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    利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化桂花的SSR-PCR體系

    2017-03-01 06:00:17母洪娜耿興敏楊秀蓮王良桂
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年2期
    關(guān)鍵詞:條帶桂花遺傳

    王 萍, 母洪娜, 耿興敏, 楊秀蓮, 王良桂

    (南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院,江蘇南京 210037)

    利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化桂花的SSR-PCR體系

    王 萍, 母洪娜, 耿興敏, 楊秀蓮, 王良桂

    (南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院,江蘇南京 210037)

    以潢川金桂DNA為SSR-PCR擴(kuò)增模板,采用L16(45)正交設(shè)計(jì)對(duì)Taq酶用量、Mg2+濃度、模板DNA用量、dNTPs濃度以及引物濃度在4個(gè)水平上進(jìn)行了優(yōu)化,建立了桂花SSR-PCR反應(yīng)的最佳體系,即在10 μL反應(yīng)體系中,不同成分的最佳含量為T(mén)aq酶0.2 U、Mg2+3.0 mmol/L、模板DNA 40 ng、dNTPs 0.60 mmol/L、引物0.8 μmol/L。應(yīng)用最佳體系對(duì)引物OfP50進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化,得到最適退火溫度范圍為60~62 ℃。

    桂花;SSR-PCR;體系優(yōu)化;正交設(shè)計(jì)

    簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)是一類由 1~6個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列[1],其長(zhǎng)度在100 bp以內(nèi),廣泛分布于各類真核生物基因組中。SSR標(biāo)記由于具有高度的重復(fù)性、豐富的多態(tài)性、共顯性等優(yōu)點(diǎn),成為構(gòu)建遺傳圖譜[2-3],研究遺傳多樣性,分析親緣關(guān)系[4-5],種質(zhì)鑒定[6-8],進(jìn)行分子輔助標(biāo)記[9-10]、基因定位與克隆[11-12]等的理想工具。

    桂花(OsmanthusfragransLour.)為木犀科木犀屬常綠小喬木或灌木,是城市優(yōu)良的綠化樹(shù)種,也是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一。近年來(lái),對(duì)桂花分子方面的研究主要是利用SRAP[13-14]、RAPD[15]、ISSR[16-18]、AFLP[19-20]這幾種分子標(biāo)記技術(shù),以SSR分子標(biāo)記對(duì)桂花開(kāi)展的相關(guān)研究較少。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對(duì)桂花SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,以期建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的反應(yīng)體系,為今后利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)桂花開(kāi)展進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)桂花采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的潢川金桂,提取其DNA作為SSR-PCR反應(yīng)的模板DNA??旖菪椭参锘蚪MDNA提取試劑盒(非離心柱型)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;dNTPs、Mg2+、10×Buffer(Mg2+Free)、TaqDNA聚合酶、SSR引物、Marker(DL50)均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。根據(jù)筆者前期試驗(yàn),引物OfP50(5′-TTACCACCAAGATGACAGCGG-3′、5′-CCGCCCCCTTTCTCTCTCTA-3′)對(duì)于桂花具有良好的條帶可讀性與多態(tài)性,故選其為此次正交試驗(yàn)及退火溫度的固定引物。

    1.2 基因組DNA的提取

    取生長(zhǎng)良好的潢川金桂嫩葉,采用試劑盒的方法提取DNA。DNA的純度和濃度測(cè)定使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì),選用D260 nm/D280 nm在1.7~1.9且濃度大于 20 ng/μL 的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增前將DNA稀釋至 20 ng/μL。

    1.3 PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)

    選用L16(45)正交設(shè)計(jì)表,對(duì)PCR反應(yīng)中5個(gè)因素(Taq酶含量、dNTPs含量、Mg2+含量、模板DNA含量、引物含量)在4個(gè)水平上進(jìn)行試驗(yàn),因素水平的選取參考徐沂春等的方法[21-22]并加以綜合。PCR反應(yīng)因素水平見(jiàn)表1,L16(45)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2,本試驗(yàn)采用 10 μL 體系,不足體積用ddH2O補(bǔ)齊,試驗(yàn)設(shè)2次重復(fù)。

    表1 優(yōu)化桂花PCR反應(yīng)體系的因素水平

    1.4 SSR-PCR擴(kuò)增

    PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Biometrac TPfofessional Standard PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序:首先94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。

    1.5 反應(yīng)產(chǎn)物的電泳與檢測(cè)

    在PCR產(chǎn)物中加入5 μL 0.25%溴酚藍(lán),然后加樣,樣孔中每樣品點(diǎn)樣1 μL,D50Marker為對(duì)照,用12%聚丙烯酰胺凝膠于恒壓240 V電壓下電泳1 h左右,再進(jìn)行銀染和顯影,凝膠在燈光下用數(shù)碼相機(jī)照相以供分析。

