羊體外受精技術(shù)研究概況

豆興堂

（遼寧省畜牧科學(xué)研究院， 遼寧 遼陽 111000）

羊體外受精技術(shù)研究概況

豆興堂

（遼寧省畜牧科學(xué)研究院， 遼寧 遼陽 111000）

本文較系統(tǒng)地總結(jié)了羊體外受精技術(shù)研究狀況，包括卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精等技術(shù)環(huán)節(jié)，并提出了需要解決的技術(shù)問題。

羊；卵母細(xì)胞；精子；體外受精；胚胎

近年來，我國山羊飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展迅速，但也存在一些問題，主要表現(xiàn)在山羊良種化程度不高、世代間隔較長、遺傳改良速度較慢。優(yōu)良種公、母羊數(shù)量少難以滿足大量低產(chǎn)山羊的改良需求，而一些生物技術(shù)如母羔超排、體外受精、胚胎移植等技術(shù)可以最大限度地發(fā)揮具有優(yōu)秀生產(chǎn)性能的種公、母羊遺傳資源，滿足我國養(yǎng)羊業(yè)對良種的巨大需求。因此研究解決羊體外受精等重要相關(guān)技術(shù)瓶頸就成為迫切任務(wù)之一。

哺乳動物體外受精研究已經(jīng)有幾十年的歷史，已相繼在130余種哺乳動物上獲得成功[1]。1985年Hanada等[2]在世界上首次實(shí)現(xiàn)山羊體外受精。1990年我國錢菊汾等[3]成功獲得一只“試管山羊”。1996年劉東軍等[4]經(jīng)體外受精胚胎移植得到了“試管山羊”。2004年王公金[5]等經(jīng)過胚胎移植成功產(chǎn)下了“試管山羊”。成國祥等[6]用超排山羊卵巢排卵后第1天的98枚卵巢卵母細(xì)胞，體外成熟體外受精卵裂率為21.43%，21枚2細(xì)胞胚移植5頭受體，獲2只羔羊。大量研究證明，經(jīng)體外受精技術(shù)生產(chǎn)的胚胎，通過胚胎移植給代孕受體羊完全可以正常生產(chǎn)羔羊。

1 卵母細(xì)胞獲取與體外成熟

1.1 卵母細(xì)胞的獲取方法

主要有離體采集和活體采集。離體采集利用卵母細(xì)胞數(shù)有限，不可重復(fù)使用，且其種質(zhì)一般都相對較差。活體采集能獲得大量種質(zhì)優(yōu)良山羊的卵母細(xì)胞用于體外受精生產(chǎn)胚胎，可反復(fù)進(jìn)行且對供體山羊的生產(chǎn)性能和生殖機(jī)能無不良影響。因此，活體采卵技術(shù)成為體外受精一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。

活體采卵有手術(shù)法、B型超聲波法和腹腔鏡法。手術(shù)法采集卵母細(xì)胞操作簡便，容易觀察卵巢情況，回收率較高。許杰等[7]研究表明，抽吸法得到的平均卵母細(xì)胞數(shù)最多，刺破法較為適合回收山羊的卵巢卵母細(xì)胞。

腹腔鏡法隨著體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，近些年逐漸得到應(yīng)用。Berlinguera等[8]報道了LOPU采集卵母細(xì)胞的操作方法，可以參照操作。Graft等[9]認(rèn)為，腹腔鏡活體采卵技術(shù)容易觀察卵泡，在抽卵時可以對卵巢頻繁地進(jìn)行沖洗，可能會減少粘連的發(fā)生。

B型超聲波法。1987年Callesen等[10]首先報道了B超應(yīng)用于卵母細(xì)胞采集。Graft等[9]報道了此技術(shù)在羊上的具體操作方法，但可見卵泡數(shù)較少，最終獲卵數(shù)也較少。

1.2 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)

