水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf6功能標(biāo)記開發(fā)及微核心種質(zhì)中Rf6基因的篩選

徐 雪，王 英，鄒禮平，魏 朗，彭 方，黃文超，段俊枝，姚國(guó)新,*

(1.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000； 2.湖北神農(nóng)架林區(qū)農(nóng)林局，湖北 神農(nóng)架林區(qū) 442499；3.雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072； 4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002)

水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf6功能標(biāo)記開發(fā)及微核心種質(zhì)中Rf6基因的篩選

徐 雪1，王 英2，鄒禮平1，魏 朗1，彭 方1，黃文超3，段俊枝4，姚國(guó)新1,3*

(1.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000； 2.湖北神農(nóng)架林區(qū)農(nóng)林局，湖北 神農(nóng)架林區(qū) 442499；3.雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072； 4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002)

核恢復(fù)基因Rf6是紅蓮型雜交水稻特有的新恢復(fù)基因，為了尋找更多具有Rf6恢復(fù)基因的種質(zhì)，以擴(kuò)展紅蓮型雜交水稻的恢復(fù)系來(lái)源，組配更多優(yōu)良雜交品系，利用Rf6及其等位基因的序列差異，開發(fā)Rf6基因的功能標(biāo)記，并利用該標(biāo)記對(duì)中國(guó)水稻微核心種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選具有Rf6恢復(fù)基因的種質(zhì)。結(jié)果表明，在324 bp插入片段(Rf6較其等位基因插入324 bp)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物(正向引物：5′-ATGACAAGAGGACCAGCGATGCAATGG-3′,反向引物：5′-ATTCTTGCAGAGATAGACCATGAGCGTG-3′)，利用該引物可擴(kuò)增出條帶清晰且無(wú)雜帶的差異片段，可用于Rf6基因的鑒定。利用該標(biāo)記在197份中國(guó)水稻微核心種質(zhì)中篩選出22份具有Rf6恢復(fù)基因的種質(zhì)，可為拓寬紅蓮型雜交水稻的恢復(fù)系來(lái)源提供材料。

紅蓮型水稻； 恢復(fù)基因Rf6； 微核心種質(zhì)

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)是植物界一種普遍現(xiàn)象，是指植物不能產(chǎn)生花粉或產(chǎn)生的花粉無(wú)活力, 導(dǎo)致雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一種母性遺傳現(xiàn)象。核恢復(fù)基因(restorer of fertility，Rf)是能夠恢復(fù)CMS花粉育性的基因，利用CMS/Rf系統(tǒng)可大量生產(chǎn)雜交種。目前，水稻CMS主要有3種類型：野敗型(WA)、紅蓮型(HL)和包臺(tái)型(BT)。研究表明，orf79和orfH79分別是WA和HL型CMS的不育基因[1]，Rf1恢復(fù)BT型CMS的育性[2]，Rf3和Rf4恢復(fù)WA型CMS的育性[3-4]，Rf5和Rf6恢復(fù)HL型CMS的育性[5-6]。Rf1和Rf5是等位基因，Rf6是新發(fā)現(xiàn)的HL型CMS的特有恢復(fù)基因，對(duì)其他類型CMS不具有恢復(fù)功能?；謴?fù)基因的來(lái)源直接限制HL型雜交水稻的組配，對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的利用起著決定性的作用。目前，Rf6基因已經(jīng)被定位克隆，與其等位基因rf6相比，Rf6基因存在3個(gè)重復(fù)插入序列，比rf6基因長(zhǎng)324 bp，rf6由于缺失插入序列而失去育性恢復(fù)功能[7]。傳統(tǒng)尋找恢復(fù)系的方法是與不育系進(jìn)行雜交，考察下一代F1的花粉育性，能夠恢復(fù)花粉育性的材料可作為恢復(fù)系利用，這種方法比較盲目，缺乏針對(duì)性，而且耗時(shí)長(zhǎng)。開發(fā)恢復(fù)系恢復(fù)基因功能分子標(biāo)記，篩選具有恢復(fù)基因的材料，進(jìn)行組合配制，可減少工作量，節(jié)省時(shí)間。目前，尚未見Rf6基因功能標(biāo)記開發(fā)的報(bào)道，本研究在Rf6基因插入的324 bp序列兩側(cè)設(shè)計(jì)基因內(nèi)功能分子標(biāo)記，對(duì)中國(guó)栽培水稻微核心種質(zhì)進(jìn)行篩選，以期從中獲得含有Rf6恢復(fù)基因的種質(zhì)，用于HL型雜交水稻恢復(fù)系選育。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

