富氫水處理對采后番茄果實灰霉病抗性的影響

盧 慧，伍冰倩，王伊帆，劉妮妮，孟凡虹，胡振宇，趙瑞瑞，趙 珩

(中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081)

富氫水處理對采后番茄果實灰霉病抗性的影響

盧 慧，伍冰倩*，王伊帆，劉妮妮，孟凡虹，胡振宇，趙瑞瑞，趙 珩**

(中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081)

以采后番茄果實為試驗材料，通過不同濃度富氫水(HRW)浸泡番茄果實，研究氫氣對番茄果實抗灰霉病的作用效果。結(jié)果表明，與對照組(蒸餾水處理)相比，50%和75% HRW處理降低了損傷接種番茄果實的發(fā)病情況，接菌后9 d病斑面積分別是對照組的87.2%和77.9%；HRW處理可以不同程度地提高番茄果實的多酚氧化酶(PPO)活性，其中75% HRW處理組PPO活性在接菌后3 d與對照組差異達到極顯著水平(P<0.001)，是對照組的1.59倍；HRW處理提高了番茄果實中的一氧化氮含量，其中50% HRW處理組在接菌后3 d和9 d與對照組差異均達到極顯著水平(P<0.001)，分別是對照組的2.56倍和3.13倍。綜上所述，氫氣可能作為信號分子參與植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，增強了番茄果實對灰霉菌的抗性。

番茄果實； 氫氣； 富氫水； 灰霉菌； 抗病性

氫氣 (H2) 是一種小分子氣體，具有抗氧化、抗炎和抗過敏的作用[1-2]，并能選擇性地降低生物體內(nèi)的羥基自由基 (·OH) 和過氧亞硝基 (ONOO-) 含量[3-4]，常作為治療性醫(yī)療氣體用于臨床。H2可以通過直接吸入、以富氫水(hydrogen-rich water,HRW)的形式口服攝入、以富氫水生理鹽水注射以及氫浴[5]的形式作用于人體和動物模型，治療包括帕金森病、糖尿病、神經(jīng)損傷以及腎損傷等的多種疾病[6-8]。近年來的研究表明，H2能夠作為一種新型的信號分子參與植物脅迫應(yīng)答[9]。H2能夠緩解鹽脅迫[10]，降低鹽脅迫和百草枯造成的氧化損傷[11]；具有抗氧化、延緩植物衰老的作用[12]；能促使植物氣孔關(guān)閉，增強植物耐旱能力[13]；緩解金屬離子造成的氧化損傷[14-15]；誘導植物不定根的產(chǎn)生[16-17]；參與植物激素調(diào)控的抗病蟲害信號途徑[18]。

番茄是研究果實采后生理與病理的一種經(jīng)典模式材料[19]。番茄灰霉病是由灰霉菌(Botrytiscinerea)引起的，灰霉病發(fā)病后傳播速度很快，能造成嚴重的爛果現(xiàn)象，是影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一[20-22]。本研究以采后番茄果實為試驗材料，通過不同濃度HRW浸泡番茄果實，檢測HRW對損傷接種番茄果實發(fā)病情況、病斑面積、多酚氧化酶(PPO)活性和一氧化氮(NO)含量的影響，研究H2對番茄抗灰霉菌的作用效果，旨在探索利用小分子氣體提高采后番茄果實抗真菌病害的新型方式，對提高番茄自身抗性、保護生態(tài)環(huán)境、提高經(jīng)濟效益具有十分重要的現(xiàn)實意義。

1 材料和方法

1.1 材料

將番茄(Solanumlycopersicumvs.Messina) 播種于山東濱州番茄種植基地大棚中，標記花期。采摘綠熟期(花期為45 d)番茄果實立即運至實驗室，挑選大小均勻、無病蟲害和傷痕的完好果實，置于(25±1)℃、相對濕度90%～95%的環(huán)境中釋放田間熱，次日進行處理。

1.2 方法

1.2.1 HRW的制備 參考林玉婷[23]的方法，稍加改動。將H2以150 mL/min的流速通入含5 L蒸餾水的廣口瓶中持續(xù)4 h，即為飽和HRW。氣相色譜測定表明，飽和HRW中H2濃度為0.25 mmol/L，常溫下該濃度能夠保持12 h。之后立即用蒸餾水按不同體積比將HRW稀釋至試驗所需濃度。

1.2.2 番茄果實處理 參考Hu等[12]的方法，稍加改動。將番茄果實浸泡在3%次氯酸鈉溶液中2 min進行表面消毒，清水洗凈后自然晾干。共設(shè)5組處理：蒸餾水對照、25% HRW、50% HRW、75% HRW、100% HRW。用不同濃度HRW浸泡番茄30 min后，取出晾干。