1.2.1 卵母細(xì)胞成熟

卵母細(xì)胞的成熟被稱為卵母細(xì)胞獲能。該過程包括恢復(fù)減數(shù)分裂并進(jìn)入到第2次減數(shù)分裂中期（MⅡ）的核成熟和經(jīng)歷一系列復(fù)雜生理生化變化的細(xì)胞質(zhì)成熟[3]。卵母細(xì)胞成熟過程中細(xì)胞核發(fā)生生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdow，GVBD）、染色質(zhì)濃縮和排出第1極體等一系列形態(tài)學(xué)的變化，當(dāng)減數(shù)分裂完成時，標(biāo)志著卵母細(xì)胞核的成熟。人工采集的卵母細(xì)胞大都完成了生長，進(jìn)入成熟期，其經(jīng)歷了第2次減數(shù)分裂間期而達(dá)到中期（MⅡ）[2]。卵母細(xì)胞體外成熟是以卵丘細(xì)胞擴(kuò)張、第1極體排出作為形態(tài)上的標(biāo)志。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)是以 GVBD 為判斷標(biāo)準(zhǔn)的，第1極體的排放是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志[11]。

1.2.2 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)主要因素

1.2.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)液

卵母細(xì)胞體外成熟基礎(chǔ)液有TCM199、Ham’s F-12、Menezo’s B2、NUSC23和MEM等，以TCM199應(yīng)用最為廣泛。劉靈等[12]研究表明，TCM199和Ham’s F-12都是山羊卵母細(xì)胞體外成熟合適的培養(yǎng)基。林峰等[13]以TCM199為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加10 IU/mL PMSG、10 IU/mL hCG和FCS等體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞，結(jié)果15% FCS組卵母細(xì)胞成熟率為67 %。

1.2.2.2 培養(yǎng)環(huán)境條件系統(tǒng)

溫度對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)有很大影響。研究表明，一般家畜的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)溫度均采用38～39℃，5% CO2空氣、飽和濕度[14]。氣相環(huán)境中的CO2濃度由于目前培養(yǎng)液中NaHCO3濃度多為25～30 mmol/L，故一般都采用5%的CO2。另有氣相環(huán)境為：5%CO2、5%O2、90%N2。但Azambujaa等[15]研究結(jié)果表明，5%CO2、5%O2、90%N2下成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞，桑椹胚和囊胚發(fā)育率明顯低于含5%CO2的空氣。一般采用微滴培養(yǎng)和四孔板培養(yǎng)。

1.2.2.3 激素

卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中常用的激素有FSH、LH、E2等。王海濱等[16]研究認(rèn)為，體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞時必須添加FSH，F(xiàn)SH維持顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間的聯(lián)系，有利于卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。Kobayashi等[17]研究結(jié)果表明，LH或hCG可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟分裂能力的恢復(fù)。Zuelke等[18]證實(shí)，在無血清時LH用于體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟，能提高卵母細(xì)胞成熟后的胚胎發(fā)育能力。雌二醇（E2）可促進(jìn)卵母細(xì)胞在體外成熟過程中受精和胚胎發(fā)育。劉靈等[12]研究表明，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加1 μg/mL E2，成熟率（79.4 %）顯著高于對照組（55.6 %），說明成熟液添加E2對其成熟是有益的。因此E2目前被廣泛用于卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)。

1.2.2.4 血清

卵母細(xì)胞體外成熟液通常都添加血清。常用的血清有FCS、OCS和SS，眾多研究結(jié)果表明，以FCS效果最好。Sanbusissho和Threlfall[19]比較了不同發(fā)情階段母牛血清，結(jié)果表明，發(fā)情盛期的母牛血清要優(yōu)于其他發(fā)情周期階段的血清。張涌等[20]研究結(jié)果表明，卵母細(xì)胞體外成熟同種動物的血清要優(yōu)于異種動物血清。血清成分較為復(fù)雜，效果不夠穩(wěn)定，因此近年開展許多血清替代物研究，可能是卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)一種方向。

