微球和薄膜等。絲素需數(shù)月至數(shù)年才會降解而不會有過早的結(jié)構(gòu)坍塌以及在緩慢重塑中支持細胞間的相互作用。Subramanian等[12]通過基于絲素的多孔支架、基質(zhì)膠原和灌注反應堆系統(tǒng)生成3D腎組織模型，成功模擬了腎小管功能，且在灌注條件下至少存活6周。這些多孔的絲支架可能有利于模擬需要較長時間研究的慢性腎臟疾病模型。

2.2 水凝膠水凝膠是一類具有化學或物理交聯(lián)結(jié)構(gòu)、可吸收并保持大量水分而不溶于水的三維支架材料。水凝膠質(zhì)地柔軟，富有彈性，與活體軟組織質(zhì)感相近。此外，水凝膠的三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和天然ECM相似，可通過調(diào)節(jié)孔隙率、孔徑大小、增大內(nèi)表面積等途徑，促進細胞粘附、植入與增殖。天然和合成聚合物通過各種化學交聯(lián)的共價鍵、物理交聯(lián)的非共價相互作用或通過兩者的組合交聯(lián)形成水凝膠矩陣，可增強水的吸附作用，能保持一定的形狀，利于細胞增殖所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和運輸[14]。生物聚合物水凝膠由于其被改型而仍能呈遞與體內(nèi)相似的細胞信號而作為腎臟組織工程的首選[9]。Manivannan等[15]通過使用聚二甲硅氧烷模具構(gòu)建膠原蛋白渠道，種子細胞嵌入在這些凝膠系統(tǒng)并且隨機間隔與其一致的結(jié)構(gòu)形式，這個系統(tǒng)實現(xiàn)了控制小管形成并且允許示蹤細胞的遷移。

2.3 器官脫細胞器官脫細胞后形成的生物支架已成功應用于組織工程和再生醫(yī)學[16]，而脫細胞腎臟是一個相對較新的技術(shù)。脫細胞的過程通常會產(chǎn)生一個具有ECM分子的三維生物支架[17]，ECM可以影響細胞粘附、增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和表型表達等一系列生物學過程，這些因素都有利于腎臟再生。腎臟脫細胞支架可以由嚙齒動物、豬、恒河猴以及人類的腎臟產(chǎn)生[18]，脫細胞后，腎支架已被證實能保存腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)以及血管網(wǎng)絡(luò)[19]。利用脫細胞的腎組織工程支架，多能人胚胎干細胞(hESC)被播種在整個或局部腎臟ECM，通過差異化分析hESC表型來了解細胞遷移，發(fā)現(xiàn)腎譜系標記隨著時間的推移逐步調(diào)節(jié)hESC基因表達。恒河猴脫細胞腎可提供天然的ECM且有足夠的空間和組織影響hESC的遷移和分化[20]。然而，獲得一個合適的人類供體腎存有一定困難，尋找理想的替代異種腎仍是一個挑戰(zhàn)。有研究證明大鼠、豬、猴子的腎是有潛力的，卻具有極強的免疫原性以及各種人畜共患病的風險。羊腎人畜共患病風險低，且器官結(jié)構(gòu)和大小類似于人類，可能是相對理想的器官來源。Vishwakarma等[21]開發(fā)了3D山羊腎支架，通過脫細胞洗滌劑灌注，抗凝劑預處理后，發(fā)現(xiàn)脫細胞羊腎支架具有完整的3D自然架構(gòu)和脈管系統(tǒng)，這為腎臟再生提供較好模型。

選擇最佳來源種子細胞在脫細胞腎支架中增殖是一個仍未解決的問題。目前認為，由多能性干細胞(PSC)來源的腎祖細胞比其他更成熟的細胞用于生物工程腎更合適。原位移植腎支架在技術(shù)上是可行的，為了更好地執(zhí)行移植腎支架的功能，還需要進一步研究這些PSC來源細胞的類型及分化和成熟過程。此外，血栓形成也是腎支架植入的一個主要障礙。有研究報道將脫細胞豬腎支架植入受體豬兩周以后，發(fā)現(xiàn)廣泛的血栓形成，因此為了維持植入脫細胞腎支架的時間，其支架的血管供給是必須考慮的問題[22]。