197份中國(guó)栽培稻微核心種質(zhì)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李自超教授實(shí)驗(yàn)室提供，9311(陽(yáng)性對(duì)照)、日本晴(Nip，陰性對(duì)照)、粵太A(YTA)、粵太(YTB)和寧粳3號(hào)(NJ3)等材料由雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室種植保存。2016年5月，所有材料種植于湖北孝感，常規(guī)方法種植管理。

1.2 引物設(shè)計(jì)

Rf6及其等位基因序列由NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載，采用Primer Premier 5和Gene Runner設(shè)計(jì)功能標(biāo)記引物YRf6。

1.3 DNA提取、RCR擴(kuò)增及電泳

取3葉期幼苗葉片，采用CTAB法提取各材料DNA，稀釋至20 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含Taq酶0.10 μL(2.5 U/μL)、引物1.5 μL(10 mmol/L)、dNTP 0.1 μL(10 mmol/L)、DNA 1 μL(20 ng/μL)、10×buffer 1.0 μL、滅菌蒸餾水 6.3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2%的瓊脂糖凝膠電泳30 min，EB染色后，采用Gellogic 200成像系統(tǒng)讀帶分析。

2 結(jié)果與分析

2.1Rf6基因功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增效果

與沒(méi)有育性恢復(fù)功能的rf6基因相比，有育性恢復(fù)功能的Rf6基因存在324 bp的插入序列[7]。因此，將YRf6引物(表1)設(shè)計(jì)在324 bp插入位點(diǎn)前后，用該標(biāo)記可擴(kuò)增出763/439 bp的片段。為了鑒定該標(biāo)記的擴(kuò)增效果，用該標(biāo)記對(duì)9311、YTA、YTB、Nip和NJ3的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，條帶清晰且無(wú)雜帶，可用于Rf6基因的鑒定。

表1 YRf6標(biāo)記的序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

2.2 中國(guó)栽培水稻微核心種質(zhì)中Rf6基因的篩選

對(duì)197份中國(guó)栽培稻微核心種質(zhì)進(jìn)行DNA提取，然后利用設(shè)計(jì)的YRf6標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，部分?jǐn)U增電泳結(jié)果見圖2。擴(kuò)增結(jié)果清晰，區(qū)分效果良好。所有擴(kuò)增結(jié)果整理匯總于表2中，共篩選到含Rf6恢復(fù)基因的材料22份，占微核心種質(zhì)材料的11.2%，其中四川(5份)、云南(4份)和福建(3份)省是分布較多的省份，在東北和西北地區(qū)的水稻微核心種質(zhì)中沒(méi)有檢測(cè)到Rf6基因。

圖1 YRf6功能標(biāo)記的擴(kuò)增效果

圖2 部分微核心種質(zhì)中Rf6恢復(fù)基因的擴(kuò)增電泳結(jié)果(編號(hào)材料名稱與表2對(duì)應(yīng))