1.2.2.5 生長因子

EGF是一種單鏈的多肽，對顆粒細(xì)胞等多種細(xì)胞具有促進(jìn)分裂的作用。王艾平等[21]研究結(jié)果表明，EGF對山羊COCs體外成熟和卵裂發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用，成熟液中EGF優(yōu)選濃度為50 μg/mL，COCs成熟率(75.45 %～75.18 %)和卵裂率(72.4%～74.1%)均顯著高于其它組。劉丑生等[22]研究EGF對綿羊卵母細(xì)胞成熟及卵裂的影響表明，50 μg/mL的EGF的成熟率和卵裂率分別為71.2%和45.5%，顯著高于對照組與其他組；當(dāng)EGF濃度達(dá)到100 μg/mL時成熟率和卵裂率最高，分別為72.9 %和45.7 %。羊卵母細(xì)胞成熟液中的常用量為10～50 ng/mL。

1.2.2.6 其他

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時間，山羊一般為24～26 h，不同動物其培養(yǎng)時間不同。劉靈等[12]研究表明，山羊卵母細(xì)胞成熟24 h、25 h和26 h，成熟率為（78.3 %、80.0 %和80.6 %）沒有差異。李穎等[23]研究了結(jié)果表明，山羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)20 h、22 h、24 h,成熟率顯著高于培養(yǎng)18 h、26 h、,30 h（P<0.05）。王超[24]研究顯示，山羊卵母細(xì)胞37℃ 下的成熟率顯著低于38.5℃、39.0℃下的成熟率，培養(yǎng)24 h和培養(yǎng)26 h的成熟率極顯著高于培養(yǎng)18 h和20 h。卵母細(xì)胞的成熟潛力還與采卵季節(jié)相關(guān)，繁殖季節(jié)獲取的卵母細(xì)胞成熟率較高。

2 精子獲能與體外受精

2.1 精子獲能

精子體外獲能處理是體外受精技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。Austin發(fā)現(xiàn)并定義了哺乳動物精子獲能（Capacitation）現(xiàn)象?，F(xiàn)已弄清精子在體內(nèi)的獲能過程如下：哺乳動物生殖道內(nèi)的獲能因子中和精子表面的去能因子，并促使精子質(zhì)膜的膽固醇外流，導(dǎo)致膜的通透性增加。而后Ca2+進(jìn)入精子內(nèi)部，激活腺苷酸環(huán)化酶，抑制磷酸二酯酶，誘發(fā)cAMP的濃度升高，進(jìn)而導(dǎo)致膜蛋白重新分布，膜的穩(wěn)定性進(jìn)一步下降，精子的獲能即完成[3]。因此，可以通過脫除精子被膜蛋白，增加通透性和Ca2+內(nèi)流的處理方法誘發(fā)精子獲能。

2.2 精子獲能處理方法

精子體外獲能方法可分為兩步，首先是精子洗滌，篩選活精子；其次進(jìn)行精子獲能處理。

精子經(jīng)一次或多次離心后除去雜質(zhì)、死精子、凍精保護(hù)液及稀釋液等，從而篩選活力好的精子。懸浮法是篩選高活力精子最為有效的一種方法。Parrish等[25]首次采用懸浮法分離牛的精子進(jìn)行體外受精，結(jié)果表明，可使受精率由46%提高到59%。Purvis和Egdetveit[26]研究表明，如將懸浮的試管傾斜30°，則能提高精子的可利用數(shù)量50 %～100 %。山羊多用mDM液和不含BSA的BO液。

其次進(jìn)行精子的獲能處理。主要使用鈣離子載體、肝素和BSA等，以促使Ca2+進(jìn)入精子頂體，并刺激精子內(nèi)部pH升高，從而誘發(fā)精子獲能。