目前，脫細胞基質(zhì)的研究涉及各種器官和組織。新近有學者將腎臟脫細胞基質(zhì)制成凝膠，發(fā)現(xiàn)脫細胞基質(zhì)經(jīng)處理后可形成白色半透明的凝膠，呈網(wǎng)狀、多孔結(jié)構(gòu)，適合細胞長入，并利用腎小管上皮細胞初步驗證了其生物相容性[23]。這為腎臟組織工程支架的選擇提供了新的思路。

3 生物反應器

生物反應器提供的動態(tài)培養(yǎng)可使支架內(nèi)的氧及營養(yǎng)傳播更充分[24]，代謝產(chǎn)物更容易排出，以及使種子細胞超過被動擴散的深度。此外，生物反應器還能提供很多培養(yǎng)組織所必需的物理信號。

在體外構(gòu)建腎臟模型除了細胞和支架的選擇外，更重要的是如何能更好的模擬體內(nèi)的環(huán)境?其中體內(nèi)流體流動的模擬是至關(guān)重要的。液體過濾是腎臟的重要功能，主要依賴腎小球和腎小管區(qū)流體流動所形成的剪切應力，其中以灌注為基礎(chǔ)的流體流動更適合在體外模擬體內(nèi)腎功能，并通過使用生物反應器系統(tǒng)完成，微流體系統(tǒng)便是其中很好的例子。通過多層微流控裝置來培養(yǎng)及分析腎小管上皮細胞，在最佳的流體條件下，通過增強細胞極化，驗證了細胞骨架的重組[25]。此外，對流體流動的控制可能會得到不同的生物工程模型，從而能更好的模擬不同的疾病狀態(tài)。

4 3D生物打印

面臨國際上器官日益短缺的現(xiàn)狀，3D生物打印[26]可能是解決這一難題最有潛力的新興技術(shù)。3D生物打印制作技術(shù)用于精確分配細胞負載(cell-laden)生物材料來制造復雜的功能性3D活組織或器官[27]。目前研究仍處于初級階段，涉及到的主要技術(shù)挑戰(zhàn)包括高分辨率細胞沉積、細胞分布控制以及三維組織的血管化、神經(jīng)支配等。3D生物打印主要包括3大方式：噴墨、激光輔助和擠壓生物打印，3種技術(shù)各有特定的優(yōu)勢、弱點和局限性，但都是基于單層的印刷法，通常很難印刷復雜的空心結(jié)構(gòu)，因此，每一層都必須互相連接和機械支持打印[3]。目前，結(jié)合人類多能干細胞技術(shù)的最新進展，3D生物打印主要涉及到細胞、肌肉、骨和軟骨。微脈管系統(tǒng)打印的成功應用預示著在生產(chǎn)功能齊全的血管和神經(jīng)支配的復雜組織方面(如腎臟、肝臟等)，3D生物打印有可能是唯一的解決方案[28]。

5 展望

為了更好的概括腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，模擬不同的疾病狀態(tài)，關(guān)鍵在于組織工程化腎臟如何維持種子細胞的生長；維護表型和功能的穩(wěn)定以及單個組件的開發(fā)并結(jié)合為一個整體系統(tǒng)，這些都是腎臟組織工程可控、可靠及可持續(xù)發(fā)展的必要條件。未來的研究需要發(fā)展更強大的混合動力系統(tǒng)使三維組織結(jié)構(gòu)和復雜的細胞相互作用以及與流體流動更好的結(jié)合[9]。脫細胞和3D生物打印技術(shù)在腎臟方面的應用雖然尚處于初級階段，但具有廣闊的應用前景。相信隨著有關(guān)學科的發(fā)展,組織工程方法替代腎臟功能的研究必將會給腎臟病患者帶來新的希望，有望突破器官移植的范疇，步入器官制造的新時代。

[1]Tevlin R,Walmsley GG,Marecic O,et al.Stem and progenitor cells:advancing bone tissue engineering[J].Drug Deliv Transl Res,2016,6(2):159-173.

[2]Katari R,Peloso A,Zambon JP,et al.Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys[J].Nephron Exp Nephrol,2014,126(2):119.

[3]Mandrycky C,Wang Z,Kim K,et al.3D bioprinting for engineering complex tissues[J].BiotechnolAdv,2016,34(4):422-434.

[4]Kingham E,Oreffo RO.Embryonic and induced pluripotent stem cells:unders-tanding,creating,and exploiting the nano-niche for regenerative medicine[J].ACS Nano,2013,26,7(3):1867-1881.

[5]Takasato M,Er PX,Becroft M,et al.Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney[J].Nat Cell Biol,2014,16(1):118-126.