    1.6 退火溫度的篩選

    采用試驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)體系對(duì)本次試驗(yàn)所用引物OfP50 的退火溫度進(jìn)行篩選。利用 ABI Veriti梯度PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)程序中退火溫度梯度試驗(yàn)。設(shè)置退火溫度為 48~65 ℃,共18個(gè)梯度,對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

    表2 優(yōu)化桂花SSR-PCR反應(yīng)體系L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.7 最佳反應(yīng)體系的檢測(cè)

    隨機(jī)選擇引物OfP16(5′-TGCATTTCTGACGCCTGGAT-3′、5′-ACCGTTGTCAAGCCCCTTTT-3′)對(duì)21份采集于南京林業(yè)大學(xué)校園同一植株的潢川金桂實(shí)生苗DNA進(jìn)行SSR擴(kuò)增,對(duì)優(yōu)化確定的桂花SSR-PCR體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 正交試驗(yàn)

    從圖1可以看出,5個(gè)因素的濃度組合不同,擴(kuò)增出來(lái)的效果存在明顯差異。處理1、處理5、處理9沒(méi)有條帶;處理7、處理11、處理12、處理14、處理15、處理16擴(kuò)增出了分子量小于50 bp的引物二聚體,處理15、處理16存在不同程度的雜帶;處理2、處理6、處理8、處理10條帶比較模糊;處理3、處理4、處理13擴(kuò)增出了比較好的條帶。綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素以及清晰度,選擇處理4為最佳體系,即在10 μL反應(yīng)體系中,Taq酶含量為0.2 U,Mg2+濃度為3.0 mmol/L,模板DNA含量為40 ng、dNTPs濃度為0.60 mmol/L、引物濃度為 0.8 μmol/L。

    2.2 退火溫度篩選

    退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有較大的影響,引物在最適宜的退火溫度下擴(kuò)增出來(lái)的條帶清晰,反之條帶會(huì)模糊、拖尾。試驗(yàn)對(duì)引物OfP50設(shè)置了18個(gè)不同的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增,不同溫度條件下產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2,退火溫度過(guò)低,非特異性條帶增多,結(jié)果不可靠;退火溫度過(guò)高時(shí),引物與模板結(jié)合差,清晰度下降。綜合考慮條帶數(shù)與清晰度,引物OfP50適宜的退火溫度范圍為60~62 ℃。

    2.3 最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè)

    應(yīng)用該最佳反應(yīng)體系,隨機(jī)選擇引物OfP16對(duì)21份取自同植株的潢川金桂實(shí)生苗DNA進(jìn)行擴(kuò)增,從圖3可以看出,21份DNA模板都擴(kuò)增出了清晰目的條帶,說(shuō)明該體系較穩(wěn)定,適用于桂花SSR-PCR反應(yīng)。

    3 討論

    PCR的體積對(duì)擴(kuò)增效果有一定影響,體積過(guò)小,容易出現(xiàn)操作上的誤差,體積過(guò)大,增加試驗(yàn)成本。本試驗(yàn)采用 10 μL 反應(yīng)體系,得到了清晰的條帶,相較王靜對(duì)桂花采用的20 μL反應(yīng)體系[22],節(jié)省了試驗(yàn)材料,并節(jié)約了成本。

    引物的退火溫度對(duì)擴(kuò)增效果有較大的影響,因此,采用不同的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí),須對(duì)引物進(jìn)行退火溫度篩選,以確定最適宜的退火溫度。

    正交設(shè)計(jì)的優(yōu)越性就在于能均衡各個(gè)試驗(yàn)因素并考慮到各因素間的交互效應(yīng),在減少試驗(yàn)次數(shù)的同時(shí)又不使信息損失過(guò)多,可以在最短的時(shí)間內(nèi)找到最優(yōu)的組合[23]。很多學(xué)者在優(yōu)化體系時(shí)也經(jīng)常使用多次單因素設(shè)計(jì)[24-26],這種方法雖然簡(jiǎn)便易行,但忽略了試驗(yàn)因素間的交互效應(yīng),因此不能完全保證各個(gè)因素的最佳濃度組合到一起就是最佳反應(yīng)體系,但是結(jié)果可以作為正交設(shè)計(jì)結(jié)果的參考。

    桂花SSR-PCR優(yōu)化體系的建立,可為今后桂花及其他木犀科植物的群體遺傳及基因型鑒定提供參考。

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    10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.011

    2016-01-12

    國(guó)家科技支撐計(jì)劃(編號(hào):2013BA001B06);江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程(編號(hào):PAPD)。

    王 萍(1989—),女,江蘇常熟人,碩士,研究方向?yàn)閳@林植物育種。E-mail:alvawang@yeah.net。

    王良桂,男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)閳@林植物應(yīng)用。E-mail:wlg@nifu.com.cn。

    S685.130.1

    A

    1002-1302(2017)02-0044-03

    王 萍,母洪娜,耿興敏,等. 利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化桂花的SSR-PCR體系[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(2):44-46.

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