牛BBOX1基因3′UTR變異體的克隆及其多態(tài)性分析

宋雨霏，郭 彥，辛友志，崔建偉，周國利

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252059)

牛BBOX1基因3′UTR變異體的克隆及其多態(tài)性分析

宋雨霏，郭 彥，辛友志，崔建偉，周國利*

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252059)

為鑒定牛BBOX1基因選擇性多聚腺苷酸化的不同變異體及其3′UTR的多態(tài)性，采用3′RACE的方法檢測出BBOX1基因3個不同3′UTR全長的APA變異體，短APA變異體3′ UTR長度為229 bp，長APA變異體3′UTR長度分別為664 bp和678 bp。利用SSCP與測序相結(jié)合的方法，在BBOX1基因的3′UTR中檢測到10個多態(tài)性，其中7個為SNP，分別為c.12T>C、c.100A>G、c.241T>C、c.480T>C、c.557T>C、c.606T>C和c.650T>C；3個為插入或缺失突變，分別為c.28_29insC、c.434_435delGT和c.512_513insTGC。SNP c.650T>C定位在Poly(A)加尾信號PAS3中，使加尾信號序列AAUAAA突變成AACAAA，導(dǎo)致3′ UTR長度為678 bp的變異體出現(xiàn)。

牛；BBOX1基因； 選擇性多聚腺苷酸化； 多態(tài)性； 3′ UTR

左旋肉堿是體內(nèi)脂肪代謝必需的內(nèi)在物質(zhì)，其具有促進(jìn)脂肪酸的β-氧化、降低血清膽固醇及甘油三酯的含量、提高機(jī)體耐受力等重要生理功能[1]。還可以和線粒體內(nèi)的短鏈?；?乙酰、丙酰、支鏈酰等)結(jié)合，形成酰-肉堿排出細(xì)胞外，從而起到調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)?；鵆oA與CoA-SH的比例的作用，并為細(xì)胞質(zhì)中脂肪酸合成提供乙?；蟍2]。因此，左旋肉堿對動物的生長發(fā)育、繁殖、健康具有重要的作用[3]。左旋肉堿主要是在5種酶的作用下，以賴氨酸和蛋氨酸為原料合成[4]。在左旋肉堿的生物合成途徑中，最后一步反應(yīng)由γ-丁酰甜菜堿羥化酶(gamma-butyrobetaine hydroxylase 1,BBOX1)催化完成[5]。研究報道，不同飲食可以改變BBOX1基因的表達(dá)水平和酶的活性，從而影響肉毒堿的利用。增加脂肪酸利用將會相應(yīng)地提高左旋肉堿合成相關(guān)酶的含量及左旋肉堿的水平。禁食時機(jī)體將優(yōu)先利用脂肪酸作為能量來源，所以會引起B(yǎng)BOX1基因 mRNA水平、BBOX1酶活性和左旋肉堿含量的上升[6]。

人和鼠的BBOX1基因的cDNA翻譯區(qū)已被克隆，在這2個物種中，開放閱讀框(ORF)長度為1 161 bp，編碼387個氨基酸[7-8]。通過3′RACE方法，已經(jīng)鑒定出人、小鼠的BBOX1基因存在不同長度的3′UTR選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)變異體[9-10]。小鼠高脂肪飼喂后，BBOX1基因的近端多聚腺苷酸加尾信號的變異體的mRNA表達(dá)量增加2.1倍，從而導(dǎo)致BBOX1活性和左旋肉堿產(chǎn)量的提高[10]。目前，關(guān)于牛的BBOX1基因的APA變異體及該基因遺傳變異的研究尚未見報道。為此，鑒定了牛BBOX1基因的APA變異體，并檢測該基因3′UTR的多態(tài)性，以期為該基因在牛肉質(zhì)性狀及脂肪沉積中的功能研究奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試動物

供試魯西黃牛和草原紅牛分別來自山東省聊城市張爐集鎮(zhèn)牛場和吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗牛場。

1.2 主要試劑

SMARTTMRACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒和Advantage?2 PCR 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；pGM Simple T Fast克隆試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；動物組織基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Trizol、TaqDNA 聚合酶、dNTPs、EDTA、SDS、氯仿、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 組織樣品采集、DNA及總RNA的提取

魯西黃牛和草原紅牛各30頭，用打耳器采集耳組織樣品，將其放入75%乙醇中帶回實驗室，-20 ℃保存。用動物組織基因組DNA抽取試劑盒提取耳組織的基因組DNA，溶于TE緩沖液中，-20 ℃保存。在山東省聊城市張爐集鎮(zhèn)屠宰廠，采集3頭魯西黃牛的肝臟組織，屠宰后20 min內(nèi)采集肝臟組織并迅速投到液氮中帶回實驗室，利用Trizol試劑提取總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.4 3′ RACE鑒定BBOX1基因的APA變異體