[6]Song B,Smink AM,Jones CV,et al.The directed differentiation of human iPS cells into kidney podocytes[J].PLoS One,2012,7(9):e46453.

[7]Kim D,Dressler GR.Nephrogenic facors promote differentiation 0f mouse embryonic stem cells into renal epithelia[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(12):3527-3534.

[8]Kale S,Karihaloo A,Clark PR,et a1.Bone marrow stem cells contribute to repair of the ischemically injured renal tubule[J].J Clin Invest,2003,112(1):42-49.

[9]Desrochers TM,Palma E,Kaplan DL,et al.Tissue-engineered kidney disease models[J].Adv Drug Deliv Rev,2014,69-70:67-80.

[10]Brown BN,Badylak SF.Extracellular matrix as an inductive scaffold for funct-ional tissue reconstruction[J].Transl Res,2014,163(4):268-285.

[11]Desrochers TM,Suter L,Roth A,et al.Bioengineered 3d human kidney tissue,a platform for the determination of nephrotoxicity[J].PLoS One,2013,8(3):e59219.

[12]Subramanian B,Rudym D,Cannizzaro C,et al.Tissue-engineered three-Dimensionalin vitromodels for normal and diseased kidney[J].Tissue EngPartA,2010,16(9):2821-2831.

[13]Melke J,Midha S,Ghosh S,et al.Silk fibroin as biomaterial for bone tissue engineering[J].Acta Biomater,2016,31:1-16.

[14]Buwalda SJ,Boere KW,Dijkstra PJ,et al.Hydrogels in a historical perspective:from simple networks to smart materials[J].J Control Release,2014,190:254-273.

[15]Manivannan S,Gleghorn JP,Nelson CM.Engineered tissues to quantify collective cell migration during morphogenesis[J].Methods Mol Biol,2012,886:173-182.

[16]Jin M,Yaling Y,Zhibin W,et al.Decellularization of rat kidneys to produce extracellular matrix scaffolds[J].Methods Mol Biol,2016,1397:53-63.

[17]Batchelder CA,Martinez ML,Tarantal AF.Natural scaffolds for renal d-ifferentiation of human embryonic stem cells for kidney tissue engineering[J].PLoS One,2015,10(12):e0143849.

[18]Katari R,Peloso A,Zambon JP,et al.Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys[J].Nephron Exp Nephrol,2014,126(2):119.

[19]Montserrat N,Garreta E,Izpisua Belmonte JC.Regenerative strategies for kidney engineering[J].FEBS J,2016,283(18):3303-3324.

[20]Nakayama KH,Lee CC,Batchelder CA.Tissue specificity of decellularized rhesus monkey kidney and lung scaffolds[J].PLoS One,2013,8(5):e64134.

[21]Vishwakarma SK,Bhavani PG,Bardia A,et al.Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ[J].Indian J Nephrol,2014,24(6):372-375.

[22]Peloso A,Ferrario J,Maiga B,et al.Creation and implantation of acellular rat renal ECM-based scaffolds[J].Organogenesis,2015,11(2):58-74.

[23]張煒煒,劉瑾,陳偉.犬腎臟脫細胞基質(zhì)凝膠的制備及生物相容性實驗研究[J].第三軍醫(yī)大學學報,2015,37(19):1942-1945.

[24]Simmons AD,Williams C 3rd,Degoix A,et al.Sensing metabolites for the monitoring of tissue engineered construct cellularity in perfusion bioreactors[J].Biosens Bioelectron,2017,90:443-449.

[25]Rosines E,Johkura K,Zhang X.Constructing kidney-like tissues from cells based on programs for organ development:toward a method ofin vitrotissue engineering of the kidney[J].Tissue Eng Part A,2010,16(8):2441-2455.

[26]Reed S,Lau G,Delattre B,et al.Macro-and micro-designed chitosan-alginate scaffold architecture by three-dimensional printing and directional freezing[J].Biofabrication,2016,8(1):015003.

[27]Pati F,Jang J,Ha DH,et al.Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink[J].Nat Commun,2014,5:3935.

[28]Gao G,Cui X.Three-dimensional bioprinting in tissue engineering and regenerative medicine[J].Biotechnol Lett,2016,38(2):203-211.

R692

A

1003—6350（2017）18—3013—03

2017-02-15)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.18.026

國家自然科學基金（編號：81260118）

楊亦彬。E-mail:yyb1011@sina.com