鈣離子載體A23187獲能處理。馬恒東等[27]研究表明，鈣離子載體的添加量在0.3 μmol/L時，利用去透明帶金黃地鼠卵穿卵試驗(yàn)，穿透率達(dá)到68.2%；咖啡因與肝素、鈣離子載體具有明顯的協(xié)同作用。將獲能的精子與山羊卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精孵育17 h，也獲得了60%以上的受精率。葉華虎等[28]比較不同獲能誘導(dǎo)劑對山羊精子體外獲能及受精能力的影響，結(jié)果表明，0.1 μmol/L， 0.4 μmol/L，0.7 μmol/L IA均能提高精子獲能率，其中0.4 μmol/L處理組精子獲能率最高為56.2%；IA組的卵裂率明顯高于肝素組(P<0.05)，IA表現(xiàn)出更強(qiáng)的促卵裂發(fā)生效果。

肝素獲能處理。大多數(shù)研究者體外受精中肝素的濃度為10～50 μg/mL。錢紅娟等[29]認(rèn)為，用肝素誘導(dǎo)山羊精子體外獲能10 Lg/mL的濃度最有利。呂麗華等[30]山羊卵母細(xì)胞體外受精的研究表明，肝素（50 μg/mL）組和鈣離子載體（0.1 μmol/mL）組受精率分別為56.0%和67.0%，顯著高于咖啡因（10 mmol/L）組的21.0%；肝素組卵裂率（51.1%）顯著高于鈣離子載體組（36.3%）和咖啡因組（19.0%）；囊胚率肝素組（17.8%）與鈣離子載體組（11.7%）差異不顯著，表明肝素處理精子獲能受精比較穩(wěn)定。

精子獲能檢測。近年來，Moller[31]和Aarons[32,33]等報道采用考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色法來檢測小鼠精子頂體反應(yīng)。CBB G250是常用的蛋白染料，它對頂體膜或頂體內(nèi)含物具有特異親和性。AR發(fā)生后，頂體內(nèi)的蛋白酶流失，CBB G250結(jié)合量明顯減低，因而頂體著色較淡。反之，未發(fā)生AR的精子，頂體著色較深。江一平等[34]通過用3.5%高氯酸水溶液配制0.05%考馬斯亮藍(lán)(R250)染色液浸染人精子30 min，頂體完整者頂體區(qū)染成紫藍(lán)色，頂體反應(yīng)者則不染。建立了一種檢測人精子頂體反應(yīng)的簡便實(shí)用新技術(shù)，方法學(xué)檢驗(yàn)證明新技術(shù)結(jié)果可靠。卓丹心等[35]在先前報道[32]基礎(chǔ)上，將CBB液加以改良建立了一種哺乳動物精子AR檢測較通用簡便的技術(shù)。研究結(jié)果表明，經(jīng)CBB染色后，頭部呈現(xiàn)出兩種類型染色特征———A型和B型。A型未獲能精子頂體區(qū)成紫藍(lán)色，頂體后區(qū)淺紫色；B型獲能精子頂體區(qū)不染色或染淺紫色，頂體后區(qū)與A型相似。經(jīng)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，CBB染色批內(nèi)變異系數(shù)低，說明可重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可用于AR的檢測實(shí)驗(yàn)。葉華虎等[36]的研究證實(shí)，考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色技術(shù)可用于哺乳動物精子頂體狀態(tài)的準(zhǔn)確評價。陸海一等[37]也驗(yàn)證了CBB染色技術(shù)可作為檢測人精子形態(tài)和頂體反應(yīng)的可靠而實(shí)用的方法。與傳統(tǒng)的瑞-吉染色法相比，CBB-G250染色法不僅操作簡單、試劑配制方便，而且染色時間較短、不受染液pH的影響。

2.3 精子與卵母細(xì)胞體外受精方法

2.3.1 體外受精系統(tǒng)