根據(jù)NCBI中電子克隆的牛BBOX1基因(NM_001101881.2)的mRNA序列，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計1條3′RACE基因特異性引物，用于擴(kuò)增BBOX1基因的不同長度的APA剪切變異體。引物序列為5′-GGCTTATGCTGACTGGGATGTG-3′。利用方法1.3中提取的肝臟組織的總RNA為材料進(jìn)行3′RACE，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。3′ RACE的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用凝膠DNA回收試劑盒純化回收，將回收的產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，獲得的陽性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果采用DNAStar 5.0進(jìn)行序列分析。

1.5 牛BBOX1基因3′ UTR的多態(tài)性檢測

根據(jù)NCBI中牛BBOX1基因(NM_001101881.2)的mRNA序列設(shè)計2對引物，用于擴(kuò)增BBOX1基因3′UTR區(qū)域。F1為5′-ATGCTGACTGGGATGTGG-3′，R1為5′-GGGCAAAAGAGAGTTCAGGAT-3′；F2為5′-GAAATGAATCCGCCACAGGTAT-3′，R2為5′-TTGGTGAGGGCTGGAAAT-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括50 ng基因組DNA，10 pmol/L 的上、下游引物，200 μmol/L 的dNTPs，1.5 mmol/L MgCl2，1.5 UTaq酶。樣品經(jīng)94 ℃變性3 min后，按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，最后72 ℃延伸30 s，33個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用SSCP的方法鑒定BBOX1基因3′UTR區(qū)的遺傳變異。取2 μL PCR 產(chǎn)物和5 μL上樣緩沖液[98%甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA(pH值8.0)、10%甘油]置于PCR 管中，離心混勻，98 ℃變性10 min，迅速插入冰中，放置10 min，使之保持變性狀態(tài)。樣品用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯帶。用凝膠成像系統(tǒng)拍照,進(jìn)行基因型分析并記錄結(jié)果。然后分別選擇2個不同電泳條帶的純合基因型個體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，用NCBI 中的BLAST程序及DNAStar軟件比較它們之間的核苷酸變異。應(yīng)用RegRNA 2.0程序(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/)預(yù)測BBOX1基因3′UTR區(qū)的miRNA結(jié)合位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛BBOX1基因APA變異體

牛BBOX1基因3′ RACE的產(chǎn)物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了條帶清晰、特異性好的2條帶，片段長度與預(yù)期的相符(圖1)。進(jìn)一步將大小不同的2個3′ RACE產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序驗證，結(jié)果表明，3′ RACE產(chǎn)物是BBOX1基因3′ UTR的不同APA變異體，且發(fā)現(xiàn)了3個不同長度的APA變異體(圖2)。通過分析發(fā)現(xiàn)，變異體Ⅰ利用的是近端加尾信號PAS1，而變異體Ⅱ和Ⅲ分別利用遠(yuǎn)端加尾信號PAS3和PAS4。加尾信號PAS2功能未知，需進(jìn)一步研究。以加poly(A)位點為終點，短的APA變異體3′ UTR長度為229 bp(變異體Ⅰ)，加尾信號與其加尾位點之間為15 bp，較長的APA變異體3′ UTR長度為664 bp(變異體Ⅱ)和678 bp(變異體Ⅲ)，加尾信號PAS3、PAS4與各自的加尾位點之間的距離分別是11 bp和7 bp。而且，PAS3中的堿基T突變?yōu)閴A基C(c.650T>C)，導(dǎo)致變異體Ⅲ的出現(xiàn)。

M.DL2000 DNA Marker； 1—3.3′ RACE擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 魯西黃牛BBOX1基因3′ RACE產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

帶有雙下劃線的“TGA”為終止密碼子，終止密碼子后的第1個堿基記為“+1”；矩形方框內(nèi)的“AATAAA”為多聚腺苷酸加尾信號，依次為PAS1、PAS2、PAS3和PAS4；帶單下劃線的堿基位置為pol(A)加尾位點，并代表不同的剪切變異體，依次為變異體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ圖2 牛BBOX1基因不同多聚腺苷酸化位點的3′ UTR序列