編號(hào)名稱來(lái)源有無(wú)Rf6編號(hào)名稱來(lái)源有無(wú)Rf6編號(hào)名稱來(lái)源有無(wú)Rf6編號(hào)名稱來(lái)源有無(wú)Rf619311江蘇+51麻谷子陜西-103秋前白安徽-162墨米廣西-2NIP(日本晴)日本-52白毛稻黑龍江-104肥東塘稻安徽-163粳87-304湖南-3葡萄黃天津-53黃絲桂占廣東-105臺(tái)山糯江西-164湘晚秈3號(hào)湖南-4六十早安徽-54丹東陸稻遼寧-106矮禾遲江西-165鎮(zhèn)秈232江蘇+5清可云南-55悶加丁2海南-108陸財(cái)號(hào)福建+166早秈240安徽-6老造谷云南-56齊眉廣東-110餓死牛廣東-167鄭稻5號(hào)河南-7麻谷糯貴州-57葉里藏花河北-111白殼花螺廣東-168萬(wàn)利秈湖南-8滇瑞409B云南-58金優(yōu)1號(hào)福建-112赤殼糯廣東-169矮仔占廣西-9飯毫皮云南-59齊頭白谷云南-115霸王鞭1湖北-170鹽水赤福建+10包二幅海南-60紫糯云南-116須谷糯湖南-171西什15廣東-1188B江蘇-61瀘科3號(hào)四川+117紅旗5號(hào)湖南-172紅粳旱谷廣西-12四倍體朝6北京-62遼粳287遼寧-118細(xì)白粘四川-173拉木加云南-13香谷云南-63湘早秈7號(hào)湖南-119南天綱酒四川-17480B湖南-14旱麻稻河南-64齊頭谷云南-120中農(nóng)4號(hào)四川-175古154湖南-15三粒寸廣東-65臺(tái)東陸稻臺(tái)灣-121三顆寸四川+176圭630湖南-16南京11號(hào)江蘇-66魚眼糯云南-122本邦谷云南-177IR661-1湖南-17一支香福建-67紅米三擔(dān)江西-125毫萊云南+178培C122湖南-18鼠牙占廣東-68湖恢628湖南-126金枝糯云南-179粳7623上海-19矮密江西-69絲苗廣東-127雞血糯云南-180寧恢21江蘇-20洞庭晚秈湖北-69宣恩長(zhǎng)壇湖北-128烏咀紅谷云南-18176-1遼寧-21公居73云南-70魔王谷內(nèi)云南-129背子糯云南-182特青選恢湖南-22毫慮光粘貴州-71三七十云南-130澤谷貴州-183JWR221江蘇-23金溪白江西-72老紅稻陜西-131香糯貴州-184橫縣良春廣西-24臺(tái)中秈選2臺(tái)灣-73小紅谷云南-132馬尾粘貴州+185山酒谷四川-25有芒早粳上海-74寸三粒江蘇-134陽(yáng)殼糯貴州-186冷水糯云南+26臺(tái)中在來(lái)1臺(tái)灣-76廣陸矮4號(hào)廣東+136加巴拉西藏-187毫香云南+27丹東陸稻遼寧-77湘晚秈1號(hào)湖南-137包選21號(hào)廣東-188金南特B湖南-28當(dāng)育5號(hào)安徽-78五子堆云南-138文香糯云南+189竹珍B湖南-29高陽(yáng)淀稻河北-79閩北晚秈福建-139毫補(bǔ)卡云南-190朝陽(yáng)一號(hào)B湖南+30毫荒臘云南-80悶加高1海南-140大彎糯云南-191L301B湖南-31隆化毛葫河北-81桂朝2號(hào)廣東-141毫巴永1云南-192安農(nóng)晚粳B湖南-32秕五升云南-82南特號(hào)江西-142冷水谷2云南-193金南特43B湖南+33矮沱谷151四川-83柳葉粘湖北+143黃皮糯云南-194早熟農(nóng)虎6湖南-34成農(nóng)水晶四川-84京虎B安徽-144半節(jié)芒云南-195青四矮16B廣東-35白殼旱禾湖南-85黑督4廣東-145八百粒云南-196珍汕97B江西-36油粘貴州-86湘恢91269湖南-147飛蛾糯2貴州-197獻(xiàn)改B江西-37金包銀福建-87二鋼矮廣東-148紫芒飛蛾貴州-198江農(nóng)早1號(hào)江西-38毫馬克(K)云南-88三百粒江西-149洞庭晚秈湖北-199黎明B遼寧-39臺(tái)中65號(hào)臺(tái)灣-89紅殼折糯貴州-150柳沙1號(hào)廣西-200包協(xié)-7B湖南-40小白米貴州-90香稻河南-151桂花黃江蘇-201G珍汕97B四川+41紫米云南-91紅谷四川-152蘇粳2號(hào)江蘇-204中樓一號(hào)山西-42七月秈廣西-92南雄早油廣東-153成都矮3號(hào)四川-205興國(guó)吉林-43矮麻抗四川-93梅花糯四川+154立新粳四川-206雷火占安徽+44紅矮糯廣西-94水原300粒河北-155黑粳2號(hào)黑龍江-207麻麻谷四川+45木瓜糯湖南-95寸谷糯貴州-156廣陸矮15-1廣西-210衛(wèi)國(guó)遼寧-46解放秈江西-96木樨球上海-157紅晚1號(hào)福建+211百歌稻江蘇-47包協(xié)123B湖南-97鐵稈烏浙江-158湘矮早10湖南-213烏殼占福建-48光殼香糯廣西-98秀水115浙江-159揚(yáng)稻2號(hào)江蘇-214南高谷云南-49郴晚3號(hào)湖南-99二九南1號(hào)浙江+160晉稻1號(hào)山西+215細(xì)麻線云南-50貫推白禾1貴州-1100矮腳南特廣東+161早熟香黑廣西-