卵母細(xì)胞體外受精培養(yǎng)系統(tǒng)主要有微滴法和四孔培養(yǎng)板法。微滴法是一種應(yīng)用最廣的培養(yǎng)系統(tǒng)。該法的優(yōu)點(diǎn)是受精液及精液的用量均較少，體外受精的效果亦較好。四孔板培養(yǎng)法是采用四孔板為體外受精器皿，每孔加入500 μL受精液和100～150枚體外成熟的卵母細(xì)胞，然后加入獲能處理的精子，在培養(yǎng)箱中孵育20～24 h。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作相對比較簡單，受精結(jié)果不受石蠟油質(zhì)量的影響。精卵體外受精一般在38.5℃、5%CO2的空氣、飽和濕度下進(jìn)行。

2.3.2 受精體系

用于體外受精的基礎(chǔ)液通常為SOF液、TALP液和BO液，主要成分為無機(jī)鹽離子，不含復(fù)雜的氨基酸和維生素等成分。張鎖鏈等[38]用BO液將精液稀釋、離心洗滌后，用含有20 mg/ mL BSA(Sigma)和5 mg/mL肝素調(diào)整精子密度為（20～30）×106個/mL，用精子懸浮液做成微小滴，將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞移入該微小滴中進(jìn)行受精處理6 h后，將卵子移入以TCM199為基礎(chǔ)液的發(fā)育用培養(yǎng)液中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，卵裂率為40%～49.6%，囊胚率為15.8%～18.8%。劉新峰等[39]對不同受精液對山羊卵母細(xì)胞體外受精的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，BO液的受精率（62.2%）顯著高于TCM199液（44.7%），且卵裂率（21.6%）顯著高于TALP液（9.1%），極顯著高于TCM199（0.0%）。武建朝[40]對比了BO液和TALP液受精結(jié)果，表明TALP受精液受精率和卵裂率顯著高于BO液（55.88% : 33.33%，42.11% : 30.00%），但桑堪胚、囊胚率差異不顯著。說明TALP液比BO液更適合性成熟前山羊卵母細(xì)胞的體外受精。近年來，出現(xiàn)了將SOF液用于體外受精的受精液。陳曉勇[41]以SOF液為基礎(chǔ)液，比較了羔山羊卵母細(xì)胞與成年山羊卵母細(xì)胞體外受精與胚胎發(fā)育能力，結(jié)果顯示，羔羊卵母細(xì)胞在卵裂率（59.0%）和桑椹胚率（17.4%）方面都極顯著性低于成年羊卵裂率（82.4%）和桑椹胚率（46.4%）。

2.3.3 精卵作用時間

精卵作用時間對體外受精的效果非常重要，過短不足以保證受精率，過長又容易引起多精入卵。同時精卵孵育時間也受受精液中輔助獲能物質(zhì)的影響。精卵孵育作用時間也依受精液而不同，BO受精液[42]精卵作用6～8 h，TALP受精液精卵作用18～20 h，SOF受精液精卵作用22～24 h。

2.3.4 其他

體外受精效果還受精卵比率、溫度、水質(zhì)等因素的影響。精子濃度若過高易引起多精入卵，若過低又影響受精率，通常適宜體外受精的精子濃度為（1.0～1.5）×106個/mL，精卵比率為10 000～20 000∶1。溫度對體外受精效果有很大影響。戴榮亮[11]研究結(jié)果顯示，在37℃、38℃和39℃下，卵母細(xì)胞成熟率及其受精率差異不顯著，但39℃下的受精率（14.7%）高于 38℃（13.4%）和 40℃（12.8%）受精率。水質(zhì)是體外受精的一個重要影響因素，對體外受精的成功與否至關(guān)重要。水質(zhì)量對IVF有明顯影響，配制受精液的水應(yīng)該為超純水，是通過離子交換柱去除水中雜質(zhì)和離子，水在配制前應(yīng)經(jīng)過高溫高壓滅菌。陳曉勇等[43]研究表明，小尾寒羊胚胎發(fā)育液中添加10 μmol/L EDTA，16細(xì)胞以上胚胎率（100%）極顯著高于對照組（46.97%）。