2.2 牛BBOX1基因3′UTR的SNPs鑒定

在魯西黃牛和草原紅牛的研究群體中，通過SSCP與測序相結(jié)合的方法，在BBOX1基因3′UTR中共檢測到10個多態(tài)性(表1)，其中7個為SNPs，分別為c.12T>C、c.100A>G、c.241T>C、c.480T>C、c.557T>C、c.606T>C和c.650T>C；3個為插入或缺失突變，分別為c.28_29insC、c.434_435delGT和c.512_513insTGC。SNP c.650T>C落在Poly(A)加尾信號PAS3中，使加尾信號序列AAUAAA突變成AACAAA。這些多態(tài)性都能造成某種限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點缺失。對BBOX1基因3′UTR區(qū)的miRNA結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，bta-miR-2451、bta-miR-1343和bta-miR-2454分別定位在c.12T>C、c.512_513insTGC、c.557T>C突變區(qū)域內(nèi)。

表1 牛BBOX1基因3′ UTR區(qū)的遺傳變異

注：SNPs位置以mRNA序列(NM_001101881.2)為參考序列，以終止密碼子下游的第1個堿基定為“1”。

3 結(jié)論與討論

多聚腺苷酸化位點的選擇決定著mRNA的3′UTR的長度，3′UTR調(diào)控序列的呈現(xiàn)或缺失最終可能會影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平。mRNA 3′UTR的不同長度可能會導(dǎo)致mRNA不同的穩(wěn)定性或翻譯能力。更長的3′UTR包含更多的與miRNA和/或RNA結(jié)合蛋白等結(jié)合的順式作用元件，從而影響mRNA的穩(wěn)定性、定位和翻譯[11-12]。研究表明，大約有54%的人基因和52%的小鼠基因存在APA[13-14]。本研究鑒定了3個不同長度的3′ UTR，每個多聚腺苷酸化位點前都包含至少1個加尾信號(AATAAA)，但在加尾過程中具體使用的加尾信號需進(jìn)一步研究確定。一般情況下，加尾信號位于切割位點上游10～30 bp。由此推測，這些加尾信號可能都起到一定的作用。許多加尾信號下游的切割位點是不精確的，且常包含著多個切割位點。這樣的情況在22%的嚙齒動物轉(zhuǎn)錄本中也有發(fā)現(xiàn)，而且在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，大約47%的鼠科動物基因中存在這種異質(zhì)性[15]。目前，在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有2個不同的3′ UTR變異體，1個長的和1個短的3′ UTR變異體，每個加尾信號后的切割位點也不精確，存在多個切割位點[9]。在小鼠中鑒定出5個不同長度的3′UTR變異體，4個較短的3′ UTR變異體，1個長的3′UTR變異體，其中最短的3′UTR變異體包含2個加尾切割位點[10]。本研究通過3′ RACE試驗，在牛中鑒定了3個不同長度的3′ UTR變異體，1個短的和2個長的3′UTR變異體，都與人類的相似性較高，而與小鼠的差別較大。

SNPs是指在基因組上單個核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入，但通常所說的SNPs并不包括后2種情況。SNPs形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。SNPs 是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異，在人類基因組中大概每1 000個堿基就有1個SNP。因此，SNPs成為第3代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等都可能與SNPs有關(guān)[16-18]。本研究在牛BBOX1基因的3′UTR中檢測到了10個多態(tài)性，如此高的多態(tài)性數(shù)量可能與3′UTR區(qū)變異程度較高有關(guān)。其中,c.650T>C定位在Poly(A)加尾信號中，使加尾信號序列AAUAAA突變成AACAAA，推測該SNP可能對APA的形成及基因的表達(dá)有影響。另外，bta-miR-2451、bta-miR-1343和bta-miR-2454分別位于c.12T>C、c.512_513insTGC、c.557T>C突變區(qū)域內(nèi)，推測這些突變位點可能是成因性突變，對基因的表達(dá)調(diào)控及基因的功能有重要影響。通過對牛BBOX1基因的APA變異體的鑒定及3′UTR的SNPs檢測，可以為牛BBOX1基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，也為牛肉質(zhì)及脂肪沉積的研究提供了分子生物學(xué)素材。

[1] Le Borgne F,Ben Mohamed A,Logerot M,etal.Changes in carnitine octanoyltransferase activity inducealteration in fatty acid metabolism[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2011,409(4):699-704.

[2] Ramsay R R.The role of the carnitine system in peroxisomal fatty acid oxidation[J].American Journal of the Medical Sciences,1999,318(1):28-35.

[3] Vaz F M,Wanders R J.Carnitine biosynthesis in mammals[J].Biochemical Journal,2002,361(Pt 3):417-429.

[4] Tanphaichitr V,Broquist H P.Site of carnitine biosynthesis in rat[J].Journal of Nutrition,1974,104(12):1669-1673.