接種前，用槍頭在番茄果實赤道部位扎2個寬2 mm、深4 mm的孔；取在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d的番茄灰霉菌，在無菌條件下用無菌水(含0.01% Tween-80)配制成1×106cfu/mL的孢子懸浮液；向每個孔中注入10 μL孢子懸浮液。接種后，將果實置于(25±1)℃、相對濕度90%～95%的環(huán)境中。分別于0、3、6、9 d進行取樣，每個處理分別取30個番茄果實，環(huán)灰霉病斑切取1 cm 寬度未發(fā)病的果皮，并迅速切成小塊，用液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 指標測定 接種灰霉菌后0 d、3 d、6 d和9 d，各處理組隨機選取10個番茄進行拍照，記錄番茄果實發(fā)病情況。果實損傷病斑面積統(tǒng)計參考方中達[24]的方法，于接種灰霉菌后的3 d、6 d和9 d共3個時間點(發(fā)病明顯、病斑直徑適宜統(tǒng)計)統(tǒng)計番茄果實病斑直徑，每個處理重復(fù)3次，每次統(tǒng)計10個果實，病斑面積計算公式：病斑面積(mm2)=3.14×(病斑直徑/2)2。PPO活性的測定參照Zauberman等[25]的方法；組織內(nèi)NO含量用一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度HRW處理對番茄果實發(fā)病情況和病斑面積的影響

對照組番茄果實在接種灰霉菌后3 d開始出現(xiàn)明顯病癥，9 d發(fā)病狀況明顯，發(fā)病果實接種處可見邊緣明顯的輻射形水浸狀病斑。接種灰霉菌后9 d，25% HRW處理組與對照組番茄果實的發(fā)病情況相近，與對照組相比，100% HRW處理組番茄果實的發(fā)病情況更明顯，而50%和75% HRW處理明顯降低了損傷接種番茄果實的發(fā)病情況(圖1A)。此外，75%和100% HRW處理組的番茄果實成熟較為緩慢，變紅程度低于對照組，表明H2可能具有抗氧化、延緩果實衰老的作用。

從圖1B可以看出，除100% HRW處理組接菌9 d番茄病斑面積較對照組高(為對照組的1.72倍)以外，25%、50%、75% HRW處理組病斑面積均較對照組降低，接菌9 d其病斑面積分別為對照組的84.4%、87.2%、77.9%。上述結(jié)果說明，HRW處理可在一定程度上增強番茄果實抗灰霉菌侵染的能力，綜合發(fā)病情況，初步認為50%和75% HRW 2組處理對番茄果實的保護作用相對其他組更好，而100% HRW預(yù)處理則加重了病情。

圖1 不同濃度HRW處理對接種后番茄果實發(fā)病情況(A)和病斑面積(B)的影響

2.2 不同濃度HRW處理對番茄果實PPO活性的影響

PPO是與植物抗病性密切相關(guān)的酶，它在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用[26]。從圖2可以看出，HRW處理可以不同程度地提高接菌后番茄果實的PPO活性。25%、50%和75% 3個HRW處理組，隨接菌時間延長PPO活性整體表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。25% HRW處理組PPO活性僅在接菌后3 d高于對照組，是對照組的1.24倍，差異達到極顯著水平(P<0.01)，6 d和9 d均低于對照組。50%和75% HRW處理組番茄PPO活性在接菌后3 d和6 d均高于對照組，兩組處理在接菌后3 d的PPO活性分別是對照組的1.19倍和1.59倍，其中，75% HRW處理組與對照組差異達到極顯著水平(P<0.001)；接菌后6 d的PPO活性分別是對照組的1.05倍和1.06倍，差異未達到顯著水平；接菌后9 d則低于對照組。100% HRW處理組番茄PPO活性始終高于對照組，接菌后3 d、6 d和9 d分別是對照組的1.74倍、1.07倍和1.11倍，其中，接菌后3 d差異達到極顯著水平(P<0.001)，接菌后9 d差異達到顯著水平(P<0.05)。

與對照組相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。下同圖2 不同濃度HRW處理對接種后番茄果實PPO活性的影響

2.3 不同濃度HRW處理對番茄果實內(nèi)源NO含量的影響

NO在植物抗病防御反應(yīng)和脅迫響應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用[27-28]，能有效誘導采后番茄果實的抗病性[29]。對接種灰霉菌后的番茄果實進行NO含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HRW處理提高了番茄體內(nèi)的NO含量，4個處理組NO含量在接菌后3 d、6 d和9 d均高于對照組(圖3)。在接菌后3 d，25%和50% HRW處理組NO含量分別是對照組的2.24倍和2.56倍，25% HRW處理組與對照組差異達到極顯著水平(P<0.01)，50% HRW處理組與對照組差異更為明顯(P<0.001)；在接菌后6 d，25%、50%、75% HRW處理組NO含量分別是對照組的2.22、2.16、2.05倍，差異均達到顯著水平(P<0.05)；在接菌后9 d，25%、50%、75% HRW處理組NO含量分別是對照組的2.30、3.13、1.40倍，其中，25% HRW處理組與對照組差異達到了顯著水平(P<0.05)，50% HRW處理組與對照組差異達到了極顯著水平(P<0.001)；100% HRW處理組NO含量在接菌后3 d、6 d和9 d均高于對照組，但均未達到顯著水平。以上結(jié)果表明，在接種灰霉菌后，50% HRW組番茄果實NO含量升高程度較其他處理組更明顯。