3 早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)

體外受精的早期胚胎發(fā)育存在阻斷現(xiàn)象，并不是都能發(fā)育至囊胚階段。近些年，通過改善體外培養(yǎng)條件，胚胎體外發(fā)育的能力有所提高。體外受精胚胎體外培養(yǎng)液主要有：復(fù)雜的培養(yǎng)液（TCM199等）和成分明確的培養(yǎng)液（SOF、CR1等）?；境煞种饕o機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物、抗生素、能量底物和蛋白質(zhì)等。呂麗華[44]研究山羊胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果表明，顆粒細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)胚胎條件下，體外受精胚胎的卵裂率分別為 46.3%和40.8%，顯著高于無共培養(yǎng)體系組 28.1%；發(fā)育到 8～16細(xì)胞的胚胎比率分別為 49.1%和45.0%，極顯著高于無共培養(yǎng)組 5.7%；囊胚數(shù)比率分別為 17.6%、20.0%，極顯著高于對照組；前48 h SOF+BSA后48 h SOF+FCS胚胎培養(yǎng)液更能促進(jìn)胚胎發(fā)育（囊胚率34.7%）。王艾平等[21]向胚胎培養(yǎng)液中添加亞硫磺酸(HTAU) 研究其對山羊體外胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果顯示，亞硫磺酸有益于早期胚胎的體外發(fā)育，胚胎培養(yǎng)液中HTAU的優(yōu)選濃度為0.5 mmol/L。張家新等[45]比較了非必需氨基酸（NEAA）、必需氨基酸（EAA）對綿羊體外胚胎的發(fā)育。結(jié)果表明，胚胎培養(yǎng)液單獨(dú)添加NEAA可明顯提高綿羊胚胎的囊胚發(fā)育率；單獨(dú)添加EAA對綿羊桑椹期前的胚胎發(fā)育沒有促進(jìn)作用，但可以促進(jìn)囊胚孵化；0.5×EAA+1×NEAA組合的囊胚率和囊胚孵化率最高，分別為44%和33%。武建朝[40]比較了性成熟前山羊受精卵CR1aa和SOFaa胚胎發(fā)育體系，結(jié)果表明SOFaa培養(yǎng)系統(tǒng)的卵裂率和桑椹胚囊胚率顯著高于CR1aa培養(yǎng)系統(tǒng)（42% :35.56%，12% : 5.71%）。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過改進(jìn)胚胎培養(yǎng)液、培養(yǎng)方法，已大幅提高了胚胎體外發(fā)育能力。

4 結(jié)語

經(jīng)過科研人員大量的試驗(yàn)研究，目前體外受精率有所提高，但對部分卵母細(xì)胞和早期胚胎的發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)理不是很清楚，卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟是否真正成熟，其影響到受精和胚胎的發(fā)育；精卵受精過程中，不正常受精情況；受精卵發(fā)育阻斷及胚胎持續(xù)發(fā)育能力等都是制約體外受精技術(shù)真正實(shí)現(xiàn)推廣應(yīng)用的瓶頸?？傊?，山羊IVF技術(shù)研究已經(jīng)取得了重大的進(jìn)步，還需進(jìn)一步深入研究IVM、精子處理、IVF、IVC等相關(guān)技術(shù)環(huán)節(jié)，明確其互相影響機(jī)制，優(yōu)化集成技術(shù)，才能使其真正走向養(yǎng)殖業(yè)的推廣應(yīng)用領(lǐng)域。

5 參考文獻(xiàn)

[1]陳大元.受精生物學(xué)-受精機(jī)制與生殖工程[M].北京： 科學(xué)出版社, 2000.

[2]李青旺.動物細(xì)胞工程與實(shí)踐[M].北京： 化工工業(yè)出版社, 2005, 55.

[3]桑潤滋.動物繁殖生物技術(shù)[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2004, 262-263.