[5] Hausinger R P.Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent hydroxylases and related enzymes[J].Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,2004,39(1):21-68.

[6] Vlies N V,Ferdinandusse S,Turkenburg M,etal.PPAR alpha-activation results in enhanced carnitine biosynthesis and OCTN2-mediated hepatic carnitine accumulation[J].Biochimica Et Biophysic Acta,2007,1767(9):1134-1142.

[7] Vaz F M,VanGool S,Ofman R,etal.Carnitine biosynthesis: Identification of the cDNA encoding human gamma-butyrobetaine hydroxylase[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1998,250(2):506-510.

[8] Galland S,Le Borgne F,Bouchard F,etal.Molecular cloning and characterization of the cDNA encoding the rat liver gamma-butyrobetaine hydroxylase[J].Biochimica Et Biophysica Acta,1999,1441(1):85-92.

[9] Rigault C,Le Borgne F,Demarquoy J.Genomic structure,alternative maturation and tissue expression of the humanBBOX1 gene[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2006,1761(12):1469-1481.

[10] Rigault C,Le Borgne F,Tazir B,etal.A high-fat diet increases L-carnitine synthesis through a differential maturation of theBbox1 mRNAs[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2013,1831(2):370-377.

[11] Akman H B,Erson-Bensan A E.Alternative polyadenylation and its impact on cellular processes[J].MicroRNA,2014,3(1):2-9.

[12] Sandberg R,Neilson J R,Sarma A,etal.Proliferating cells express mRNAs with shortened 3′ untranslated regions and fewer microRNA target sites[J].Science,2008,320:1643-1647.

[13] Shepard P J,Choi E A,Lu J,etal.Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq[J].RNA,2011,17(4):761-772.

[14] Tian B,Hu J,Zhang H B,etal.A large-scale analysis of mRNA polyadenylation of human and mouse genes[J].Nucleic Acids Research,2005,33(1):201-212.

[15] Mandel C R,Kaneko S,Zhang H,etal.Polyadenylation factor CPSF-73 is the pre-mRNA 3′-end-processing endonuclease[J].Nature,2006,444:953-956.

[16] Allais S,Journaux L,Levéziel H,etal.Effects of polymorphisms in the calpastatin and μ-calpain genes on meat tenderness in 3 French beef breeds[J].Journal of Animal Science,2011,89(1):1-11.

[17] Capon F,Allen M H,Ameen M,etal.A synonymous SNP of the corneodesmosin gene leads to increased mRNA stability and demonstrates association with psoriasis across diverse ethnic groups[J].Human Molecular Genetics,2004,13(20):2361-2368.

[18] Kimchi-Sarfaty C,Oh J M,Kim I W,etal.A “silen” polymorphism in theMDR1 gene changes substrate specificity[J].Science,2007,315(5811):525-528.

Cloning of 3′UTR Isoforms and Polymorphisms in Bovine BBOX1 Gene

SONG Yufei,GUO Yan,XIN Youzhi,CUI Jianwei,ZHOU Guoli*

(College of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng 252059,China)

The objective of this study was to identify isoforms of 3′UTR and polymorphisms in 3′UTR regions of bovineBBOX1 gene.Three different alternative polyadenylation(APA) isoforms of 3′UTR in theBBOX1 gene were identified by 3′RACE.Their lengths were 229,664,678 bp,respectively.Ten polymorphisms loci were identified in 3′UTR ofBBOX1 gene by single strand conformation polymorphism(SSCP) and sequencing.There were seven SNPs,including c.12T>C,c.100A>G,c.241T>C,c.480T>C,c.557T>C,c.606T>C,and c.650T>C.Three were deletion/insertion mutations,including c.28_29insC,c.434_435delGT,and c.512_513insTGC.SNP c.650T>C was located in polyadenylation signals sequence PAS3.Moreover,the mutation changed AAUAAA into AACAAA,resulting in presence of 678 bp isform of 3′UTR in bovineBBOX1 gene.

cattle;BBOX1 gene; APA; polymorphisms; 3′UTR

2016-08-20

國家自然科學(xué)基金項目(31571274)；山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2015CM025)；聊城大學(xué)博士啟動基金項目(31805)

宋雨霏(1993-)，女，山東菏澤人，在讀碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。 E-mail：448953745@qq.com

*通訊作者：周國利(1975-)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，副教授，博士，主要從事動物遺傳與功能基因遺傳調(diào)控研究。 E-mail:glzhou1975@163.com

S813.2

A

1004-3268(2017)02-0120-04