圖3 不同濃度HRW處理對接種后番茄果實NO含量的影響

3 結(jié)論與討論

H2作為一種重要的信號分子，參與調(diào)節(jié)植物的多種非生物脅迫反應(yīng)[11,18,30]，能誘導植物產(chǎn)生對非生物脅迫的抗性，如耐鹽、抗百草枯、抗氧化脅迫、抗重金屬等[15]。Zeng等[18]以水稻和綠豆種子為試驗材料，通過不同濃度的HRW處理，證明H2作為抗氧化劑、種子萌發(fā)和植物脅迫反應(yīng)中的信號分子等多種角色，參與高等植物水楊酸、茉莉酸和乙烯等激素調(diào)控的抗病蟲害信號途徑；H2能調(diào)控植物激素受體基因的轉(zhuǎn)錄并促使抗氧化基因表達量上調(diào)；植物能產(chǎn)生內(nèi)源H2，其產(chǎn)量也受到茉莉酸和乙烯濃度的影響。

本研究以番茄果實為試驗材料，以HRW浸泡番茄果實的方式提供外源H2，通過損傷接種灰霉菌引發(fā)番茄果實的灰霉病，研究H2在采后番茄果實抗灰霉菌中的作用。結(jié)果顯示，25% HRW處理組與對照組發(fā)病程度相似，50% 和75% HRW處理明顯降低了接種灰霉菌番茄果實的發(fā)病情況和病斑面積，而100% HRW處理則加重了病情。PPO參與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)代謝，它能將植物的酚類物質(zhì)氧化成毒性更強的醌類物質(zhì)，毒殺病原菌并限制其擴散，起到抗病的作用[26]。因此，PPO常作為植物抗病的重要生理指標之一。Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)，過表達PPO的轉(zhuǎn)基因番茄具有更強的抵御病原菌侵染的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，接菌后3 d和6 d，與對照組相比，50%和75% HRW處理不同程度地提高了番茄果實的PPO活性。鄭鄢燕[22]發(fā)現(xiàn)，外源NO處理能增強番茄果實的抗病性。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，25%和50% HRW處理在接菌后3 d、6 d和9 d可以不同程度地促進番茄果實內(nèi)源NO含量增加，差異均達到顯著水平，75% HRW處理組在接菌后6 d番茄果實內(nèi)源NO含量也顯著增加，總體上50% HRW處理組番茄果實NO含量升高程度較其他處理組更明顯。綜上所述，中等濃度的HRW處理(50%、75%)在一定程度上增強了番茄果實抗灰霉病侵染的能力，低濃度的HRW處理(25%)沒有起到保護作用，而過高濃度的HRW處理(100%)不僅未提高番茄果實的抗病性，而且可能增加灰霉菌對番茄果實的傷害。

與施用農(nóng)藥進行植物病害防治相比，使用適當濃度的HRW處理植物提高其抗病能力是綠色環(huán)保、簡單易行的。然而，還需要進一步深入研究H2如何參與植物抗病途徑，明確H2作為信號分子在植物抗病途徑中的作用機制。

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Effects of Hydrogen-rich Water Treatment on Defense Responses of Postharvest Tomato Fruit to Botrytis cinerea

LU Hui,WU Bingqian*,WANG Yifan,LIU Nini,MENG Fanhong,HU Zhenyu,ZHAO Ruirui,ZHAO Heng**

(Department of Life and Environmental Sciences,Minzu University of China,Beijing 100081,China)

In this study,we used postharvest tomato fruit as experimental materials,which were soaked in different concentrations of hydrogen-rich water(HRW) and then inoculated withBotrytiscinerea,to study the protective effect of HRW in tomato resistance toBotrytiscinerea.Compared with the control group treated by distilled water,50% and 75% HRW treatments reduced the disease injury of inoculated tomato fruit,and the lesion areas at 9 d after inoculation were 87.2% and 77.9% of the control group,respectively.HRW treatment could increase the polyphenol oxidase(PPO) activity in different degree.The PPO activity of 75% HRW treatment group was significantly different from the control group after 3 d (P< 0.001),which was 1.59 times of the control group.The nitric oxide(NO) content of tomato fruit increased after HRW treatment.The NO content of 50% HRW treatment group was significantly different from the control group after 3 d and 9 d (P< 0.001),2.56 and 3.13 times of the control group,respectively.This study indicated that hydrogen might be involved in plant stress responses as a signaling molecule,and enhanced the defense responses of tomato fruit toBotrytiscinerea.

tomato fruit; hydrogen; hydrogen-rich water;Botrytiscinerea; disease resistance

2016-10-21

中共中央組織部“千人計劃”項目；中央民族大學學科建設(shè)項目(YDZXXK201618)

盧 慧(1985-)，女，湖南長沙人，在讀博士研究生，研究方向：植物免疫學。E-mail：susanluhui@163.com 伍冰倩(1994-)，女，湖南衡陽人，在讀碩士研究生，研究方向：免疫學。E-mail：13810471803@163.com。*共同第一作者

**通訊作者：趙 珩(1970-)，女，安徽合肥人，教授，博士，主要從事免疫學研究。E-mail：hengzhao2000@gmail.com

S436.412.1

A

1004-3268(2017)02-0064-05