[4]劉東軍, 張鎖鏈, 王建國, 等.不同超數(shù)排卵方法所獲羔山羊卵母細(xì)胞體外成熟率及體外受精率的比較[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 1996, 27(5)：422-427.

[5]王公金, 季尚娟, 徐曉波, 等.波爾山羊活體采卵與卵母細(xì)胞體外受精技術(shù)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2004, 20(3)： 154-158.

[6]成國祥, 王玉閣, 成勇, 等.超排山羊卵巢卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精的研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報, 1997, 17(1)： 57-60.

[7]許 杰.山羊卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精及受精卵培養(yǎng)的研究[D].四川雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 2005.

[8]Berlinguera F, Leonia G, Bogliolob L, et al.FSH different regimes affect the developmental capacity and oryotolerance of embryos derived from oocytes collected by ovum pick-up in donor sheep[J].Theriogenology, 2004, 61： 1477-1486.

[9]Graft K J, Meintjes M, Dyer V W, et al.Ransvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval following FSH stimulation of domestic goats[J].Thoriogenology, 1999, 51 ：1099-1119.

[10]Callesen H, Greve T, Chrestenson R, et al.Ultrasonically guided aspiration of bovine follicular oocytes[J].Theriogenology, 1987, 27：127.

[11]戴榮亮.山羊卵母細(xì)胞體外成熟以及體外受精的研究[D].揚(yáng)州： 揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 2006.

[12]劉靈, 張勇, 錢菊芬.山羊卵巢卵母細(xì)胞的體外成熟[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1992, 20(增刊)：107-110.

[13]林 峰, 史明艷, 陳玉霞, 等.山羊卵泡卵母細(xì)胞的采集及體外成熟效果研究[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué), 2007, 23(11)： 12 - 15.

[14]秦鵬春 編著.哺乳動物胚胎學(xué)[M].北京： 科學(xué)出版社, 2001, 4.

[15]Azambuja RM, et al.Effect of gas atmosphere on in vitro maturation of bovine oocytes.Theriogenology, 1993, 39： 184.

[16]王海濱, 夏國良, 李美玲.哺乳動物卵母細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2000, 8(3)： 297-310.

[17]Kobayashi Y, et al.Ovulation and ovum maturation in the rabbit ovary perfused in vitro.Biol.Reprod., 1981, 24： 483-490.

[18]Zuelke K T, Brackett B G.Luteinizing hormoneenhanced in vitro maturation of bovine oocytes with and without protein supplementation.Biol.Reprod., 1990, 43： 784-787.

[19]Sanbusissho A, Threlfall W R.The effects of estrous cow serum on the in vitro maturation and fertilization of the bovine follicular oocyte in vitro[J].Theriogenology, 1989, 31： 300-309.

[20]張 涌, 劉素娟, 李裕強(qiáng),等.山羊大腔卵泡卵母細(xì)胞的體外成熟和體外受精[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 21(1)： 45～48.

[21]王艾平, 魏 泓, 孫新民, 等.表皮生長因子、巰基乙醇和亞硫磺酸對山羊體外胚胎生產(chǎn)的影響研究[J].中國草食動物, 2005, 25(1)： 3-6.

[22]劉丑生, 陸會寧, 張利平, 等.EGF和IGF-I對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟和卵裂的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2008, 39(5)： 588-593.

[23]李穎, 金世英, 張樹軍, 等.山羊卵泡卵母細(xì)胞體外成熟的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報, 2006, 21(5)： 83-86.

[24]王 超, 郝澤東.不同培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時問和溫度對山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2007, 16(2)： 7-9.

[25]Parrish JJ, et al.Effect of swim-up separation and heparin pretreatment of frozen-thawed spermatozoa on in vitro fertilization of bovine oocytes.Biol.Reprod., 1984, 30(Suppl.1)： 112.