注：+表示能檢測(cè)出Rf6基因，-表示未檢測(cè)出Rf6基因。

3 結(jié)論與討論

3.1 拓寬Rf6恢復(fù)基因資源，加速HL型雜交水稻發(fā)展

Rf6恢復(fù)基因攜帶材料占微核心種質(zhì)的11.2%，種質(zhì)資源較少，若采用雜交方法篩選效率很低，工作量大，采用分子功能標(biāo)記篩選，效率很高。HL型核質(zhì)互作不育系的強(qiáng)恢復(fù)系具備2對(duì)恢復(fù)基因Rf5和Rf6，可抵抗高溫等逆境[8]，更加穩(wěn)產(chǎn)。其中，Rf5恢復(fù)基因的資源豐富，制約強(qiáng)恢復(fù)系選育的一個(gè)重要原因可能是Rf6恢復(fù)基因資源較少。目前,已經(jīng)選育出一系列高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)HL型雜交水稻品種，在生產(chǎn)上其推廣面積累計(jì)超過(guò)600萬(wàn)hm2[8]，但其恢復(fù)系基本局限于9311及其改良品系，來(lái)源狹窄。篩選的22份含有Rf6基因的種質(zhì)資源會(huì)拓寬HL型雜交水稻恢復(fù)系的選育來(lái)源。

3.2 充分挖掘微核心種質(zhì)蘊(yùn)藏的基因資源，促進(jìn)水稻優(yōu)異基因聚合育種

我國(guó)是水稻重要的起源地之一，在南方許多省份都蘊(yùn)含著豐富的遺傳育種資源。我國(guó)保存的水稻種質(zhì)已經(jīng)超過(guò)7萬(wàn)份，最少的樣本保存最大的基因資源是構(gòu)建微核心種質(zhì)庫(kù)的目的，同時(shí)利用微核心種質(zhì)尋找優(yōu)異基因也是重要目標(biāo)。針對(duì)微核心種質(zhì)的基因資源篩選方面已有不少報(bào)道，在抗病、抗旱、耐冷等方面獲得了非常好的進(jìn)展[9-12]。在育性恢復(fù)基因、廣親和基因等方面的資源篩選是進(jìn)一步挖掘微核心種質(zhì)基因庫(kù)優(yōu)異基因的重要內(nèi)容，更多優(yōu)異基因和優(yōu)異種質(zhì)是培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病和廣適水稻新品種的基礎(chǔ)。

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Functional Markers Development of Restore GeneRf6 in Rice and Screening ofRf6 in Micro-core Collections

XU Xue1,WANG Ying2,ZOU Liping1,WEI Lang1,PENG Fang1,HUANG Wenchao3,DUAN Junzhi4，YAO Guoxin1,3*

(1.School of Life and Science Technology,Hubei Engineering University,Xiaogan 432000,China; 2.Agricultural and Forestry Bureau of Shengnongjia Forest Region,Shengnongjia Forest Region 442499,China； 3.College of Life Sciences,Wuhan University/State Key Laboratory of Hybrid Rice,Wuhan 430072,China; 4.Institute of Agricultural Economy and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Rf6 is a new rice restoring gene of HL type,in order to select more restoring lines withRf6 for increasing restoring lines to hybrid more combinations,the functional marker ofRf6 was developed according to the difference of sequence ofRf6 and its allele,and this marker was used to screen lines withRf6 among Chinese rice micro-core collections.The results indicated that the marker designed in both sides of the inserted 324 bp fragment(there was a 324 bp inserting fragment betweenRf6 and its allele)could generate clear andnon-background production,and this marker(forward sequence 5′-ATGACAAGAGGACCAGCGATGCAATGG-3′, reverse sequence 5′-ATTCTTGCAGAGATAGACCATGAGCGTG-3′)could identifyRf6 germplasm. Twenty-two lines includingRf6 restoring gene were selected in 197 Chinese rice micro-core collections using the above marker,and these materials would broaden restoring lines of HL hybrid rice.

HL type rice; restoring geneRf6; micro-core collections

2016-11-04

雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢大學(xué))開放課題基金項(xiàng)目；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016CFB510)

徐 雪(1992-)，女，湖北襄陽(yáng)人，在讀碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。

*通訊作者：姚國(guó)新(1977-)，男，湖北當(dāng)陽(yáng)人，副教授，博士，主要從事水稻雜種優(yōu)勢(shì)研究。E-mail:guoxiny2004@hbeu.edu.cn

S435.72

A

1004-3268(2017)02-0012-04