[26]Purvis K and Egdetveit I.Factors affecting sperm yield during swim-up.Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 1993, 10： 145-150.

[27]馬恒東, 梁 鑫.肝素和鈣離子載體誘導(dǎo)波爾山羊精子體外獲能和體外受精[J].中國獸醫(yī)學(xué)報, 2006, 26(6)： 701-703.

[28]葉華虎, 李福兵, 陳俊穎, 等.不同誘導(dǎo)劑對山羊精子體外獲能和受精能力的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報, 2005, 20(6)： 46-50.

[29]錢紅娟, 周敏敏, 熊 偉, 等.肝素對山羊精子體外獲能的影響[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2008, 1： 38-39.

[30]呂麗華, 任有蛇, 李富忠, 等.山羊卵母細(xì)胞體外受精方法的研究[J].畜牧與獸醫(yī), 2009, 41(5)： 53-55.

[31]Moller CC, Bleil JD, Kinloch RA.et al.Structural and functional relationships between mouse and hamster zone pellucid glycoproteins.Dev Biol, 1990;137： 276.

[32]Aarons D, Boettger-Tong H, Holt G.et al.Acrosome reaction induced by immunoaggregation of a proteins inhibitor bound to the murine sperm head.Mol Reprod Dev, 1991; 30： 258.

[33]Aarons D, Battle T, Boettger-Tong H.et al.Role of monoclonal antibody J-23 in inducing acrosome reactions in capacitated mouse spermatozoa.Jrepord Fertil, 1992; 96： 49.

[34]江一平, 卓丹心, 陳 勇, 等.考馬斯亮藍(lán)染色法檢測人精子頂體反應(yīng)的評價[J].解剖學(xué)報, 1998, 29： 332.

[35]卓丹心, 林典梁, 江一平.哺乳動物精子頂體反應(yīng)檢測考馬斯亮藍(lán)染色法[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 1999, 33(3)： 346-348.

[36]葉華虎, 茍本富, 劉盧生, 等.考馬斯亮藍(lán)染色評價哺乳動物精子頂體反應(yīng)發(fā)生的效果[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2003, 25(7) ：586-587.

[37]陸海一, 陸金春, 胡毓安, 等.考馬斯亮藍(lán)染色法檢測人精子形態(tài)和頂體反應(yīng)[J].中華男科學(xué), 2002, 8(3)： 204-206.

[38]張鎖鏈, 劉東軍, 王建國, 等.通過體外受精技術(shù)縮短絨山羊育種周期的研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）, 1998, 29(1)： 114-117.

[39]劉新峰, 郝志明, 史遠(yuǎn)剛, 等.不同激素添加成分和受精液對山羊卵巢卵母細(xì)胞體外成熟與受精的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008, 30(4)： 710-714.

[40]武建朝.利用性成熟前山羊卵泡卵母細(xì)胞體外生產(chǎn)胚胎的研究[D].南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[41]陳曉勇.誘導(dǎo)幼羔卵泡發(fā)育及體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)研究[D].保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[42]Bavister B.D.Role of oviductal secretions in embryonic growth in vitro.Theriogenology, 1988, 29： 143-154.

[43]陳曉勇, 田樹軍, 桑潤滋, 等.誘導(dǎo)幼羔卵泡發(fā)育及體外胚胎生產(chǎn)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2008, (16)3： 456-460.

[44]呂麗華.山羊胚胎體外生產(chǎn)體系的優(yōu)化以及胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)的研究[D].太谷： 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[45]張家新, 侯 健, 史洪才, 等.氨基酸對綿羊體外受精胚胎發(fā)育的影響[J].草食家畜(季刊), 2000, 108(3)： 27-30.

S814.3；S826.3

B

1005-2739（2017）01-0007-07

2016-11-03

豆興堂（1978-），男，碩士，高級

畜牧師，主要從事絨山羊繁殖育種與胚胎工程技術(shù)研究與推廣工作。E-mail：dou791120@sina.com